通過提高胞內(nèi)輔酶水平促進L-苯甘氨酸的合成

劉巧利， 楊套偉， 周俊平， 徐美娟， 張 顯， 饒志明

（江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122）

L-苯甘氨酸是一種手性芳香族非天然氨基酸，是合成多種β-內(nèi)酰胺類抗生素及抗癌藥物紫杉醇的重要前體物質(zhì)[1-4]，在醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中具有廣泛的應用價值。目前主要通過化學方法合成[5]，但是化學合成法反應條件劇烈、工藝復雜、副產(chǎn)物較多、產(chǎn)品光學純度不夠，且反應中需用到大量有機試劑和劇毒物質(zhì)，嚴重污染環(huán)境。通過生物催化法合成L-苯甘氨酸，不僅反應條件溫和，綠色環(huán)保，而且由于酶的底物特異性和立體選擇性，副產(chǎn)物較少，產(chǎn)品可以達到光學純度，易于分離，可直接用于藥物的合成[6]。因此，建立高效的生物催化方法在L-苯甘氨酸的工業(yè)生產(chǎn)中具有重要的研究意義。

在之前的研究中，通過在大腸桿菌E.coli BL21（DE3）中共表達來源于蠟樣芽孢桿菌的亮氨酸脫氫酶（LeuDH）和來源與博依丁假絲酵母的甲酸脫氫酶（FDH）構(gòu)建胞內(nèi)輔酶再生體系，利用重組菌E.coli BL21/pETDuet-ldh-fdh作為催化劑，實現(xiàn)了從苯乙酮酸到L-苯甘氨酸的全細胞轉(zhuǎn)化合成[7]。在類似的全細胞轉(zhuǎn)化體系中，添加胞外輔酶（NAD+）可以有效地提高轉(zhuǎn)化速率[8-9]，說明在脫氫酶過表達的情況下，胞內(nèi)環(huán)境存在輔酶供應不足的問題，因此提高胞內(nèi)輔酶（NAD（H））水平是進一步提高反應速率的有效策略之一。

大腸桿菌中NAD（H）合成途徑分為從頭合成途徑和補救合成途徑，見圖1。其中煙酸轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶（NAPRTase）是補救合成途徑的限速酶[10]。通過加強表達NAD（H）合成途徑中的關(guān)鍵酶和培養(yǎng)基中添加合成前體物質(zhì)可有效提高胞內(nèi)NAD（H）的含量[11]。Berrios-Rivera等[12]在大腸桿菌中表達鼠傷寒沙門氏菌 Salmonella typhimurium來源的NAPRTase基因 （pncB）使胞內(nèi)NAD+、NADH和總NAD（H）分別提高了 81.8%、29.8%和 41.7%，證明NAPRTase的過表達可有效促進胞內(nèi)NAD（H）的合成。Witholts等[13]在大腸中過表達自身來源的NAPRTase時，胞內(nèi)NAD（H）總量提高了5倍。Heuser F等[14]在E.coli中分別過表達 NAPRTase和NAD+合酶時（NAD+Syn），胞內(nèi) NAD（H）的總量分別提高了兩倍，當同時過表達這兩個關(guān)鍵酶基因pncB和nadE時，菌株胞內(nèi)NAD（H）總量提高了7倍，有效提高了全細胞催化合成（R）-甲基-3-羥基丁胺的反應速率，說明和NAPRTase一樣，NAD+Syn也是NAD（H）補救合成途徑的限速酶。張鑫等[15]通過在E.coli中過表達pncB和nadE，使全細胞轉(zhuǎn)化合成1，4-丁二醇的轉(zhuǎn)化率提高了13.03%，產(chǎn)物得率提高了40.9%。另外，穆曉清等[16]通過在大腸桿菌中共表達pncB和nadE，在培養(yǎng)基中添加前體物質(zhì)煙酸（NA）有效地促進了胞內(nèi)NAD+的合成。

圖1 大腸桿菌中輔酶NAD+的從頭合成途徑及和補救合成途徑Fig.1 De novo synthesis pathway and salvage synthesis pathway of coenzyme NAD+in E.coli

