響應(yīng)面法優(yōu)化鹽膚木總鞣質(zhì)回流提取工藝*

葉永華 ，楊 玲 ，徐 偉 ，連 紅 ，許 文 ，葉 淼 ，鄭海音

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院·生物醫(yī)藥研發(fā)中心，福建 福州 350122； 2.福州海王金象中藥制藥有限公司，福建 福州 350014； 3.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122）

鹽膚木RhuschinensisMills.為漆樹科Anacardiaceae鹽膚木屬Rhus落葉小喬木［1］，其葉上的蟲癭稱為五倍子，主要由五倍子蚜Melaphis chinese（Bell）Baker寄生而形成［2］。五倍子具有斂肺降火、澀腸止瀉、固精縮尿等功效，臨床用于治療肺虛久咳、肺熱痰嗽、久瀉久痢、自汗盜汗、消渴、便血痔血、外傷出血、癰腫瘡毒、皮膚濕爛等，其主要藥效物質(zhì)為鞣質(zhì)類成分等。鞣質(zhì)是一類具有沉淀蛋白質(zhì)特性的多元酚類化合物［3］，存在于很多植物，具有顯著清除自由基及抗腫瘤等藥理作用［4］。陳丹妮等［5］利用響應(yīng)面法優(yōu)化了五倍子中鞣質(zhì)的提取工藝，但鹽膚木中產(chǎn)生蟲癭的量很少，即從鹽膚木蟲癭即五倍子中獲得活性鞣質(zhì)，難以滿足現(xiàn)代中藥業(yè)的需求。本課題組前期開展了鹽膚木藥材的化學(xué)成分研究［6］，發(fā)現(xiàn)鹽膚木根中也富含與五倍子一致的鞣質(zhì)類成分，同時現(xiàn)代化學(xué)研究也表明鹽膚木藥材和其蟲癭一樣，含有相同的鞣質(zhì)類成分［7-10］，對于鹽膚木的提取工藝研究僅有針對黃酮類成分的方法［11-12］，對鞣質(zhì)提取工藝的研究鮮有報(bào)道。因此，本研究中在單因素考察基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)優(yōu)化鹽膚木總鞣質(zhì)的提取工藝，為鹽膚木總鞣質(zhì)的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

儀器：UV-1800型可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；CPA225D型天平（十萬分之一，德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FY135型中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）。

試藥：鹽膚木（安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司，批號為15122201），經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)范世明高級實(shí)驗(yàn)師鑒定為鹽膚木Rhus chinensisMills.的干燥根，標(biāo)本（編號為YFM20151003）存放于福建中醫(yī)藥大學(xué)生物醫(yī)藥研發(fā)中心標(biāo)本室；沒食子酸（純度≥90.8%，中國食品藥品檢定研究院，批號為110831-201605）；碳酸鈉、磷鉬鎢酸、乙醇均為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

取沒食子酸對照品12.5 mg，精密稱定，置25 mL棕色容量瓶中，加水充分溶解，稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL置50 mL容量瓶中，并加水定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.05 g／L對照品溶液。

2.2 含量測定方法

鞣質(zhì)含量＝總酚酸含量-不被吸附的多酚含量［13］。

總酚酸含量測定：精密量取供試品溶液1.0 mL，置25 mL棕色容量瓶中，加入磷鉬鎢酸試液1.0 mL、水11.0 mL，用 29.0%Na2CO3溶液稀釋至刻度，搖勻，放置35 min，以相應(yīng)試劑為空白，按紫外-可見分光光度法在760 nm波長處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。

不被吸附的多酚含量測定方法：精密量取供試品溶液3.0 mL，置于已加入0.6 g干酪素的具塞錐形瓶中，加水，補(bǔ)足體積至100.0 mL，密塞，于30℃水浴中保溫1 h，實(shí)時振搖，于最后10 min靜置，取出，放冷，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液3.0 mL，依法測定總酚酸的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算不被吸附的多酚含量。

取干酪素0.6 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入100.0 mL水，同法制備空白溶液，進(jìn)行干酪素空白干擾試驗(yàn)。

2.3 線性關(guān)系考察

精密量取沒食子酸對照品溶液 0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分別置 25 mL 棕色容量瓶中，分別加入磷鉬鎢酸溶液 1.0 mL，再分別加水 11.5，11.0，10.0，9.0，8.0，7.0 mL，最后分別用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置35 min，以同樣處理試劑為空白顯色體系，在760 nm波長處測定吸光度。以吸光度（Y）對質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程Y＝89.83X+0.021，r＝0.999 9（n＝6）。結(jié)果表明，沒食子酸質(zhì)量濃度在 1.0 ～10.0 μg／mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.4 提取工藝單因素考察

