海洋放線菌Streptomyces novaecaesareae次生代謝產(chǎn)物*

于鑫，韋霞，馮嬋，范倩，王思玉，章衛(wèi)民，張翠仙

(1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2. 華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室∥廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室∥ 廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室∥廣東省微生物研究所，廣東 廣州 510070)

海洋放線菌由于其獨(dú)特的生理和代謝功能成為海洋微生物活性天然產(chǎn)物的重要來(lái)源。海洋放線菌中鏈霉菌屬研究最廣泛，結(jié)構(gòu)類型涉及生物堿、聚酮、萜類、甾體和鹵代物聚醚等，生理活性涉及抗腫瘤、抗菌、抗瘧及寄生蟲等[1-7]。為了繼續(xù)尋找新的克服腫瘤耐藥活性次生代謝產(chǎn)物[8-10]，本課題對(duì)分離自南海沉積物中的新凱撒鏈霉菌Streptomycesnovaecaesareae次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離，共得到10個(gè)化合物，其結(jié)構(gòu)依次為環(huán)(4-羥基-L-脯-D-苯丙)二肽(1)、環(huán)(4-羥基-L-脯-L-苯丙)二肽(2)、環(huán)(4-羥基-L-脯-D-脯)二肽(3)、環(huán)(4-羥基-L-脯-L-亮)二肽(4)、環(huán)(L-脯-L苯丙)二肽(5)、環(huán)(L-亮-L-脯)二肽(6)、環(huán)(D-脯-L-亮)二肽(7)、環(huán)(8-羥基-L-脯-D-異亮)二肽(8)、N-(4-氧代戊基)-乙酰胺(9)和鄰苯二甲酸二丁酯(10)(圖1)?；衔?-9為葉立德類化合物，且1、3和7含有自然界中不常見的D構(gòu)型氨基酸。所有化合物均首次從Streptomycesnovaecaesareae中分離得。

圖1 來(lái)源于Streptomyces novaecaesareae化合物1-10Fig.1 Compounds1-10fromStreptomyces novaecaesareae

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株 放線菌Streptomycesnovaecaesareae由廣東省微生物研究所饋贈(zèng)，分離自中國(guó)南海北部(E 111°10.442′、N 18°52.730′)海底沉積物。菌種保存于廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院海洋天然藥物實(shí)驗(yàn)室(編號(hào)：線-章-SS9)。

儀器：Bruker AVANCE III HD 400型核磁共振儀器(德國(guó)Bruker公司)；AB SCIEX TripleTOFTM 5600+四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(美國(guó)AB SCIEX公司)；軌道阱高分辨液-質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)；半制備高效液相色譜(HPLC)儀器(北京慧得易科技有限公司)；MCP 200數(shù)字式旋光儀(奧地利AntonPaar公司)。LX-B75L型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋(合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司)；超凈工作臺(tái)(單人)(蘇州凈化設(shè)備廠)；HYG-A全溫?fù)u瓶柜(太倉(cāng)市試驗(yàn)設(shè)備廠)；DZ-900振蕩器(太倉(cāng)市強(qiáng)樂(lè)試驗(yàn)設(shè)備廠)；恒溫水浴鍋(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；WFH-201B紫外透射反射儀(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)；ER-120A電子分析天平(日本A&D公司)。

1.1.2 材料與試劑 色譜柱1：Luna (5 μm C18 100 ?，4.6 mm×100 mm(美國(guó)Phenomenex公司)、色譜柱2：Kromasil 100-5-C18 5 μm，10 mm×250 mm(瑞典AKZO NOBEL公司)和色譜柱3：YMC-Pack ODS-A/S 5 μm/12 nm，250 mm×10.0 mm(日本YMC公司)；Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠(GE醫(yī)療集團(tuán))；ODS-A-HG填料(50 μm、日本YMC公司)；Amberlite ( XAD-7樹脂(20～60目，美國(guó)Sigma公司)；乙醇、甲醇、乙酸乙酯、氯仿和正丁醇(AR，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；甲醇和乙腈(色譜純，康科德公司)；酵母膏和蛋白胨(BR，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)，瓊脂粉(AR，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；可溶性淀粉(AR，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；速溶海水結(jié)晶海鹽(佛山市海富生物科技有限公司)；TLC預(yù)制板和硅膠(200～300目，青島海洋化工廠)。