基于以上的研究，作者擬在實驗室前期構(gòu)建保藏的L-苯甘氨酸催化合成菌株E.coli BL21/pETDuet-ldh-fdh中共表達NAPRTase和NAD+Syn的編碼基因pncB和nadE，并在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加NA，以期提高重組大腸桿菌胞內(nèi)NAD（H）的質(zhì)量摩爾濃度，進而提高全細胞轉(zhuǎn)化苯乙酮酸合成L-苯甘酸的轉(zhuǎn)化效率。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

本研究所用菌株與質(zhì)粒見表1。

表1 本研究所用的菌株、質(zhì)粒和引物Table 1 Strains，plasmids and primers used in this work

1.2 主要試劑與儀器

DL-苯甘氨酸標準品 （純度＞98.5%，D型和L型的比例為1∶1）、苯乙酮酸標準品（純度＞98.5%）以及NAD+、NADH：均購自Sigma Aldrich公司；分子生物學工具酶、DNA Markers：均購自TaKaRa公司；基因組提取試劑盒、DNA回收試劑及質(zhì)粒提取試劑盒：均購自上海捷瑞生物工程有限公司；輔酶I NAD（H）含量測定試劑盒：購自索萊寶公司；引物合成與核酸序列測定：由上海金唯智生物工程公司完成；其他試劑均購自國藥集團。PCR儀：購自 Bio-Rad公司；UVP凝膠成像儀：購自英國UVP有限公司；高速冷凍離心機：購自 HITACHI公司；超聲破碎儀：購自SONICS公司；高效液相色譜儀：購自Agilent公司；色譜柱：C18、C8及有機酸柱均購自DIMARK公司。

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)NCBI中公布的E.coli BL21（DE3）來源的NAPRTase基因 pncB（GenBank 登錄號：8113566）和NAD+Syn基因 nadE（GenBank 登錄號：8179982）序列設計引物，以E.coli BL21（DE3）基因組為模板，進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物pncB和nadE經(jīng)過試劑盒純化后，分別連接至克隆載體pMD18-T，轉(zhuǎn)化E.coli JM109，通過氨芐青霉素（Amp）平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子，提質(zhì)粒酶切驗證，并進行測序鑒定。目的基因分別與表達載體pACYCDuet-1連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pACYCDuet-pncB和 pACYCDuet-nadE，轉(zhuǎn)化 E.coli BL21（DE3）得到重組菌E.coli BL21/pACYCDuetpncB和E.coli BL21/pACYCDuet-nadE，通過氯霉素（Cm）平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子。兩基因依次連接載體可得重組質(zhì)粒pACYCDuet-pncB-nadE，轉(zhuǎn)化重組菌E.coli BL21/pETDuet-leudh-fdh，通過Amp/Cm雙抗平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子，驗證正確即得到雙質(zhì)粒共表達重組菌 E.coliBL21/pETDuet-ldhfdh&pACYCDuet-pncB-nadE。

1.4 重組菌的培養(yǎng)及誘導

LB種子培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g/L，酵母粉 5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨 12 g/L，酵母粉 24 g/L，甘油 5 g/L，KH2PO42.31 g/L，K2HPO412.54 g/L。

各重組菌按照1%的接種體積分數(shù)轉(zhuǎn)接入10 mL含相應抗性的種子培養(yǎng)基，37℃、180 r/min下培養(yǎng)10 h。種子液再按照1%的接種體積分數(shù)接入發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃下培養(yǎng)，至菌體OD600為0.3～0.5，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度為 0.5 mmol/L，24 ℃、160 r/min誘導 12 h。

發(fā)酵培養(yǎng)基中NA的添加：NA用蒸餾水配成5 g/L的添加液，通過過濾除菌，并低溫冷凍保藏，在IPTG誘導培養(yǎng)時加入發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.5 酶活測定

4℃下離心發(fā)酵菌液（8 000 r/min離心5 min），并用0.1 mol/L的磷酸緩沖液（pH 7.0）洗滌細胞兩次后，按照10倍濃縮的比例用緩沖液重新懸浮菌體，低溫下對菌體進行超聲破碎，12 000 r/min離心20 min，得到破碎上清粗酶液，用于SDS-PAGE分析及酶活測定。LeuDH和FDH酶活測定分別參考Ansorge[17]和 Zheng 等[18]的報道，NAPRTase 和 NAD+Syn的酶活測定參考Heuser F等[14]的報道。蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度檢測采用Bradford法[19]，以牛血清蛋白BSA為標準品。

