鐵載體產(chǎn)生菌篩選、鑒定及防治Botryosphaeria dothidea

黎循航， 張言周， 李韻雅， 孫 萌， 管政兵， 蔡宇杰， 廖祥儒*

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌 330045）

葡萄座腔菌屬（Botryosphaeria spp.）真菌能通過修枝、嫁接等破壞植物表皮的方式潛伏性侵染植物，可造成枝干潰瘍流膠，引起植株莖桿的形成層和韌皮部收縮，阻斷樹液循環(huán)，導(dǎo)致樹勢消弱甚至死亡[1]。Botryosphaeria spp.可在桃樹、葡萄樹、梨樹等多種一年生植物和多年生植物寄主上引發(fā)潰瘍病、枯梢病、流膠病、輪紋病等病害，嚴重威脅種植業(yè)的健康發(fā)展[2-3]。目前國內(nèi)常用多菌靈、甲基硫菌靈、丙環(huán)唑等殺真菌劑防治葡萄座腔菌屬引起的病害，使用初期能取得一定的防治效果。但隨著藥物使用時間的增加，病原菌抗藥性逐步增強，防治效果嚴重削弱[4]。加之化學(xué)殺菌劑高毒性、高殘留引發(fā)的食品安全問題，促使人們尋找一種更加安全環(huán)保的替代方法防治葡萄座腔菌造成的病害。在各種生物防治方法中，有關(guān)具有拮抗作用芽孢桿菌的研究備受關(guān)注[5]。

芽孢桿菌屬中的許多種對環(huán)境有益，可作為生物殺蟲劑和生物殺菌劑防治植物病害[6]。芽孢桿菌擁有多種機制拮抗土壤中的病原真菌，產(chǎn)生鐵載體是其中之一[7]。鐵載體是細菌或真菌在限制性鐵離子條件下產(chǎn)生的一類對鐵離子具有特異性親和力的低相對分子質(zhì)量（400 000～1 000 000）的螯合劑，與鐵離子的結(jié)合常數(shù)范圍為1012～1052[8]，能夠有效的降低環(huán)境中生物可利用鐵離子的濃度，抑制根際微生物的生長。鐵載體已經(jīng)在醫(yī)藥、植物病害防治和植物生態(tài)修復(fù)等領(lǐng)域得到應(yīng)用[9-11]。

蜂蜜具有高滲透性、低水活度、高酸性等不利于微生物的生長的特征。蜂蜜中微生物的來源主要與蜜蜂接觸的花粉、植物、蜂房及蜜蜂腸道微生物相關(guān)。研究表明，從蜂蜜分離出的微生物中芽孢桿菌占主導(dǎo)地位[12]，且其中大部分芽孢桿菌展現(xiàn)出廣譜抗菌活性，其抗菌活性物質(zhì)在植物病害防治、食品防腐及臨床治療等方面具有應(yīng)用價值[13-14]，因此蜂蜜可作為一種新的資源用于篩選抗菌物質(zhì)產(chǎn)生菌。由于鐵載體防治葡萄座腔菌的研究鮮為報道，故本研究的目標為：分類鑒定從未加工蜂蜜中分離篩選的細菌；考察各個菌株產(chǎn)生鐵載體的能力；測定鐵載體對葡萄座腔菌的抑制效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蜂蜜 采用產(chǎn)于廣西扶綏地區(qū)未經(jīng)加工的原蜜。

1.1.2 病原真菌 B.dothidea Ces.&De Not ACCC 38026（簡寫為：B.dothidea）：保存于江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室。

1.1.3 培養(yǎng)基 DWA培養(yǎng)基（組分g/L）[15]：酵母膏5.0，酪蛋白胨2.0，甘油1.0，葡萄糖20.0，蔗糖400.0，瓊脂 16.0。

TSB（組分 g/L）[16]：胰蛋白胨 17.0，大豆蛋白胨3.0，葡萄糖 2.5，NaCl 5.0，K2HPO40.3；pH 7.1～7.5。

MM9 培養(yǎng)基 （組分 g/L）[17]：KH2PO40.3，NaCl 0.5，NH4Cl 1.0，NaOH 6.0，PIPES 30.24。 高壓蒸汽滅菌后加入已分別滅菌的30 mL 10 g/dL去鐵酪蛋白氨基酸（用3%8-羥基喹啉三氯甲烷溶液去除鐵離子）， 果糖 2.0 g/L，1 mol/L MgCl21 mL，100 mmol/L CaCl2。