1.1.3 A1培養(yǎng)基(1 L) 可溶性淀粉w=1%，酵母浸膏w=0.4%，蛋白胨w=0.2%，海鹽w=2.48%，121 ℃滅菌25 min，冷卻后備用。

1.2 微生物的發(fā)酵培養(yǎng)

1.2.1 菌種活化 放線菌Streptomycesnovaecaesareae種子活化培養(yǎng)基采用A1培養(yǎng)基。將適量純化菌種接種于培養(yǎng)瓶(30 mL A1/100 mL)，置于搖床上培養(yǎng)24 h(28 ℃、165 r/min)。

1.2.2 規(guī)模發(fā)酵 按一定接種量(2%/L培養(yǎng)基)接種于培養(yǎng)瓶中(1 L A1培養(yǎng)基/3 L培養(yǎng)瓶)，搖瓶培養(yǎng)7 d(28 ℃、165 r/min)。共發(fā)酵培養(yǎng)36 L。

1.3 微生物的提取與分離

生長(zhǎng)7 d后的微生物加入XAD-7樹脂(4 g/L)，繼續(xù)振搖3～4 h后紗布過(guò)濾，分別得到菌體(含XAD-7樹脂)和發(fā)酵液。

1.3.1 菌體部分 將菌體部分(XAD-7樹脂)加丙酮振搖1 h/次(1 L丙酮/次，3次)，紗布過(guò)濾得丙酮液。丙酮液減壓濃縮至無(wú)丙酮味，加水成水懸液，等體積EtOAc萃取3次，萃取液減壓濃縮得菌體EtOAc相(5.0 g)。

1.3.2 發(fā)酵液部分 菌液恒溫水浴鍋濃縮至6 L，等體積EtOAc萃取3～5次，EtOAc相合并減壓濃縮得菌液EtOAc提取物(3.0 g)。

菌體EtOAc相(5.0 g)采用Sephadex LH-20凝膠柱層析(柱長(zhǎng):1 m，直經(jīng):4 cm)純甲醇洗脫，運(yùn)用TLC薄層色譜進(jìn)行合并，共得7個(gè)流份Fr1-7。Fr2(2.24 g)經(jīng)過(guò)ODS層析柱(50 μm/12 nm)，采用甲醇水(甲醇∶水=56∶44～100∶0,V/V)梯度洗脫，經(jīng)過(guò)TLC追蹤合并為8個(gè)子流份Fr2-1-Fr2-8。Fr2-1(580 mg)經(jīng)半制備HPLC(色譜柱3, 0～40 min，乙腈∶水=20∶80～100∶0,V/V, 流速1 mL/min)梯度洗脫，分離純化得Fr2-1-1- Fr2-1-19。Fr2-1-15(tR=28.2 min, 28 mg)為化合物6、Fr2-1-17(tR=29.8 min, 14 mg)為化合物5。Fr2-1-4(29 mg)再次經(jīng)半制備HPLC純化(色譜柱2, 0～25 min, 甲醇∶水=20∶80～70∶30,V/V, 流速1 mL/min)梯度洗脫，得到化合物9(tR=22 min, 4.5 mg)。Fr2-1-9(44 mg)經(jīng)HPLC(色譜柱2, 甲醇∶水=40∶60,V/V, 流速1 mL/min)等度洗脫，純化得到化合物4(tR=36 min, 27 mg)和1(tR=38 min, 3.2 mg)。Fr2-1-11(28 mg) 經(jīng)半制備HPLC(色譜柱2, 甲醇∶水=44∶56,V/V, 流速1 mL/min)等度洗脫，純化得到化合物2(tR=29 min, 5 mg)。Fr2-1-13(23 mg)經(jīng)半制備HPLC(色譜柱2, 甲醇∶水=33∶67,V/V,流速1 mL/min)等度洗脫，得到Fr2-1-13-3(9 mg)，再純化得到(色譜柱2, 乙腈∶水=31∶69,V/V, 流速1 mL/min)得到化合物7(tR=17.9 min, 3.2 mg)和8(tR=19 min, 2.3 mg)。Fr2-1-2(145 mg)經(jīng)半制備HPLC純化(色譜柱2, 甲醇∶水=23∶77,V/V,流速1 mL/min)等度洗脫，得到化合物3(tR=17 min, 3 mg)。對(duì)Fr2-8(545 mg)經(jīng)半制備HPLC(色譜柱2, 乙腈∶水=80∶20,V/V, 流速1 mL/min)等度洗脫，純化得到化合物10(tR=48.8 min, 4 mg)。