1.6 胞內(nèi)NAD（H）質(zhì)量摩爾濃度測定

發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)各E.coli菌株至對數(shù)中后期，取培養(yǎng)液用于測定胞內(nèi)NAD+和NADH質(zhì)量摩爾濃度。分別用酸性和堿性提取液提取樣品中NAD+和NADH，NADH通過PMS的遞氫作用，還原氧化型噻唑藍（MTT）為甲瓚，在570 nm下檢測吸光值；而NAD+可被乙醇脫氫酶還原為NADH，進一步采用MTT還原法檢測。

具體操作步驟參考試劑盒說明書及相關(guān)參考文獻[20-21]。

1.7 細胞濃度及全細胞催化活性的測定

取1 mL菌液用蒸餾水適當稀釋，用紫外分光光度計測稀釋菌液600 nm下的吸光度 （OD600），細胞干重（DCW）可通過以下公式計算[22]：

DCW（g/L）=0.444 2×OD600-0.021

在全細胞轉(zhuǎn)化中，細胞催化活性定義為反應初始時每克干細胞每分鐘催化合成L-苯甘氨酸的量。在全細胞轉(zhuǎn)化反應持續(xù)30 min時取樣，4℃、10 000 r/min下離心5 min以終止反應，上清液經(jīng)稀釋通過HPLC檢測L-苯甘氨酸的產(chǎn)量，用于計算細胞催化活性。

1.8 全細胞法催化合成L-苯苷氨酸

底物苯乙酮酸30 g/L溶于0.1 mol/L pH 7.5的磷酸緩沖液，滴加50%的NH3·H2O使其溶解，同時加入2.4 g甲酸銨及體積分數(shù)5%的甘油，最后加入全細胞催化劑 5 g/L（DCW），轉(zhuǎn)化體系為20 mL，置于磁力攪拌器上進行轉(zhuǎn)化，控制溫度為30℃，pH 8.0，轉(zhuǎn)速160 r/min，反應過程中通過滴加50%的NH3·H2O或20%的甲酸來調(diào)節(jié)反應體系的 pH。L-苯甘氨酸的產(chǎn)量及ee值通過HPLC檢測，具體方法參考Cheng等[23]的檢測方法。

2 結(jié)果與討論

2.1 NAPRTase和NAD合酶基因的克隆及共表達

以大腸桿菌E.coli BL21（DE3）基因組為模板，分別利用引物對P1/P2和P3/P4進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物分別為1 203 bp和828 bp，經(jīng)測序鑒定與NCBI數(shù)據(jù)庫報道pncB和nadE序列一致，通過限制性酶切法將目的基因與表達載體pACYCDuet-1連接，構(gòu)建重組表達載體，酶切及PCR驗證結(jié)果見圖2，證明NAPRTase和NAD+Syn的重組共表達載體pACYCDuet-pncB-nadE構(gòu)建成功。將經(jīng)過誘導培養(yǎng)的各重組菌及原始菌分別超聲破碎并離心后，取上清液進行SDS-PAGE分析及酶活測定。SDSPAGE分析結(jié)果見圖3。

圖2 重組載體pACYCDuet-pncB-nadE酶切及PCR驗證Fig.2 Restriction and PCR validation of recombinant vector pACYCDuet-pncB-nadE

圖3 各重組菌的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of the recombinant strains