PDA（組分 g/L）培養(yǎng)基：馬鈴薯 200，葡萄糖20，瓊脂 20；pH 自然。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種分離篩選 取25 g蜂蜜與30%的葡萄糖溶液以1∶9比例混合，勻漿器高速混勻2 min，細胞懸液涂布在DWA培養(yǎng)基平板上，25℃培養(yǎng)120 h。

1.2.2 菌種16S rRNA基因分析 依據(jù)文獻 [18]方法提取 DNA，使用通用引物 Fd1（5′-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3′） 和 Rd1 （5′-AAGGAGGTGAT CCAGCC-3′）擴增各菌株的16S rRNA基因序列，生工生物工程（上海）股份有限公司測序。基因序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫，并在線BLAST以檢索最為匹配的序列，使用MEGA 4構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹和分子進化分析[14]。同時，菌株16S rRNA基因序列與http：//www.ezbiocloud.net網(wǎng)站的典型菌株比對，鑒定其具有最高同源性的典型菌株。

1.2.3 CAS檢測 按照文獻[19]方法，采用鉻天青S（CAS）瓊脂擴散法篩選產(chǎn)生鐵載體的菌株。取10 μL在TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期的待測菌株菌懸液點接在CAS瓊脂平板上。菌株鐵載體產(chǎn)量水平用菌落形成的橙色圈直徑和菌落直徑的比值（HC）表示。

1.2.4 鐵載體類型鑒別 將分離純化的菌株接種到種子培養(yǎng)基 （MM9），30℃、200 r/min搖瓶發(fā)酵12 h，按1%的接種體積分數(shù)轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基（MM9），30 ℃、200 r/min 搖瓶發(fā)酵 24 h。 發(fā)酵液10 000 r/min、4 ℃離心 20 min，上清液用 0.22 μm 濾膜過濾除菌備用。

Arnow反應(yīng)：取1 mL發(fā)酵上清液溶液，加入1 mL、0.5 mol/L HCl，1 mL 鉬酸鹽（10 g 亞硝酸鈉和10 g鉬酸鈉溶解于100 mL蒸餾水）和1 mL、1 mol/L NaOH溶液，混勻后靜置1 h以上（待混合溶液顏色穩(wěn)定），測OD510吸光度值，以2，3-二羥基苯甲酸為標品換算鐵載體濃度。

小學(xué)英語情景教學(xué)模式就是創(chuàng)設(shè)一定的情景，讓小學(xué)生在情景中學(xué)習(xí)英語的一種教學(xué)模式。在英語課堂上堅持采用情景教學(xué)法，從而充分體現(xiàn)和發(fā)揮學(xué)生的主體作用，受到較好的教學(xué)效果。小學(xué)生正處于兒童時期，而好動又是兒童的天性。因此，小學(xué)生英語教學(xué)課堂教學(xué)管理是關(guān)鍵。

Csáky反應(yīng)：取1 mL發(fā)酵上清液或鐵載體溶液，加1 mL、3 mol/L H2SO4沸水浴6 h。加入3 mL醋酸鈉溶液，0.5 mL碘溶液，1 mL對氨基苯磺酸溶液。3～5 min后，加入1 mL亞砷酸鹽溶液。加入1 mL α-萘胺溶液，補水至 10 mL，靜置 20～30 min，測OD526吸光度值，以鹽酸羥胺為標準品換算鐵載體濃度[17]。

1.2.5 對植物病原菌B.dothidea的抑菌效果

1）平板擴散法：將B.dothidea菌塊接種在PDA平板上，27℃避光培養(yǎng)15 d，用無菌水洗下孢子。孢子懸液與未凝固的PDA培養(yǎng)基在45℃混勻，孢子數(shù)維持在105～6個/L，倒平板。凝固后用打孔器打孔，分別加入20 μL不同菌株發(fā)酵獲得無菌上清液，27℃避光培養(yǎng)5 d，測量抑菌圈的直徑。菌株鐵載體發(fā)酵液抑菌效果用抑菌圈直徑和孔直徑的比值（HC）表示。

2）鐵載體粗提物對B.dothidea的抑菌效果：按照文獻[17]采用有機溶劑（兒茶酚型鐵載體使用乙酸乙酯，異羥肟酸型使用苯甲醇）法萃取鐵載體。發(fā)酵上清液用20%的有機溶劑萃取3次，合并有機溶劑萃取液，用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至10 mL左右，轉(zhuǎn)至真空干燥箱中除去有機溶劑，獲得鐵載體粗提物。