1.4 物理常數(shù)與波譜數(shù)據(jù)

化合物1：淡黃色固體(甲醇)，[α]20D+41.17° (c=0.08, MeOH), ESI-MS:m/z261[M+H]+, 分子式為C14H16N2O3;1H NMR (400 MHz, CD3OD)δH: 4.21 (2H, brs, H-4/6), 7.19 (2H, m, H-2′), 7.29 (3H, m, H-3′, H-4′), 3.18 (1H, dd,J=13.6, 5.2 Hz, H-10a), 2.99 (1H, dd,J=13.6, 4.4 Hz, H-10b), 2.22(1H, m, H-5a), 1.89(1H, m, H-5b), 3.59 (1H, m, H-3a)、3.27～3.24 (1H, m, H-3b);13C NMR (100 MHz, CD3OD)δC: 167.7 (C-1), 54.0(C-3), 68.5(C-4), 38.0(C-5), 59.6(C-6), 171.0(C-7), 57.2(C-9), 40.9(C-10), 136.8(C-1′), 129.7(C-2′), 131.2(C-3′), 128.5(C-4′)。

化合物2：淡黃色固體(甲醇)，[α]20D-78.90° (c=0.1, MeOH), ESI-MS:m/z261[M+H]+, 分子式為C14H16N2O3;1H NMR(400 MHz, CD3OD)δH: 4.48(1H, brt,J=4.4 Hz, H-9), 4.36 (1H, dd,J=11.6, 5.6 Hz, H-6), 2.06 (1H, dd,J=12.8, 6.0 Hz, H-5a), 1.34 (1H, dt,J=12.8, 4.8 Hz, H-5b), 4.27(1H, t,J=5.2 Hz, H-4), 3.70 (1H, dd,J=13.2, 4.8 Hz, H-3a), 3.30(1H, m, H-3b), 3.17 (2H, m, H-10), 7.21～7.29(5H, m, H-2′, H-3′, H-4′);13C NMR(100 MHz, CD3OD)δC: 167.1 (C-1), 55.2(C-3), 68.5(C-4), 38.0(C-5), 58.3(C-6), 171.2(C-7), 57.6(C-9), 38.8(C-10), 137.4(C-1′), 129.5(C-2′), 131.0(C-3′), 128.1(C-4′)。