評價(jià)指標(biāo)：以總鞣質(zhì)提取率為評價(jià)指標(biāo)考察，總鞣質(zhì)提取率＝總鞣質(zhì)含量（mg）／藥材質(zhì)量（g）×100%。

乙醇提取濃度：精密稱取鹽膚木粉末5.0 g，置錐形瓶中，提取液料比20∶1，乙醇提取溶劑比例分別設(shè)為40%，50%，60%，70%，80%，浸漬 30 min，回流提取 1 h，按2.2項(xiàng)下方法測定總鞣質(zhì)含量，結(jié)果見圖1 A。乙醇濃度在40%～60%，總鞣質(zhì)提取率與乙醇提取濃度呈正相關(guān)，但超過60%乙醇濃度后，總鞣質(zhì)提取率反而下降。初步確定乙醇提取濃度為50% ～70%。

提取溫度：精密稱取鹽膚木粉末5.0 g，置錐形瓶中，加入20倍量60%乙醇提取溶劑，提取溫度分別設(shè)置為 40，50，60，70，80 ℃，浸漬 30 min，分別提取 1 h，按2.2項(xiàng)下方法測定總鞣質(zhì)含量，結(jié)果見圖1 B。40～70℃時，總鞣質(zhì)提取率隨溫度的升高而升高，但超過70℃后，提取率反而下降。初步確定提取溫度為60～80℃。

液料比：取鹽膚木粉末5.0g，精密稱定，置錐形瓶中，分別加入 5，10，15，20，25 倍量的 60%乙醇浸漬 30 min，回流提取1 h，按2.2項(xiàng)下方法測定鹽膚木中總鞣質(zhì)的含量，結(jié)果見圖1 C。隨著液料比的增大，總鞣質(zhì)的提取率亦逐漸增大，液料比超過20∶1后，總鞣質(zhì)的提取率基本趨于穩(wěn)定。因此選擇液料比為15∶1～25∶1。

圖1 提取影響因素考察結(jié)果

提取時間：取鹽膚木粉末5.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，加入20倍量的60%乙醇，浸漬30 min后，回流提取時間分別設(shè)置為 30，60，90，120，150 min，按 2.2 項(xiàng)下測定總鞣質(zhì)含量，結(jié)果見圖1 D。隨著提取時間的延長，總鞣質(zhì)提取率逐漸上升，提取時間超過120 min后提取率略有下降。因此，選擇提取時間為60～120 min。

回流提取次數(shù)：取鹽膚木粉末5.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，加入20倍量的60%乙醇，浸漬30 min，回流提取 1 h，提取 1，2，3次，按 2.2項(xiàng)下方法測定提取液中總酚酸含量，結(jié)果見圖1 E。隨著提取次數(shù)的增加，總鞣質(zhì)提取率逐漸降低，提取3次后已提取完全。為了節(jié)省試劑、時間等，確定提取次數(shù)為2次。

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.5.1 因素水平確定

根據(jù)Box-Benhnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，在單因素考察基礎(chǔ)上，以乙醇濃度（因素A）、料液比（因素B）、提取溫度（因素C）、提取時間（因素D）為自變量，以鹽膚木總鞣質(zhì)提取率（Y）為響應(yīng)值進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)［5］。確定各單因素對于鹽膚木中總鞣質(zhì)提取的顯著性及各因素的最佳提取條件，其因素水平見表1。

表1 因素水平表

2.5.2 響應(yīng)面分析與提取工藝優(yōu)化

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以總鞣質(zhì)為指標(biāo)，以乙醇提取濃度（因素A）、液料比（因素B）、提取溫度（因素C）及提取時間（因素D）為考察因素，結(jié)果見表2。

采用Design-Expert8.0.6軟件進(jìn)行多項(xiàng)式回歸擬合，建立多元二次響應(yīng)面回歸模型：Y＝2.08-1.000E-002A+0.034B-0.021C+0.018D-0.047AC+0.022BC-0.067CD-0.017A2-0.041B2-0.039C2-0.10D2。因素的 ANOVA 分析見表 3。可見，F(xiàn)模擬＝21.89，且P＜0.000 1，表明該模型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，方程與實(shí)際的擬合情況相符；失擬項(xiàng)P＝0.057 4，提示失擬檢測無顯著性，表明未知因素對試驗(yàn)的干擾較小；模型擬合相關(guān)系數(shù)R2＝0.934 1，表明模型可信度較好，該模型可應(yīng)用于分析和預(yù)測提取工藝參數(shù)。

擬合回歸方程各項(xiàng)方差分析結(jié)果表明，對于響應(yīng)值Y，因素一次項(xiàng) B，C，D，交互項(xiàng) AC，CD，二次項(xiàng) B2，C2，D2都對總鞣質(zhì)提取率的影響顯著，其余均無顯著性，提示各影響因素與提取率之間并非簡單的線性關(guān)系。由表3可見，單因素A，B，C，D的F值大小分別為2.28，26.57，9.88，7.65，提示單因素對提取率的影響順序?yàn)锽＞C＞D＞A。