在單表達及單質(zhì)粒共表達時NAPRTase和NAD+Syn分別在44 100和30 400處有明顯的表達條帶，在雙質(zhì)粒共表達時，LeuDH、FDH和NAPRTase的相對分子質(zhì)量差異較小，均位于為40 000附近，因此在共表達SDS-PAGE分析時三者無法區(qū)分，NAD+Syn有明顯的表達條帶，說明通過該雙質(zhì)粒表達系統(tǒng)成功實現(xiàn)了 LeuDH、FDH、NAPRTase和NAD+Syn在E.coli中的共表達。分別測各重組菌粗酶液酶活，以原始菌表達空載pETDuet-1作為對照，結(jié)果見表2。重組菌E.coli BL21/pETDuet-ldh-fdh LeuDH酶活為18.78 U/mg，是對照的300多倍，F(xiàn)DH酶活為0.34 U/mg，對照組未檢測到FDH酶活；重組菌 E.coli BL21/pACYCDuet-pncB NAPRTase酶活為 2.12 U/mg，是對照的14倍，重組菌 E.coli BL21/pACYCDuetnadE NAD+Syn酶活為1.24 U/mg，是對照的41倍，說明 NAPRTase和NAD+Syn在 E.coli BL21（DE3）中成功過表達。對重組菌E.coli BL21/pETDuetldh-fdh&pACYCDuet-pncB-nadE的酶活分析發(fā)現(xiàn)，LeuDH和FDH的酶活與單質(zhì)粒菌株E.coli BL21/pETDuet-ldh-fdh的酶活差異不明顯，而NAPRTase及NAD+Syn的酶活卻明顯低于重組菌E.coli BL21/pACYCDuet-nadE，但高于對照組，酶活結(jié)果與蛋白質(zhì)表達情況一致，說明該雙質(zhì)粒表達體系中各酶均可以有效表達，且重組質(zhì)粒pACYCDuet-pncB-nadE的表達對參與轉(zhuǎn)化的LeuDH和FDH的表達影響不大，可能的原因是pET質(zhì)粒的ColE1復制子強度大于pACYC質(zhì)粒的p15A復制子[24]。

表2 不同菌株的酶活Table 2 Enzyme activities in different strains

2.2 NAPRTase和NAD合酶的表達對菌體生長及胞內(nèi)輔酶的影響

各重組菌株經(jīng)37℃活化后，于24℃下誘導培養(yǎng)12 h，首先通過紫外分光光度計測其細胞濃度（OD600），并計算細胞干重，之后收集菌體檢測胞內(nèi)NAD（H）質(zhì)量摩爾濃度，結(jié)果見表3?；騪ncB和nadE在大腸桿菌中的過表達分別使提高胞內(nèi)NAD（H）質(zhì)量摩爾濃度提高了86.3%和59.3%，當兩者共表達時則提高了2.92倍，雙質(zhì)粒重組菌E.coli BL21/pETDuet-ldh-fdh&pACYCDuet-pncB-nadE胞內(nèi)NAD（H）質(zhì)量摩爾濃度較重組菌E.coli BL21/pETDuet-ldh-fdh提高了2.35倍，但是NADH/NAD+的值在各重組菌中波動不大，說明pncB和nadE的過量表達均可促進胞內(nèi)NAD+的合成，使得胞內(nèi)NAD（H）質(zhì)量摩爾濃度顯著提高，并不會造成胞內(nèi)氧化還原態(tài)失衡，且兩者對NAD+合成的促進作用具有累加效應。另外，pncB和nadE過表達的重組菌生物量均不同程度地高于對照菌株，說明胞內(nèi)NAD（H）質(zhì)量摩爾濃度的提高對細胞生長具有一定的促進作用，可能是因為胞內(nèi)NADH質(zhì)量摩爾濃度的提高增加了細胞生長的能量供給。

2.3 煙酸質(zhì)量濃度對菌體生長及胞內(nèi)輔酶的影響

為了進一步提高胞內(nèi)輔酶水平，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量摩爾濃度的NAD+補救合成途徑前體物質(zhì)NA，分別測定重組菌E.coli BL21/pETDuetldh-fdh&pACYCDuet-pncB-nadE細胞濃度與胞內(nèi)NAD+質(zhì)量摩爾濃度，結(jié)果見圖4。當NA質(zhì)量濃度≤20 mg/L時，胞內(nèi)NAD+質(zhì)量摩爾濃度隨NA質(zhì)量濃度的增加而提高，當NA質(zhì)量濃度為20 mg/L，胞內(nèi)NAD+質(zhì)量摩爾濃度最高為25.2 μmol/g DCW，比不添加NA時提高了2.42倍，當NA質(zhì)量濃度繼續(xù)增加時，NAD+質(zhì)量摩爾濃度則逐漸下降，說明過量的NA不利于NAD+的合成。同時考察了NA質(zhì)量濃度對菌體生長的影響，當NA質(zhì)量濃度＜20 mg/L時，菌體量隨NA質(zhì)量濃度的增加而增加，可能與胞內(nèi)NAD+質(zhì)量摩爾濃度的增加相關(guān)，但是當NA質(zhì)量濃度進一步增加時，菌體生長明顯受到抑制，說明過量的NA不利于菌體的生長和胞內(nèi)輔酶水平的提高，因此發(fā)酵培養(yǎng)基中NA的最佳添加質(zhì)量濃度為20 mg/L。同時發(fā)現(xiàn)NA的添加對重組菌E.coli BL21/pETDuet-ldh-fdh胞內(nèi)NAD+質(zhì)量摩爾濃度沒有顯著的提高作用，說明胞內(nèi)輔酶水平的提高是胞外NA的添加和胞內(nèi)pncB、nadE過表達共同作用的結(jié)果。