化合物3：白色無(wú)定形固體(甲醇)，[α]20D-24.22° (c=0.06, H2O), ESI-MS:m/z249[M+ K]+,分子式為C10H14N2O3;1H NMR(400 MHz, CD3OD)δH: 4.49(1H, t,J=4.0 Hz, H-9), 4.61(1H, dd,J=11.2, 5.6 Hz, H-6), 4.39(1H, brt,J=6.8 Hz, H-4), 3.63(1H, dd,J=12.8, 3.2 Hz, H-3a), 3.45(1H, d,J=12.8, Hz, H-3b), 3.51(2H, m, H-12), 2.29(1H, m, H-5a), 2.02(1H, m, H-5b), 2.26(1H, m, H-10a), 2.14(1H, m, H-10b), 2.06(1H, m, H-11a), 1.96(1H, m, H-11b);13C NMR(100 MHz, CD3OD)δC: 168.7 (C-1), 54.8C-3), 69.6(C-4), 37.7(C-5), 60.2(C-6), 168.8(C-7), 46.2(C-9), 24.2(C-10), 28.7(C-11), 61.7(C-12)。

化合物4：白色粉末(甲醇)，[α]20D-117.6° (c= 0.48, MeOH), ESI-MS:m/z227[M+H]+, 分子式為C11H18N2O3。1H NMR(400 MHz, CD3OD)δH: 0.96(3H, d,J=6.4 Hz, H-12), 0.97(3H, d,J=6.4 Hz, H-13), 1.52(1H, m, H-10b), 1.92(2H, m, H-10a和H-11), 2.09(1H, ddd,J=13.6, 11.6, 4.0 Hz, H-5b), 2.28(1H, dd,J=13.2, 6.0 Hz, H-5a), 3.44(1H, d,J=12.8 Hz, H-3a), 3.66(1H, dd,J=12.4, 2.0 Hz, H-3b), 4.18(1H, m, H-9), 4.47(1H, t,J=4.0 Hz, H-4), 4.53(1H, dd,J=8.8, 7.2 Hz, H-6);13C NMR(100 MHz, CD3OD)δC: 169.0 (C-1), 54.6(C-3), 69.1(C-4), 38.1(C-5), 58.7(C-6), 173.0(C-7), 55.1(C-9), 39.3(C-10), 25.7(C-11), 23.3(C-12), 22.2(C-13)。

化合物5：白色粉末(甲醇)，[α]20D-49.9° (c= 0.24, MeOH), ESI-MS:m/z283 [M+K]+, 分子式為C14H16N2O2。1H NMR(400 MHz, CD3OD)δH: 7.26(5H, m, H-2′, H-3′, H-4′), 4.44(1H, t,J=4.0 Hz, H-9), 4.06(1H, dd,J=10, 6.8 Hz, H-6), 3.52(1H, m, H-3a), 3.37(1H, m, H-3b), 3.16(2H, d,J=4.4 Hz, H-10), 2.27(1H, m, H-5a), 1.21(1H, m, H-5b), 2.09(1H, m, H-4a), 1.82(1H, m, H-4b);13C NMR(100 MHz, CD3OD)δC: 166.9 (C-1), 46.0(C-3), 22.8(C-4), 29.4(C-5), 60.1(C-6), 170.9(C-7), 57.7(C-9), 38.2(C-10), 137.3(C-1′), 131.0(C-2′), 129.4(C-3′), 128.1(C-4′)。

化合物6：白色粉末(甲醇)，[α]20D-102.97° (c=0.10, EtOH), ESI-MS:m/z211[M+ H]+, 分子式為C11H18N2O2。1H NMR(400 MHz, CD3OD)δH: 4.26(1H, t,J=7.2 Hz, H-6), 4.12(1H, t,J=5.6 Hz, H-9), 3.50(2H, t,J=6.4 Hz, H-3), 2.29(1H, m, H-5a), 2.01(2H, m, H-5b, H-10a), 1.91(2H, m, H-4), 1.51(1H, m, H-10b), 1.35(1H, m, H-11), 0.96(3H, s,H-12), 0.94(3H, s, H-13)；13C NMR(100 MHz, MeOD)δC: 172.8 (C-1), 46.4(C-3), 23.6(C-4), 29.1(C-5), 60.3(C-6), 168.9(C-7), 54.6(C-9), 39.4(C-10), 25.7(C-11), 23.3(C-12), 22.2(C-13)。