表2 鹽膚木總鞣質(zhì)的提取工藝Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)結(jié)果

表3 回歸方程的顯著性檢驗(yàn)及方差分析

響應(yīng)面分析的等高線圖和響應(yīng)面圖見圖2，根據(jù)擬合模型方程可知，只有AC和CD會有相互影響，各圖為因素A～D中任意2個變量取零水平時，其余2個變量對鹽膚木總鞣質(zhì)提取率的影響，可更直觀地體現(xiàn)2個因素對提取的影響。

圖2 等高線及響應(yīng)面圖

由圖2 A可知，在因素C較小時，隨著因素A的變大，曲面變化較快，表明在因素C較小時，隨著因素A的增加，總鞣質(zhì)的提取率增加。在因素C較大時，隨著因素A的增大，總鞣質(zhì)提取率增加，同時出現(xiàn)了最高點(diǎn)，之后總鞣質(zhì)提取率降低；由圖2 B可知，在因素C較小時，隨著因素B的變大，曲面變化較平緩，表明在因素C較小時，隨著因素B的增加，總鞣質(zhì)的提取率增加較慢。而在因素C較大，隨著因素A的增大，總鞣質(zhì)提取率增大，同時出現(xiàn)了最高點(diǎn)，之后總鞣質(zhì)提取率降低；由圖2 C可知，在因素C較小時，隨著因素D的變大，曲面變化較快，表明在因素C較小時，隨著因素D的增加，總鞣質(zhì)的提取率增加較快。在因素C較大時，隨著因素A的增大，總鞣質(zhì)提取率增大，同時出現(xiàn)了最高點(diǎn)?？梢姡煌蛩刂g的交互作用對鹽膚木中總鞣質(zhì)的提取有很大影響。

2.5.3 最佳試驗(yàn)條件的預(yù)測與驗(yàn)證

用Design-Expert軟件對鹽膚木總鞣質(zhì)的提取工藝Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到的總鞣質(zhì)最佳提取條件為：因素A 70%，因素B 20.71∶1，因素C 60℃，因素D 72.57 min，鹽膚木中總鞣質(zhì)提取率的預(yù)測值為2.10%。根據(jù)優(yōu)選的提取工藝結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，平行驗(yàn)證3次，鹽膚木中總鞣質(zhì)提取率分別為 2.10%，2.09%，2.13%，平均值為 2.11%，RSD為1.01% （n＝3），與預(yù)測值的相對偏差為 0.474% ，表明該方法優(yōu)選的提取工藝可靠。

3 討論

本研究中以鹽膚木作為原料，首先比較了提取方法，如回流法、超聲法、溫浸法，結(jié)果表明，回流提取法的鹽膚木中總鞣質(zhì)的提取率最高，因此本試驗(yàn)采用回流提取法進(jìn)行試驗(yàn)；同時對于提取溶劑篩選，前期比較了丙酮、水、乙醇，發(fā)現(xiàn)丙酮和乙醇提取的效果接近，均高于水，鑒于丙酮屬有毒、易制毒化學(xué)試劑，故本試驗(yàn)采用乙醇作為總鞣質(zhì)的提取溶劑。

本研究中通過單因素考察提取時間、提取溫度、液料比和乙醇濃度對鹽膚木總鞣質(zhì)提取優(yōu)選的基礎(chǔ)上，通過Box-Benhnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，響應(yīng)面法分析各提取單因素對鹽膚木中總鞣質(zhì)提取率的影響，響應(yīng)面法模擬回歸方程及方差結(jié)果顯示，液料比、提取溫度、提取時間、液料比的二次方項(xiàng)、提取時間的二次方項(xiàng)、提取溫度的二次方項(xiàng)，以及乙醇濃度與提取溫度、提取溫度與提取時間的交互作用對鹽膚木中總鞣質(zhì)提取率的影響具有顯著性，表明各單因素在鹽膚木中總鞣質(zhì)的提取率存在非線性關(guān)系，即存在交互作用，各單因素影響鹽膚木總鞣質(zhì)提取的順序?yàn)榱弦罕龋咎崛r間＞提取溫度＞乙醇濃度。優(yōu)化得總鞣質(zhì)最佳提取條件為乙醇濃度（因素 A）70%，液料比（因素 B）20.71 ∶1，提取溫度（因素 C）60 ℃、提取時間（因素 D）72.57 min。該方法快速、簡單、準(zhǔn)確，為鹽膚木的總鞣質(zhì)的提取開發(fā)提供了參考。