蘭州百合糖蛋白LGP－2的提取純化及結(jié)構(gòu)表征研究*

王鋮博 慕星星 石繼鵬 陳佩佩 張 繼

（西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 甘肅蘭州 730070）

蘭州百合（Lilium davidii var. unicolor Salisb.）是百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）川百合的一個(gè)變種，為多年生鱗莖類草本，植物具有很高的食用、藥用和觀賞價(jià)值，是我國衛(wèi)生部首批審批通過的藥食兩用植物之一［1］。研究表明，蘭州百合中富含糖、蛋白質(zhì)、維生素、生物堿、黃酮等生物活性物 質(zhì)［2］。

糖蛋白（glycoprotein）是糖類與多肽或蛋白質(zhì)通過共價(jià)鍵連接而形成的結(jié)合蛋白， 是生物體內(nèi)重要的一類大分子［3］。糖蛋白種類繁多，廣泛存在于生物體內(nèi)，研究表明，80%以上的蛋白質(zhì)都是糖蛋白，包括許多激素、免疫球蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、載體蛋白、受體等。 糖蛋白具有多種生物學(xué)活性，例如抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等［4－5］。

目前，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)蘭州百合中糖和蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)已進(jìn)行很多研究，但對(duì)生物活性大分子糖蛋白，卻鮮有文獻(xiàn)進(jìn)行報(bào)道。 本文提取純化蘭州百合糖蛋白（glycoprotein of Lilium davidii var.unicolor Salisb.，LGP），并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，可為LGP 的后續(xù)研究提供參考， 也為蘭州百合的進(jìn)一步開發(fā)利用提供更加廣闊的前景。

1 材料和儀器

1.1 材料 蘭州百合采自甘肅省蘭州市七里河區(qū)西果園百合種植基地。

1.2 主要儀器 Nicoletis10 傅里葉變換紅外光譜儀（美國Thermo 公司），JD500－3 電子天平（沈陽龍騰電子有限公司），UV 9100b 紫外－可見分光光度計(jì)（北京萊伯泰科儀器有限公司），LGJ－18S 真空冷凍干燥機(jī)（北京松源華興科技發(fā)展有限公司），L－535R 離心機(jī)（湘儀離心機(jī)廠），JRA－6 數(shù)顯磁力攪拌水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司），BSZ－100 自動(dòng)部分收集器（上海青浦滬西儀器廠），HL－2恒流泵（上海滬西分析儀器廠有限公司）。

1.3 試劑 石油醚（沸程30 ～60℃，煙臺(tái)市雙雙化工有限公司），無水乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），硫酸銨（萊陽市雙雙化工有限公司），苯酚（中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司），濃硫酸（廣州德樹化工有限公司），溴化鉀（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），Sephadex G－200 凝膠（北京索萊寶科技有限公司），DEAE－Cellulose 52 陰離子交換柱（北京索萊寶科技有限公司），MD77 透析袋 （截留分子量8 000～14 000，北京索萊寶科技有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 蘭州百合糖蛋白的提取純化

2.1.1 LGP 的提?。?］將新鮮蘭州百合鱗片洗凈后，于60℃烘箱中烘干后粉碎，過100 目篩；使用pH＝7.4 的0.01 mol/L PBS 緩沖溶液在50℃水浴條件下提取百合糖蛋白，提取時(shí)間為2 h；提取液經(jīng)4 000 r/min 離心，取上清液40℃濃縮；濃縮液加入硫酸銨鹽析，離心，收集沉淀；沉淀復(fù)溶后以蒸餾水透析除去其中的鹽分， 滴加10% BaCl2溶液檢測透析終點(diǎn)； 除鹽后的樣品使用真空冷凍干燥，得到LGP 的粗提物。

2.1.2 LGP 粗品的純化［7］將糖蛋白粗品溶于pH ＝7.4 的PBS 緩 沖溶液 中，上樣 至Sephadex G－200 層析柱，使用超純水進(jìn)行洗脫，上樣量為20 mL，流速為0.5 mL／min，考馬斯亮藍(lán)法595 nm處檢測蛋白質(zhì)流出，苯酚－硫酸法490 nm 處檢測多糖，收集多糖和蛋白質(zhì)均檢出部分。