化合物7：白色粉末(甲醇)，[α]20D+27.1° (c=0.05, EtOH), ESI-MS:m/z211 [M+ H]+, 分子式為C11H18N2O2。1H NMR(400 MHz, CD3OD)δH: 3.58(1H, m, H-3a), 3.50(1H, m, H-3b), 2.03(1H, m, H-4a), 2.35(1H, m, H-4b), 1.95(2H, m, H-5), 3.85(1H, m, H-9), 4.28(1H, t,J=13.6 Hz, H-6), 1.78(1H, m, H-10a), 1.69(1H, m, H-10b), 1.60(1H, m, H-11), 1.01(3H, d,J=6.8 Hz, H-12), 0.98(3H, d,J=6.0 Hz, H-13)；13C NMR(100 MHz, MeOD)δC: 171.6 (C-1), 43.6(C-3), 23.1(C-4), 29.9(C-5), 59.3(C-6), 169.1(C-7), 57.1(C-9), 46.7(C-10), 25.5(C-11), 22.9(C-12), 23.3C-13)。

化合物8：無(wú)色晶體(甲醇)，[α]20D-43.08° (c=0.04, MeOH), ESI-MS:m/z227 [M+ H]+, 分子式為C11H18N2O3。1H NMR(400 MHz, CD3OD)δH: 4.22(1H, t,J=6.8 Hz, H-9), 4.08(1H, s, H-6), 3.56(1H, m, H-3a), 3.52(1H, m, H-3b), 2.36～2.31(1H, m, H-5a), 2.19-2.16(1H, m, H-10), 2.07-2.02(1H, m, H-4a), 1.98～1.90(1H, m, H-4b), 2.00-1.93(1H, m, H-5b), 1.45(1H, m, H-11a), 1.38(1H, m, H-11b), 1.08(3H, d,J=6.8 Hz, H-13), 0.95(3H, d,J=7.2 Hz, H-12);13C NMR(100 MHz, CD3OD)δC: 172.4 (C-1), 46.2C-3), 23.2(C-4), 29.5(C-5), 61.3(C-6), 167.6(C-7), 60.0(C-9), 37.1(C-10), 25.4(C-11), 12.6(C-12), 15.5(C-13)。

化合物9：無(wú)色固體(甲醇)，ESI-MS:m/z144 [M+ H]+, 分子式為C7H13NO2。1H NMR(400 MHz, CD3OD)δH: 3.14(2H, t,J=6.8 Hz, H-4), 2.52(2H, t,J=7.2 Hz, H-6), 2.13(3H, s, H-8), 1.92(3H, s, H-1), 1.72(2H, m, H-5);13C NMR(100 MHz, CD3OD)δC: 22.3 (C-1), 173.3(C-2), 39.7(C-4), 24.5(C-5), 41.3(C-6), 211.0(C-7), 29.8(C-8)。

化合物10：白色固體(甲醇)，ESI-MS:m/z279 [M+ H]+, 分子式為C16H22O4。1H NMR(400 MHz, CD3OD)δH: 7.73(2H, dd,J=3.2, 5.2 Hz, H-3,6), 7.63(2H, dd,J=3.2, 5.2 Hz, H-4,5), 4.30(4H, t,J=6.4 Hz, H-8,8′), 1.73(4H, m, H-9,9′), 1.47(4H, m, H-10,10′), 0.99(6H, t,J=7.2 Hz, H-11,11′);13C NMR(100 MHz, CD3OD)δC: 133.6(C-1,2), 129.9(C-3,6), 132.4(C-4,5), 169.3(C-7,7′), 66.7(C-8,8′), 31.7(C-9,9′), 25.3(C-10,10′), 14.1(C-11,11′)。