配置含不同質(zhì)量濃度（0.4 、0.8、1.6、3.2、6.4 g/L）鐵載體粗提物的PDA平板，接種B.dothidea菌塊（d=9 mm）置于PDA平板中央，27℃避光培養(yǎng)5 d。測量不同鐵載體濃度處理平板上病原菌菌落生長直徑（mm），以不含鐵載體的平板為對照，按公式（1）計算不同濃度鐵載體對B.dothidea的抑制率。

將菌絲生長抑制率依據(jù)生物幾率換算表換算成幾率值作為依變量，鐵載體質(zhì)量濃度的對數(shù)為自變量，使用IBM SPSS Statistics 19軟件擬合并建立毒力回歸方程，并從中獲得EC50和EC90的質(zhì)量濃度。試驗每一處理均重復(fù)3次。

1.2.6 菌株的生理生化鑒定 菌株生理生化實驗依據(jù) 《伯杰氏細菌鑒定手冊》[20]，碳源的利用使用API 50 CH碳水化合物試驗條鑒定（bioMérieux，Inc.）[21]。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種分離及系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

為進一步分析菌株的進化地位，采用MEGA 4.0.2軟件，使用鄰接法（Neighbor-Joining method）對基因序列聚類分析和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建，結(jié)果見圖1。H21菌株與B.cereus同簇，歸屬于蠟樣芽孢桿菌。H28、H123和 H125與 Bacillus subtilis subsp 168同簇，歸屬于枯草芽孢桿菌。而包括H47在內(nèi)的其余菌株可能更接近解淀粉芽孢桿菌、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌或暹羅芽孢桿菌，需后續(xù)生理生化方法鑒定。

表1 20株蜜源分離菌株同源性分析Table 1 Homologous analysis of 20 isolated strains

研究發(fā)現(xiàn)，除B.cereus為毒素產(chǎn)生菌外，其它蜂蜜分離株由于能產(chǎn)生抗生素、細菌素和抗真菌物質(zhì)，在農(nóng)業(yè)和醫(yī)療保健上得到一定規(guī)模的應(yīng)用。如從蜂蜜中分離出的B.subtilis[23]和B.amyloliquefaciens[24]能夠有效的抑制造成蜜蜂幼蟲疫情發(fā)生的病原菌Paenibacillus larvae和Ascosphaera apis的生長。

2.2 鐵載體產(chǎn)生菌初篩

鐵載體的測定方法多樣，可依據(jù)鐵載體的化學(xué)性質(zhì)，鐵載體的功能和生物法分別測定。CAS瓊脂平板檢測法[19]是利用鐵載體對鐵的親和能力高于鉻天青S，使染料的顏色從藍色變成橙色，因而成為最為廣泛的用于鐵載體產(chǎn)生菌的鑒定方法。圖2（a）中20個菌株分別點接在CAS瓊脂平板上，菌落生長過程中的鐵載體滲入瓊脂培養(yǎng)基，競爭性螯合鐵離子，使染料脫色，形成橙黃色透明圈。圖2（b）中HC值為變色圈直徑與菌落直徑的比值，HC值的大小間接反應(yīng)菌落鐵載體產(chǎn)量的高低。20個菌株中變色圈HC值高于1.5的共有12株，其中編號為H47、H98、H114和H124的4個菌株的 HC值高于2.5，表明這4個菌株鐵載體產(chǎn)生量可能最大。

圖1 分離自蜂蜜的20株菌株16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of the 20 isolated strains by MEGA4.0.2

圖2 20株分離菌株產(chǎn)鐵載體形成變色圈及變色圈HC值Fig.2 Color-changing ring on CAS agar plate formed by 20 isolated strains and HC values

2.3 鐵載體類型鑒別

鐵載體的類型及產(chǎn)量通過化學(xué)法測定。Csáky反應(yīng)用于異羥肟酸型鐵載體檢測，Arnow反應(yīng)用于兒茶酚型鐵載體檢測。采用MM9培養(yǎng)基分別對H47、H98、H114和 H124 4株菌株液體深層發(fā)酵，發(fā)酵上清液采用Csáky反應(yīng)和Arnow反應(yīng)測定不同鐵載體濃度，結(jié)果見表2。H47菌株Arnow反應(yīng)呈陽性，Csáky反應(yīng)呈陰性，表明H47菌株所產(chǎn)鐵載體含有兒茶酚型供體基團。H114菌株Csáky反應(yīng)呈陽性，Arnow反應(yīng)呈陰性，表明H114菌株所產(chǎn)鐵載體含有異羥肟酸型供體基團。H98和H124菌株Csáky反應(yīng)和Arnow反應(yīng)均呈陽性，表明這兩個菌株產(chǎn)生了同時含有兒茶酚型和異羥肟酸型供體基團的混合型鐵載體。

