人Autotaxin基因3個(gè)蛋白亞型的生物信息學(xué)比較分析*

曹 睿 潘薇薇 趙 邑 謝海軍

（山西省生物研究院有限公司 山西太原 030000）

0 引言

Autotaxin（ATX）首次在人的黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)2058 中被發(fā)現(xiàn)［1］，是一種自分泌活性因子，是血液中重要的酶，具有磷酸二酯酶活性，能催化溶血磷酰膽堿LPC 生成溶血磷脂酸（LPA），進(jìn)一步激活脂類相關(guān)的G 蛋白偶聯(lián)受體（LAPR），被歸為磷酸二酯酶家族（ENPP1－ENPP7）［2］。Autotaxin 在許多腫瘤中均有異常表達(dá)情況，例如在黑色素瘤、甲狀腺癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、 肝癌、胰腺癌中均有異常增 高［3－8］，由此 可見Autotaxin 在腫 瘤 的 發(fā)生和 發(fā) 展過(guò)程中有重要作用，被認(rèn)為是腫瘤治療中一個(gè)可能的靶點(diǎn)。

Autotaxin 基因位于人類8 號(hào)染色體長(zhǎng)臂2 區(qū)4 帶1 亞帶2 次亞帶 （8q24.12）， 編碼29 個(gè)外顯子， 目前主流觀點(diǎn)認(rèn)為該基因選擇性剪切產(chǎn)生3個(gè)蛋白亞型：ATX－α、ATX－β、ATX－γ， 也有科學(xué)家近期鑒定出其他的亞型：ATX－δ、ATX－ε［9］。 雖然這些亞型在結(jié)構(gòu)上十分相似， 但具體的生理功能卻有很大差異。 ATX－β，畸形癌亞型，即血漿中的lysoPLD，最初是從畸形癌細(xì)胞系克隆的，是最短、 也是最主要的ATX 亞型；ATX－α， 黑素瘤亞型；ATX－γ，腦特異的亞型，主要在少突膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)［10］。本文重點(diǎn)比較ATX－α、ATX－β、ATX－γ這3 個(gè)蛋白亞型在序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域、理化性質(zhì)、跨膜區(qū)域等方面的異同，為進(jìn)一步挖掘其生物學(xué)意義提供理論基礎(chǔ)和研究思路。

1 材料與方法

1.1 序列來(lái)源 人Autotaxin 蛋白3 個(gè)亞型的fasta 數(shù)據(jù)來(lái)自NCBI 蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，ATX－α、ATXβ、ATX－γ全長(zhǎng)分別為915aa、863aa、888aa，GI 號(hào)分別為91823274、91823602、195947389。

1.2 方法

1）蛋白亞型的序列比對(duì)及二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)比采用ESPript 3.0［11］。 ESPript 軟件能根據(jù)序列比對(duì)信息和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)信息，將比對(duì)結(jié)果圖形化。軟件需要的序列比對(duì)結(jié)果為.aln 格式數(shù)據(jù)， 二級(jí)結(jié)構(gòu)信息為.pdb 格式的數(shù)據(jù)。 其中.aln 格式的序列比對(duì)結(jié)果可通過(guò)Alignment By Muscle、ClustalX 等多種比對(duì)軟件得出，參考序列的PDB 文件可通過(guò)PDB 網(wǎng) 站（http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do）進(jìn)行下載， 也可通過(guò)對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行3D 結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)獲得。

2）結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)采用simple modular architecture research tool（SMART）［12］。 SMART 是蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和功能分析的工具集合。 可預(yù)測(cè)蛋白的一些二級(jí)結(jié)構(gòu)，例如跨膜區(qū)（transmembrane segments）、復(fù)合螺旋區(qū)（coiled coil regions）、信號(hào)肽（signal peptides）、蛋白結(jié)構(gòu)域（PFAM domains）等。 運(yùn)行軟件可直接用各個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)蛋白的ID， 例如Uniprot／Ensembl ID／accession number（ACC）或直接使用蛋白質(zhì)序列，本文使用的是蛋白序列。

3）理化性質(zhì)分析采用ProtParam tool［13］。 Prot－Param 是一個(gè)可根據(jù)蛋白的Swiss－Prot／TrEMBL AC 編號(hào)、ID 號(hào)或序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析的軟件（本文使用的是蛋白序列）， 可分析的理化性質(zhì)包括相對(duì)分子量、理論P(yáng)I 值、原子組成、半衰期、不穩(wěn)定系數(shù)等。

4）親疏水性分析采用ProtScale［13］。ProtScale 可根據(jù)蛋白的UniProtKB／Swiss－Prot 或UniProtKB／TrEMBL 的AC 編號(hào)、ID 號(hào)或序列進(jìn)行疏水性區(qū)域的預(yù)測(cè)，本文使用蛋白序列直接進(jìn)行預(yù)測(cè)。