2 結(jié)果與討論

化合物1淡黃色固體(甲醇)，ESI-MS提示其相對(duì)分子質(zhì)量為260(m/z261[M+H]+)，結(jié)合NMR譜數(shù)據(jù)，推斷其分子式為C14H16N2O3，不飽和度為8。1H NMR中δH7.19 (2H, m)、7.29 (3H, m)推測(cè)其苯環(huán)位置為單取代，結(jié)合δH3.18 (1H, m, H-10a)、2.99 (1H, m, H-10b)顯示有苯丙氨酸片段；δH4.21 (2H, brs, H-4/6)、3.59 (1H, m, H-3a)、3.27～3.24 (1H, m, H-3b)顯示有羥脯氨酸片段，同時(shí)13C NMR中δC167.7 (C-1)和171.0(C-7)為兩個(gè)酰胺碳信號(hào)，提示1為可能為葉立德類化合物，結(jié)合其旋光值[α]20D+41.17° (c=0.08, MeOH)，以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)環(huán)(4-羥基-L-脯-D-苯丙)二肽[11]對(duì)照基本一致，故確定1為環(huán)(4-羥基-L-脯-D-苯丙)二肽。

化合物2淡黃色固體(甲醇)，ESI-MS提示其相對(duì)分子質(zhì)量為260(m/z261[M+H]+)，結(jié)合NMR譜數(shù)據(jù)，推斷其分子式為C14H16N2O3，不飽和度為8。與化合物1的NMR其數(shù)據(jù)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)與1十分相似，僅在δC55.2(C-3), 38.8(C-10)有差異。且2的比旋光度值[α]20D-78.90° (c=0.1, MeOH)與1完全不同，以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(4-羥基-L-脯-L-苯丙)二肽[11-12]對(duì)照基本一致，故確定其為環(huán)(4-羥基-L-脯-L-苯丙)二肽。

化合物3白色無(wú)定形固體(甲醇)，ESI-MS提示其相對(duì)分子質(zhì)量為210(m/z249[M+K]+)。結(jié)合NMR譜數(shù)據(jù)，推斷其分子式為C10H14N2O3，不飽和度為5。與化合物1的NMR對(duì)比，其中不同之處δH4.49(1H, t,J=4.0 Hz, H-9), 3.51(2H, m, H-12), 2.26(1H, m, H-10a), 2.14(1H, m, H-10b), 2.06(1H, m, H-11a), 1.96(1H, m, H-11b)為脯氨酸片段，結(jié)合其比旋光度值為[α]20D-24.22° (c=0.06, H2O)，以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)環(huán)(4-羥基-L-脯-D-脯)二肽[11,13]對(duì)照基本一致，故確定其為環(huán)(4-羥基-L-脯-D-脯)二肽。

化合物4白色粉末(甲醇)，ESI-MS提示其相對(duì)分子質(zhì)量為226(m/z227[M+H]+)。結(jié)合NMR譜數(shù)據(jù)，推斷其分子式為C11H18N2O3，不飽和度為4。與化合物1的NMR對(duì)比，主要差異在1H NMR中δH0.96(3H, d,J=6.4 Hz, H-12)、0.97(3H, d,J=6.4 Hz, H-13)、1.52(1H, m, H-10b)、1.92(2H, m, H-10a和H-11)、4.18(1H, m, H-9)為亮氨酸片段，其他信號(hào)基本相同，結(jié)合比旋光度值[α]20D-117.6° (c= 0.48, MeOH)與文獻(xiàn)報(bào)道環(huán)(4-羥基-L-脯-L-亮)二肽[12,14]對(duì)照基本一致，故確定其為環(huán)(4-羥基-L-脯-L-亮)二肽。

