利用固定化技術(shù)探究光質(zhì)對(duì)小球藻的影響*

鄭耀賢 王愛東 胡佳娜

［1 北京師范大學(xué)（珠海）附屬高級(jí)中學(xué) 廣東珠海 519080 2 珠海市唐國(guó)安紀(jì)念學(xué)校 廣東珠海 519080］

小球藻（Chlorella sp.）是一類普生性單細(xì)胞綠藻，屬于綠藻門、綠藻綱、小球藻屬。 小球藻具有生態(tài)分布廣、易于培養(yǎng)、生長(zhǎng)速度快等優(yōu)點(diǎn)，是進(jìn)行生物技術(shù)研究和環(huán)境科學(xué)研究的好材料［1］。 著名的卡爾文循環(huán)就是用小球藻做實(shí)驗(yàn)材料， 最終探明了二氧化碳中的碳在光合作用中轉(zhuǎn)化為有機(jī)物中碳的途徑?！疤骄坎煌h(huán)境因素對(duì)光合作用的影響”是2017 版高中生物學(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)中，為幫助學(xué)生達(dá)成對(duì)概念2（細(xì)胞的生存需要能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并通過(guò)分裂實(shí)現(xiàn)增殖）的理解，促進(jìn)學(xué)生生物學(xué)學(xué)科核心素養(yǎng)提升，要求開展的教學(xué)活動(dòng)。

固定化細(xì)胞是指用物理或化學(xué)方法使細(xì)胞成為不易從載體上流失的形式， 制成生物反應(yīng)器用以催化生化反應(yīng)、細(xì)胞數(shù)量的增殖等。與游離細(xì)胞相比，固定化細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)為：細(xì)胞固定化載體為微生物生長(zhǎng)提供了充足有效的空間； 保證了生物反應(yīng)器內(nèi)較高的細(xì)胞濃度，使得反應(yīng)速度加快。藻類的生物量受到很多因素的影響， 例如光照、pH 值、氮、磷、重金屬含量等的影響［2］。 光質(zhì)會(huì)影響植物的光合作用， 但是光質(zhì)對(duì)固定化小球藻的影響尚未見報(bào)道， 本實(shí)驗(yàn)嘗試探究光質(zhì)對(duì)固定化小球藻的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 試劑與儀器 電子天平、分光光度計(jì)、手提電腦、溶解氧傳感器、3 W LED 燈泡（白光和黃紅光）、酒精燈、10 mL 一次性注射器、紗布、海藻酸鈉、氯化鈣、檸檬酸三鈉、蒸餾水等。

1.2 藻種及培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)所用藻種從校內(nèi)池塘采集后經(jīng)微生物純化培養(yǎng)所得， 采用BG-11 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，其組成為（1 000 mL）：NaNO31.5 g、K2HPO40.04 g、MgSO4·7H2O 0.075 g、CaCl2·7H2O 0.036 g、Na2CO30.02 g、檸檬酸0.006 g、檸檬酸鐵0.006 g、微量元素溶液A5 1 mL、氨芐青霉素（終濃度）50 μg／mL、蒸餾水補(bǔ)充至1 000 mL 。

培養(yǎng)條件為（25±1）℃、光照強(qiáng)度為5 000 lx、連續(xù)光照。

1.3 小球藻的固定方法 目前最常用的小球藻固定方法是海藻酸鈣包埋法， 將海藻酸鈉加熱融化后用注射器緩慢滴入到配制好的氯化鈣溶液中，立刻成為凝膠顆粒狀的海藻酸鈣，固定化膠球的直徑約為3.5 mm。

1.4 測(cè)量方法 小球藻生物量采用在680 nm 下用分光光度計(jì)測(cè)量其吸光值， 通過(guò)吸光值判斷小球藻的生物量［3］。

小球藻溶解氧采用溶解氧傳感器進(jìn)行測(cè)量，探頭的膜接觸樣品時(shí)，樣品要保持一定的流速，防止與膜接觸的瞬間將該部位樣品中的溶解氧耗盡， 因此， 測(cè)量的時(shí)候需要不斷搖動(dòng)探頭或者溶液，待讀數(shù)不再上升時(shí)記錄數(shù)據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)步驟

1）將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小球藻液充分搖勻后取8 mL，平均分為2 份，A 份和B 份。

2）取A 份的小球藻液+ 26 mL BG-11 培養(yǎng)液+0.6 g 海藻酸鈉配制成30 mL 2%海藻酸鈉凝膠，用10 mL 注射器將凝膠緩慢（1 s/滴）滴入0.15 mol／L的氯化鈣溶液中，形成直徑3.5 mm 的藻球，搖動(dòng)15 min 后，濾去氯化鈣溶液，加蒸餾水潤(rùn)洗3 遍［4］。將藻球平分為4 份（每份200 顆），分別加入裝有50 mL BG-11 培養(yǎng)液的錐形瓶中， 并用封口膜封口，分別標(biāo)為A1、A2、A3、A4。

3）取B 份的小球藻液搖勻，平均分為4 份，各加入分別裝有50 mL 的BG-11 培養(yǎng)液的錐形瓶中，并用封口膜封口，分別標(biāo)為B1、B2、B3、B4。

4）將A1、A2、B1、B2 置于3 W LED 白光燈下連續(xù)光照培養(yǎng)， 將A3、A4、B3、B4 置于3 W LED黃紅光燈下連續(xù)光照培養(yǎng)。