上樣至DEAE－Cellulose 52 陰離子交換柱，NaCl溶液梯度洗脫（0 mol／L、0.1 mol／L、0.2 mol／L、0.4 mol／L、0.6 mol／L、0.8 mol／L 及1.0 mol／L），考馬斯亮藍(lán)法和苯酚－硫酸法測定蛋白質(zhì)和多糖含量，按照洗脫梯度收集兩者均檢出管。 去離子水透析4 d，濃縮后真空冷凍干燥，即獲得純化LGP。

2.2 蘭州百合糖蛋白的結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 高效液相色譜（HPLC）分析［8］高效液相色譜系統(tǒng)，Silversit C18 色譜柱（250×416 mm，5 μm），紫外檢測波長280 nm，流動(dòng)相為雙蒸水，進(jìn)樣量20 μL，柱溫30℃，流速為0.7 mL／min，記錄樣品色譜曲線。

2.2.2 紅外光譜（FT－IR）分析［9］LGP 的紅外光譜分析采用KBr 壓片法。 取充分干燥的LGP 與KBr 按質(zhì)量比1∶100 進(jìn)行壓片， 用Thermo Nicolet iS10 紅外光譜儀在400～4 000 cm－1波數(shù)范圍內(nèi)掃描16 次，分辨率為4 cm－1。

2.2.3 分子量測定 LGP 分子量采用體積排阻色譜－光散射聯(lián)用（SEC－LLS）進(jìn)行測定。 檢測器為多角度激光光散射儀（DAWN Eos，Wyatt Technology Co.，USA），λ=690 nm； 色 譜 柱 為UltrahydrogelTMcolumn（7.8×300 mm，Waters，USA）；以及示差折光檢測器 （DAWN Eos，Wyatt Technology Co．，USA）。檢測樣品濃度為2.0 mg／mL， 樣品檢測前經(jīng)孔徑為0.2 μm 過濾器過濾。

2.2.4 糖肽鍵類型［10］糖蛋白的糖肽鍵類型判斷方法，主要采用β－ 消去反應(yīng)。 將LGP 置于0.2 mol/L NaOH 溶液中，于45℃保溫3 h，測定其紫外吸收光譜， 同時(shí)以未用堿處理的相同濃度LGP 為對(duì)照，測定其紫外吸收光譜。

2.2.5 圓二色性光譜（CD）分析［11］LGP 樣品使用蒸餾水溶解，配制成一定濃度的溶液，用圓二色性光譜儀觀察其不對(duì)稱活性， 以判斷其蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)果與分析

3.1 百合糖蛋白的純化 由圖1 可知，LGP 粗品經(jīng)Sephadex G－200 柱初步純化后，糖含量和蛋白質(zhì)含量相關(guān)聯(lián)的高峰只有一個(gè)， 收集后做進(jìn)一步純化。

圖1 蘭州百合糖蛋白（LGP）的Sephadex G-200 洗脫曲線

圖2 為LGP 的DEAE-Cellulose 52 柱洗脫曲線。如圖所示，經(jīng)NaCl 溶液梯度洗脫后，收集到2 個(gè)純化糖蛋白組分，分別命名為LGP-1 和LGP-2。 其中LGP-1 由超純水洗脫獲得，LGP-2 由0.1 mol／L NaCl 溶液洗脫獲得。

本文以LGP-2 為研究對(duì)象，對(duì)其做了一系列的結(jié)構(gòu)表征。

圖2 蘭州百合糖蛋白（LGP）的DEAE-Cellulose 52 洗脫曲線

3.2 結(jié)構(gòu)表征

3.2.1 高效液相色譜分析 圖3 為LGP-2 的HPLC 色譜圖。 在紫外280 nm 檢測條件下，LGP-2在保留時(shí)間為2.50667 min 處出現(xiàn)一個(gè)單一對(duì)稱洗脫峰，說明得到的LGP-2 是單一組分的糖蛋白［12］。