化合物5白色粉末(甲醇)，ESI-MS提示其相對(duì)分子質(zhì)量為244(m/z283[M+K]+)，結(jié)合NMR譜數(shù)據(jù)，推斷其分子式為C14H16N2O2，不飽和度為8。其NMR數(shù)據(jù)與化合物2和3對(duì)比，其中化合物2中δH: 4.27(1H, t,J=5.2 Hz, H-4)為4位連羥基碳上氫信號(hào)，而在化合物5中δH: 2.27(1H, m, H-5a), 1.21(1H, m, H-5b)為脯氨酸4位亞甲基信號(hào)，對(duì)比其他信號(hào)發(fā)現(xiàn)其有苯丙氨酸片段與脯氨酸片段，以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)環(huán)(L-脯-L-苯丙)二肽[15-16]對(duì)照基本一致，故確定其為環(huán)(L-脯-L-苯丙)二肽。

化合物6白色粉末(甲醇)，ESI-MS提示其相對(duì)分子質(zhì)量為210(m/z211[M+H]+)，結(jié)合NMR譜數(shù)據(jù)，推斷其分子式為C11H18N2O2，不飽和度為4，其相對(duì)分子質(zhì)量與化合物4差16，可能為少一個(gè)氧原子，且不飽和度不變，其NMR數(shù)據(jù)與化合物4比較，其中δH1.91(2H, m, H-4)為脯氨酸4位沒(méi)有連羥基的亞甲基，所以為脯氨酸片段，結(jié)合其比旋光度值[α]20D-102.97° (c=0.10, EtOH)，與文獻(xiàn)環(huán)(L-亮-L-脯)二肽[17]對(duì)照基本一致，故確定6為環(huán)(L-亮-L-脯)二肽。

化合物7白色粉末(甲醇)，ESI-MS提示其相對(duì)分子質(zhì)量為210(m/z211[M+H]+)，結(jié)合NMR譜數(shù)據(jù)，推斷其分子式為C11H18N2O2，不飽和度為4。1H NMR中δH1.95(2H, m, H-5)比化合物6中5位信號(hào)稍小，δH4.28(1H, t,J=13.6 Hz, H-6)偶合常數(shù)比化合物6中δH4.26(1H, t,J=7.2 Hz, H-6)中偶合常數(shù)小，其余信號(hào)與化合物6基本一致，推測(cè)7與化合物6為一對(duì)手性化合物，且比旋光度值[α]20D+27.1° (c=0.05, EtOH)與化合物6相反，以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)環(huán)(D-脯-L-亮)二肽[18]對(duì)照基本一致，故確定7為環(huán)(D-脯-L-亮)二肽。

化合物8無(wú)色晶體(甲醇)，ESI-MS提示其相對(duì)分子質(zhì)量為226(m/z227[M+H]+)，結(jié)合NMR譜數(shù)據(jù)，推斷其分子式為C11H18N2O3，不飽和度為4。其相對(duì)分子質(zhì)量與化合物4一致，且不飽和度也一致，推測(cè)其與化合物4是羥基連接位置不同，其MNR中δH4.22(1H, t,J=6.8 Hz, H-9), 2.19～2.16(1H, m, H-10)、1.45(1H, m, H-11a), 1.38(1H, m, H-11b), 1.08(3H, d,J=6.8 Hz, H-13), 0.95(3H, d,J=7.2 Hz, H-12)為異亮氨酸片段，與化合物4對(duì)比其脯氨酸上未連有羥基，推測(cè)羥基可能連接在7位氮上，以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)環(huán)(8-羥基-L-脯-D-異亮)二肽[19]對(duì)照基本一致。故確定8為環(huán)(8-羥基-L-脯-D-異亮)二肽。

化合物9無(wú)色固體(甲醇)，ESI-MS提示其相對(duì)分子質(zhì)量為143(m/z144[M+H]+)，結(jié)合1H及13C NMR譜數(shù)據(jù)，推斷其分子式為C7H13NO2，不飽和度為2。1H NMR中δH3.14(2H, H-4), 2.52(2H, H-6), 1.72(2H, H-5)為三個(gè)相鄰的亞甲基，δH2.13(3H, H-8), 1.92(3H, H-1)為兩個(gè)甲基信號(hào)；13C NMR中δC173.3(C-2)為酰胺信號(hào)，δC211.0(C-7)為酮羰基信號(hào)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)N-(4-氧代戊基)-乙酰胺[20]對(duì)照基本一致，故確定其為N-(4-氧代戊基)-乙酰胺。