5）連續(xù)培養(yǎng)72 h。 每隔12 h，用手持技術(shù)溶解氧傳感器測(cè)量A2、B2、A4、B4 中的溶解氧，并記錄。

6）分別從A1、A3 瓶中取出20 顆固定化小球藻球，各加入裝有10 mL 0.1 mol／L 的檸檬酸鈉溶液中［5］，搖蕩，直至藻球完全 融化（約 需50 min）。將融化后的藻液分別在分光光度計(jì)中測(cè)量吸光值（OD 680），并記錄；將B1、B3 搖勻，各取2 mL 藻液測(cè)定吸光值（OD 680），并記錄。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 固定載體對(duì)小球藻生物量的影響 本研究采用分光光度法測(cè)量吸光度間接衡量小球藻的生物量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，海藻酸鈣凝膠小球?qū)⒃寮?xì)胞固定起來(lái)，藻細(xì)胞的增殖被制約，藻細(xì)胞的增殖數(shù)量明顯比懸浮態(tài)的小球藻生物量低（圖1），白光培養(yǎng)下，B1 明顯大于A1，B3 明顯大于A3。對(duì)小球藻的生物量的測(cè)定還可以采用顯微計(jì)數(shù)法進(jìn)行測(cè)量，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可增加顯微計(jì)數(shù)的過(guò)程， 以進(jìn)一步印證吸光度的結(jié)果。

圖1 不同光質(zhì)對(duì)小球藻生物量的影響

3.2 光質(zhì)對(duì)小球藻生物量的影響 小球藻增殖所需能量來(lái)源于其光合作用。 小球藻細(xì)胞葉綠體的色素對(duì)不同的光質(zhì)的吸收存在差異， 表現(xiàn)為白光條件下有利于其生物量的增加， 不過(guò)其增加并不顯著， 這可能與小球藻吸收的光質(zhì)較多是黃紅光有關(guān)。 如圖1，B1 和B3 在不同光質(zhì)光照下，懸浮液培養(yǎng)的小球藻生物量并無(wú)存在顯著差異；A1和A3 在不同光質(zhì)光照下， 固定化培養(yǎng)的小球藻生物量也不存在顯著差異。

3.3 固定載體對(duì)小球藻溶解氧產(chǎn)生的影響 小球藻能應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖等主要是因?yàn)槠溥M(jìn)行光合作用產(chǎn)生氧氣，增加魚塘的溶解氧，同時(shí)為動(dòng)物提供優(yōu)質(zhì)的食物。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，固定載體雖然制約了小球藻生物量的增長(zhǎng)，但是其對(duì)水中溶解氧的供應(yīng)與懸浮液培養(yǎng)的相比，幾乎相等甚至更多（圖2），白光條件下的固定化小球藻其產(chǎn)氧量最多。這可能與凝膠小球內(nèi)部多孔，具有四通八達(dá)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有關(guān)，固定化的小球藻光合作用產(chǎn)生的氧氣及時(shí)擴(kuò)散到凝膠球外面的溶液中，提高光合作用的效率。

3.4 光質(zhì)對(duì)小球藻溶解氧產(chǎn)生的影響 圖2 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，白光和黃紅光條件下，小球藻的產(chǎn)氧量并沒(méi)有明顯差異， 這進(jìn)一步印證小球藻對(duì)可見光的利用可能主要是黃紅光。 這為小球藻的培養(yǎng)條件提供了有益的參考。

圖2 不同光質(zhì)對(duì)小球藻溶解氧產(chǎn)生的影響

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 不同光質(zhì)對(duì)小球藻生物量有一定影響， 黃紅光可能是小球藻光合作用利用的主要光質(zhì)。 固定化載體對(duì)小球藻的生物量增長(zhǎng)存在制約， 其生物量明顯低于懸浮液培養(yǎng)條件下的小球藻。 固定化小球藻的光合速率明顯高于懸浮液培養(yǎng)的小球藻光合速率， 這為固定化小球藻用于水產(chǎn)養(yǎng)殖、污水處理等提供了有益的參考。

5 反思

《普通高中生物學(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)（2017年版）》提出“組織以探究為特點(diǎn)的主動(dòng)學(xué)習(xí)是落實(shí)生物學(xué)學(xué)科核心素養(yǎng)的關(guān)鍵”的教學(xué)建議，提出教師應(yīng)該提供更多的機(jī)會(huì)讓學(xué)生親自參與和實(shí)踐，重視信息化環(huán)境下的學(xué)習(xí)，落實(shí)科學(xué)、技術(shù)和社會(huì)（STS）相互關(guān)系，培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新精神和實(shí)踐能力［6］。 本探究創(chuàng)造性地將進(jìn)行光合作用的小球藻利用固定化技術(shù)固定起來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探究，取得良好的實(shí)驗(yàn)效果。

傳統(tǒng)探究環(huán)境因素對(duì)光合作用強(qiáng)度的影響多采用定性的方式進(jìn)行研究， 本實(shí)驗(yàn)利用傳感器和分光光度計(jì)等數(shù)字化工具， 實(shí)現(xiàn)中學(xué)生物學(xué)探究實(shí)驗(yàn)的定量研究。 利用手持技術(shù)（傳感器）等進(jìn)行定量研究有力地激發(fā)了學(xué)生進(jìn)行科學(xué)探究的積極性［7］。 同時(shí)，固定化細(xì)胞由于可以多次重復(fù)使用，簡(jiǎn)化了游離細(xì)胞需不斷培養(yǎng)菌體的繁復(fù)操作，減少營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的浪費(fèi)。基于關(guān)注社會(huì)，指導(dǎo)學(xué)生利用已有科學(xué)文化知識(shí)開展力所能及的探究很有必要，學(xué)生感受到學(xué)以致用，可激發(fā)學(xué)生進(jìn)一步探究學(xué)習(xí)的興趣。