5）跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)采用TMHMM［14］。TMHMM 綜合了跨膜區(qū)疏水性、電荷偏倚、螺旋長(zhǎng)度和膜蛋白拓?fù)鋵W(xué)限制等性質(zhì)， 采用隱馬氏模型（Hidden Markov Models），對(duì)跨膜區(qū)及膜內(nèi)外區(qū)進(jìn)行整體的預(yù)測(cè)。 TMHMM 是目前最好的進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測(cè)的軟件， 尤其在區(qū)分可溶性蛋白和膜蛋白時(shí)準(zhǔn)確性高，是判定一個(gè)蛋白是否為膜蛋白的首選軟件，本文使用蛋白序列對(duì)3 個(gè)亞型的跨膜區(qū)域分別進(jìn)行了預(yù)測(cè)。

表1 預(yù)測(cè)工具軟件簡(jiǎn)介

2 結(jié)果與分析

2.1 序列比對(duì)及二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)比結(jié)果 在進(jìn)行序列比對(duì)時(shí)，本文采用ClustalX 多重序列比對(duì)軟件，屬于Clustal 系列工具之一，另外一個(gè)ClustalW 工具是命令行形式的界面，適合數(shù)量較多的批量序列比對(duì)，而ClustalX 是圖形化界面，適用于習(xí)慣使用windows 操作系統(tǒng)的用戶。 ATX－α、ATX－β、ATX－γ 3 個(gè)亞型的序列比對(duì)使用ClustalX，以ATX－β 的二級(jí)結(jié)構(gòu)作為參考，3 個(gè)亞型序列及二級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)結(jié)果如圖1 所示（本文附圖見封四）。

從圖1 顯示的分析結(jié)果看，ATX－α 與ATXβ、ATX－γ 相比，從第323 個(gè)堿基開始，有一段52個(gè)堿基的插入，其二級(jí)結(jié)構(gòu)為η 折疊，這段插入可能與ATX－α 定位到細(xì)胞外基質(zhì)有 關(guān)［10］，從后續(xù)的結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)及疏水性分析看， 此插入片段可能造成了ATX－α 與其他2 個(gè)亞型在結(jié)構(gòu)域上及疏水性上的差異；ATX－γ 與ATX－α、ATX－β 相比，從第593 個(gè)堿基開始，有一段25 個(gè)堿基的插入，其結(jié)構(gòu)為α 螺旋，其生物學(xué)作用未知，從后續(xù)的分析看， 此插入片段沒(méi)有造成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域上的改變，但是從第590 個(gè)氨基酸開始，蛋白的疏水性與其他亞型產(chǎn)生了差異。

2.2 結(jié)構(gòu)域預(yù)對(duì)比結(jié)果 利用SMART 及蛋白亞型序列文件， 預(yù)測(cè)出每個(gè)亞型的結(jié)構(gòu)域類型及位置，比較結(jié)果如圖2 所示。

從圖2 比較結(jié)果看，ATX－α 與ATX－β、ATXγ 相比， 有一個(gè)300 bp 左右的Phosphodiest 結(jié)構(gòu)域，而ATX－β、ATX－γ 是2 個(gè)較短的Phosphodiest結(jié)構(gòu)域相連接， 造成這種差異的原因可能是因?yàn)锳TX－α 在第323 處有一段52 個(gè)氨基酸的插入片段。 與此同時(shí)ATX－γ 第593 處開始的25 個(gè)氨基酸的插入片段則沒(méi)有造成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域上的改變。 Phosphodiest 結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)作用是使得蛋白具有磷酸二酯酶活性。

3 個(gè)蛋白亞型的共同點(diǎn)是： 均具有1 個(gè)跨膜區(qū)域、2 個(gè)SO 結(jié)構(gòu)域及1 個(gè)NUC 結(jié)構(gòu)域（圖3）。SO 結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)作用是使得蛋白具有類生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素B（Somatomedin B－like）的功能。 NUC 為非特異性內(nèi)切酶作用區(qū)域。

2.3 理化性質(zhì)對(duì)比結(jié)果 根據(jù)3 個(gè)亞型序列文件， 使用ProtParam 得出分子量、PI 值等理化性質(zhì)結(jié)果，比較數(shù)據(jù)如表2。

表2 ATX 基因3 個(gè)蛋白亞型的理化性質(zhì)分析結(jié)果

從表2 結(jié)果看，ATX－α、ATX－β 與ATX－γ 在原子組成、氨基酸數(shù)目、分子量等各種理化性質(zhì)上均有差異， 尤其在具有重要生物學(xué)意義的PI 值、不穩(wěn)定系數(shù)、 親水性上均具有較大差異。 總體上ATX－α 與ATX－β 及ATX－γ 的差異較大，ATXβ、ATX－γ 相對(duì)比較相似。