化合物10白色固體(甲醇)，ESI-MS提示其相對(duì)分子質(zhì)量為278(m/z279[M+H]+)，結(jié)合NMR譜數(shù)據(jù)，推斷其分子式為C16H22O4，不飽和度為6。1H NMR中低場(chǎng)處δH7.73(2H, H-3,6), 7.63(2H, H-4,5)兩個(gè)芳香質(zhì)子信號(hào)，高場(chǎng)處一個(gè)甲基信號(hào)δH0.99(6H, H-11,11′)、兩個(gè)亞甲基信號(hào)δH1.73(4H, H-9,9′), 1.47(4H, H-10,10′)和一個(gè)連氧的亞甲基信號(hào)δH4.30(4H, H-8,8′)，結(jié)合13C NMR中給出8個(gè)碳信號(hào)以及質(zhì)譜給出相對(duì)分子質(zhì)量推測(cè)該化合物可能為對(duì)稱分子，因?yàn)橛袃山M芳香質(zhì)子信號(hào)所以為苯環(huán)臨位取代對(duì)稱分子結(jié)構(gòu)，結(jié)合NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)鄰苯二甲酸丁酯[21]對(duì)照基本一致，故確定其為鄰苯二甲酸丁酯。

化合物1-10均首次從放線菌Streptomycesnovaecaesareae該種中分離得到，且1、3首次從海洋放線菌中分離得到。1、3和7含有自然界中不常見的D構(gòu)型氨基酸。文獻(xiàn)檢索表明目前所報(bào)道的D構(gòu)型氨基酸組成的葉立德類化合物真菌來(lái)源的較多，且有文獻(xiàn)報(bào)道含有D構(gòu)型氨基酸的葉立德類化合物比含有L構(gòu)型的同類物質(zhì)生物活性好[11,22]，化合物1和2具有誘導(dǎo)煙草細(xì)胞產(chǎn)生H2O2的作用，且因?yàn)镈-Phe構(gòu)型關(guān)系1的作用明顯強(qiáng)于2[11]。化合物4對(duì)RAW264.7細(xì)胞顯示出較好的生長(zhǎng)抑制活性(IC50= 9.1 μmol/L)[23]，且對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562也具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性[24]。5能夠誘導(dǎo)J774A.1細(xì)胞增加分泌抗炎細(xì)胞因子IL-10，且還可以促進(jìn)IFN-γ分泌，IFN-γ具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤的特性[25]?；衔?和6具有良好的抗鰻弧菌Vibrioanguillarum活性(MIC為0.03～0.07 μg/mL)[26]。5和7對(duì)枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有抑制作用，且對(duì)大腸桿菌的抑制作用7與環(huán)丙沙星相當(dāng)[18]。8具有抑制人胰腺癌細(xì)胞(PANC-1)的增殖作用[27]。

有文獻(xiàn)報(bào)道研究表明，微生物產(chǎn)生的環(huán)二肽類多作為胞間傳遞的信號(hào)分子，例如，環(huán)二肽分子cyclo(Phe-Pro)能夠刺激高絲氨酸內(nèi)酯信號(hào)傳遞途徑[28]，微生物可感知其濃度的變化，以調(diào)節(jié)微生物的群體行為。文獻(xiàn) [29]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌產(chǎn)生的cyclo(L-phe-L-pro)和cyclo(L- tyr-L-pro)可作為信號(hào)分子，調(diào)節(jié)乳酸菌和葡萄球菌之間細(xì)胞間信息交流，使內(nèi)源性或益生菌菌株可減弱病原菌產(chǎn)生的毒素因子。可見微生物產(chǎn)生的環(huán)二肽作為信號(hào)分子在微生物群體行為具有很重要的作用。