圖3 LGP-2 組分的HPLC 色譜圖

3.2.2 紅外圖譜分析 由圖4 可知，LGP-2 在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)的紅外吸收光譜表現(xiàn)處典型的多糖和蛋白質(zhì)吸收峰。其中，波數(shù)在3 700 cm-1到3 200 cm-1之間的強(qiáng)而寬的吸收峰是O-H 的伸縮振動(dòng)峰和N-H 基團(tuán)的伸縮振動(dòng)；2 972.20 cm-1和2 923.11 cm-1處則為C-H 的伸縮振動(dòng)和彎曲振動(dòng)［13］；1 635.56 cm-1為酰胺基團(tuán)中的C=O 的吸收峰［14］；1 384.62 cm-1處的峰則證明了有羧基（-COO-）的存在［15］；1 048.65 cm-1的吸收峰則表明糖鏈存在吡喃糖構(gòu)型；876.72 cm-1則表明LGP-2 中存在β-糖苷鍵［10］。

圖4 LGP-2 的紅外吸收光譜圖

3.2.3 糖肽鍵類型 O-糖肽鍵在稀堿環(huán)境中易發(fā)生β-消去反應(yīng)，導(dǎo)致與糖鏈連接的絲氨酸和蘇氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)棣?氨基丙烯酸和α-氨基丁烯酸，在240 nm 處產(chǎn)生明顯的紫外吸收，因此，對(duì)比樣品在反應(yīng)前后在240 nm 處的紫外吸收有無變化即可確定糖蛋白中是否存在O- 糖肽鍵［16］。

圖5 β-消去反應(yīng)前后LGP-2 的紫外掃描圖

由圖5可知，LGP－2 經(jīng)稀堿處理后，紫外240 nm 波長處吸光值發(fā)生了明顯的變化， 發(fā)生了β－消去反應(yīng)，從而說明LGP－2 含有O－連接糖肽鍵。

3.2.4 分子量測定 通過SEC－LLS 自帶軟件分析可知，LGP－2 重均分子量（Mw）為9.311×104，數(shù)均分子量（Mn）為3.685×104，多分散系數(shù)（Mw／Mn）為2.527。

3.2.5 圓二色性光譜 一般將蛋白質(zhì)的圓二色性光譜分為遠(yuǎn)紫外區(qū)（185～245 nm）和近紫外區(qū)（245～320 nm）。 遠(yuǎn)紫外區(qū)是肽鍵的吸收范圍，反映了主鏈構(gòu)象。在遠(yuǎn)紫外區(qū)，天然蛋白質(zhì)的圓二光譜包括一個(gè)正峰（在190 nm 左右）和一個(gè)負(fù)槽（在205～235 nm 范圍）。 其中負(fù)槽的形狀與主鏈構(gòu)象密切相關(guān)。

圖6 LGP-2 的圓二光譜圖

從圖6 可以看出，LGP－2 在196 nm 左右有一個(gè)正峰， 在210～220 nm 之間有一個(gè)負(fù)槽， 說明LGP－2 的主鏈結(jié)構(gòu)以β－折疊為主［11］。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以蘭州百合為原料提取其中糖蛋白，經(jīng)過DEAE－52 和Sephadex G－200 色譜柱分離得到LGP－1 和LGP－2 2 種糖蛋白組分。經(jīng)過FT－IR推斷糖蛋白LGP－2 官能團(tuán)結(jié)構(gòu)、β－消去反應(yīng)確定糖肽鍵類型、CD 光譜分析主鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)、SECLLS 測定糖蛋白分子量。結(jié)果表明：LGP－2 具有多糖和蛋白質(zhì)的特征吸收峰，且糖鏈中含有吡喃環(huán)，以β－糖苷鍵連接； 糖和蛋白質(zhì)之間存在O－連接的糖肽鍵； 蛋白質(zhì)主鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)以β－折疊為主；LGP－2 重均分子量為9.311×104。