表 3 各重組菌的生長情況及胞內(nèi)NAD（H）含量測定Table 3 Growth and intracellular NAD（H）concentration of different recombinant strains

圖4 煙酸質(zhì)量濃度對菌體生長及胞內(nèi)NAD+摩爾濃度的影響Fig 4 EffectofNA concentration on growth and intracellular NAD+concentration

2.4 胞內(nèi)輔酶水平對全細胞轉(zhuǎn)化的影響

將重組菌E.coli BL21/pETDuet-ldh-fdh和E.coli BL21/pETDuet-ldh-fdh&pACYCDuet-pncB-nadE分別活化，并分別轉(zhuǎn)接于添加20 mg/L的NA和不添加NA的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行誘導，4℃離心，收集菌體用于L-苯甘氨酸的轉(zhuǎn)化合成，分別檢測不同菌株于不同培養(yǎng)基條件下的細胞催化活性，結(jié)果見圖5（a）。在發(fā)酵培養(yǎng)基中未添加NA時，重組菌E.coli BL21/pETDuet-ldh-fdh&pACYCDuet-pncB-nadE的細胞催化活性比菌株E.coli BL21/pETDuetldh-fdh提高了56.5%，而當發(fā)酵培養(yǎng)中添加20 mg/L NA時，前者的細胞催化活性進一步提高了34.2%，而后者則提高不明顯，這與pncB和nadE的過表達及發(fā)酵培養(yǎng)基中NA的添加對胞內(nèi)輔酶水平的調(diào)節(jié)作用一致，說明胞內(nèi)pncB和nadE的過表達及胞外NA的添加共同通過提高胞內(nèi)輔酶水平來提高細胞催化活性。分別以不添加NA誘導的菌株E.coli BL21/pETDuet-ldh-fdh和添加NA誘導的菌株E.coli BL21/pETDuet-ldh-fdh&pACYCDuet-pncB-nadE為全細胞催化劑，在底物質(zhì)量濃度為30 g/L，細胞質(zhì)量濃度為5 g/L（DCW）的條件下，進行L-苯甘氨酸的轉(zhuǎn)化反應，結(jié)果見圖5（b）。與單質(zhì)粒表達菌株相比，雙質(zhì)粒菌株全細胞轉(zhuǎn)化苯乙酮酸的轉(zhuǎn)化率提高了36.6%，L-苯甘氨酸的產(chǎn)量從16.7 g/L提高至23.9 g/L，說明胞內(nèi)輔酶水平的提高可以顯著提高全細胞催化活性，最終提高全細胞轉(zhuǎn)化效率和L-苯甘氨酸的產(chǎn)量。

3 結(jié) 語

圖5 胞內(nèi)輔酶水平提高對全細胞轉(zhuǎn)化的影響Fig.5 Effect of intracellular cofactor level on the whole cell biotransformation

在重組大腸桿菌中過表達NAPRTase和NAD+Syn的編碼基因pncB和nadE，不僅可以有效地促進胞內(nèi)NAD+的合成，提高胞內(nèi)輔酶水平，并對菌體生長具有一定的促進作用，且兩者對NAD+合成的促進作用具有累加效應。發(fā)酵培養(yǎng)基中添加20 mg/L的NAD+補救合成途徑前體物質(zhì)NA使得胞內(nèi)輔酶水平進一步提高，最終將重組菌E.coli BL21/pETDuet-ldh-fdh&pACYCDuet-pncB-nadE用于全細胞轉(zhuǎn)化合成L-苯苷氨酸，其細胞催化活性和轉(zhuǎn)化率分別比重組菌E.coli BL21/pETDuet-ldh-fdh提高了94%和36.6%，說明在輔酶依賴型的全細胞轉(zhuǎn)化體系中，胞內(nèi)輔酶水平的提高可以有效地提高轉(zhuǎn)化效率。