3 個(gè)蛋白亞型的相同之處主要表現(xiàn)在： 具有相同的半衰期；均具有較高的不穩(wěn)定系數(shù)，均屬于不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，從數(shù)值的大小看，3 個(gè)蛋白亞型的不穩(wěn)定性ATX－α＞ATX－β＞ATX－γ；均具有較高的脂肪系數(shù)，脂肪系數(shù)反應(yīng)蛋白的熱穩(wěn)定性，從數(shù)值大小看，ATX－β＞ATX－γ＞ATX－α。

2.4 親疏水性對(duì)比結(jié)果 根據(jù)序列信息， 使用ProtScale 軟件得到每個(gè)亞型每個(gè)位點(diǎn)的疏水性值，根據(jù)每個(gè)位點(diǎn)的疏水性值繪制比較結(jié)果圖4。

根據(jù)圖4 中不同顏色曲線的重疊程度看，藍(lán)色代表的ATX－α 與其他2 個(gè)亞型差別較大，而ATX－β 與ATX－γ 相似性較高， 這一點(diǎn)從3 個(gè)蛋白亞型的平均親水性分值也可以得到佐證， 分別是：－0.575，－0.495，－0.541。 從差異開始的位置看，ATX－α 與其他2 個(gè)亞型的差異從第320 個(gè)氨基酸開始，ATX－β 與ATX－γ 的差異從第590 個(gè)氨基酸開始， 這一點(diǎn)可以從3 個(gè)蛋白亞型序列差異上得到佐證：ATX－α 從第323 個(gè)氨基酸開始，有一段52 個(gè)氨基酸的插入；ATX－γ 從第593 個(gè)氨基酸開始，有一段25 個(gè)氨基酸的插入。

2.5 跨膜結(jié)構(gòu)對(duì)比結(jié)果 TMHMM 軟件根據(jù)3個(gè)蛋白亞型的序列信息得出跨膜位置信息， 具體比較結(jié)果如表3。

表3 ATX 基因3 個(gè)蛋白亞型的跨膜區(qū)域結(jié)果

首先，3 個(gè)亞型都有跨膜區(qū)域，表明3 個(gè)蛋白都是跨膜蛋白；其次，從跨膜區(qū)域看，3 個(gè)蛋白亞型的跨膜位置沒(méi)有區(qū)別，高度一致，可以推測(cè)使得3 個(gè)蛋白亞型具有不同功能的區(qū)域主要是從3 個(gè)蛋白的第32 個(gè)氨基酸開始。

3 討論與結(jié)論

人類大約有2～3 萬(wàn)個(gè)基因，但如今研究者已知的人類細(xì)胞中不同蛋白質(zhì)的數(shù)量或許遠(yuǎn)超于10 萬(wàn)個(gè)。由相同基因編碼產(chǎn)生的不同蛋白亞型在組織和細(xì)胞中或許發(fā)揮完全不同的生物學(xué)功能，然而這些蛋白質(zhì)亞基在結(jié)構(gòu)上卻非常相似［15］。 通過(guò)關(guān)注細(xì)胞、組織或器官中的癌癥相關(guān)的蛋白質(zhì)亞型，對(duì)于開發(fā)新型藥物提供了一定的思路。ATX 基因在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中有重要作用，本研究對(duì)于ATX基因3 個(gè)蛋白亞型的分析，對(duì)于深入理解該基因的生物學(xué)功能等多方面研究具有一定的幫助。

本研究從序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域、理化性質(zhì)、親疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)方面分析了ATX 基因3 個(gè)蛋白亞型的異同。 上文已經(jīng)從橫向各個(gè)角度詳細(xì)分析了3 個(gè)亞型的異同，縱觀各方面的差異，會(huì)發(fā)現(xiàn)這些異同是有緊密聯(lián)系的。例如，在序列上的差異直接導(dǎo)致二級(jí)結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域、理化性質(zhì)、親疏水性方面的差異。具體分析可以看到，ATX－α 從第323處開始的一個(gè)長(zhǎng)度為52 個(gè)氨基酸的插入片段，直接造成從第320 個(gè)位置開始親疏水性發(fā)生改變，且可能導(dǎo)致2 個(gè)較短的Phosphodiest 結(jié)構(gòu)域連接成一個(gè)較長(zhǎng)的結(jié)構(gòu)域。 ATX－γ 從第593 處開始的一個(gè)長(zhǎng)度為25 個(gè)氨基酸的插入片段，直接造成從第590 個(gè)位置開始親疏水性發(fā)生改變， 但沒(méi)有引起結(jié)構(gòu)域的變化。 與此同時(shí)，引起一個(gè)猜測(cè)，氨基酸序列上的變化是否導(dǎo)致蛋白質(zhì)從變化位置前3位開始發(fā)生親疏水性改變，這一猜測(cè)有待驗(yàn)證。