微生物鐵載體的產(chǎn)量受環(huán)境中鐵離子濃度影響，高濃度的鐵離子會抑制鐵載體的產(chǎn)生。研究鐵載體產(chǎn)量的培養(yǎng)基通常嚴格限制鐵離子的濃度，從表3可以看出，蜂蜜分離的4株菌株的鐵載體產(chǎn)量顯著高于相同培養(yǎng)基發(fā)酵的Xylella fastidosa菌株[25]的產(chǎn)量。

表2 菌株產(chǎn)鐵載體分類Table 2 Siderophore-type classification

表3 不同微生物菌株鐵載體產(chǎn)量Table 3 Siderophore production by diverse microorganism

2.4 鐵載體抑制病原菌作用

2.4.1 發(fā)酵液對病原菌的抑制效果 鐵載體能夠捕獲植物根際周圍的鐵離子，使鐵離子濃度低至Fusarium oxysporum，Pythium ultimum等植物病原菌生長所需，從而抑制作物枯萎病和根腐病的發(fā)生[28-29]。由于鐵載體對B.dothidea抑制效果的研究鮮有報道，作者嘗試利用菌株鐵載體發(fā)酵液考察其對B.dothidea的拮抗作用。將B.dothidea的孢子懸液和PDA液體培養(yǎng)基在45℃混勻，倒平板，凝固后打孔，分別加入H47、H98、H114和H124菌株過濾除菌的發(fā)酵液，避光培養(yǎng)。圖3（a）表明4個分離菌株的發(fā)酵液對B.dothidea的生長均具有拮抗作用，圖3（b）說明鐵載體的濃度與拮抗效果正相關(guān)。拮抗效果的出現(xiàn)可能與鐵載體的競爭性的與病原菌生長所需的鐵離子結(jié)合，抑制病原菌孢子的萌發(fā)相關(guān)[30]。

圖3 4株分離菌株對葡萄座腔菌的抑制效果及HC值Fig.3 Inhibitory effects of four isolated strains to B.dothidea and HC values

2.4.2 鐵載體粗提物對病原菌的抑菌效果 為探究鐵載體對B.dothidea的抑菌效果，分別選取H47菌株產(chǎn)生的兒茶酚型鐵載體和H114菌株產(chǎn)生異羥肟酸型鐵載體進行抑菌研究。不同類型鐵載體對B.dothidea菌絲生長的抑制率見表4。兒茶酚型鐵載體對 B.dothidea的毒力方程 y=1.432x+0.578，EC50和EC90分別為0.395 g/L和3.099 g/L，異羥肟酸型鐵載體對B.dothidea的毒力方程y=1.744x+0.063，EC50和 EC90分別為 0.921 g/L 和 5.001 g/L。類似研究表明，1 mg/mL鐵載體能抑制Rhizoctonia solani菌落的生長，且能溶解菌絲體[31]。植物病原菌的抑制機理可能主要是鐵載體競爭結(jié)合鐵離子而抑制霉菌孢子的萌發(fā)和早期萌發(fā)管的生長[32]。

依據(jù)抑制作用，推測H47菌株產(chǎn)生的兒茶酚型鐵載體和H114菌株產(chǎn)生異羥肟酸型鐵載體均能有效抑制B.dothidea的生長，且兒茶酚型鐵載體的抑制效果優(yōu)于異羥肟酸型鐵載體。由此可見，H47菌株和H114菌株具有成為生物防治劑用于葡萄座腔菌病害防治的可能性。

表4 H47和H114菌株產(chǎn)鐵載體對B.dothidea抑制作用Table 4 Inhibitory effects of siderophore produced by strain H47 and H114 to B.dothidea

2.5 菌體生理生化鑒定

為明確H47和H114菌株的分類信息，生理生化實驗被用于鑒定菌株，結(jié)果見表5。H47和H114菌株生理生化特性非常相似，根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》并結(jié)合API 50CH碳水化合物試驗條測試，表明H47和H114菌株屬于解淀粉芽孢桿菌。

表5 H47和H114菌株生理生化Table 5 Morphological and biochemical characterization of strain H47 and H114

3 結(jié) 語

作者從蜂蜜中分離出20株菌株，分別與B.cereus ATCC 14579T、B.siamensis KCTC 13613T、B.tequilensis KCTC 13622T和B.methylotrophicus CBMB205T 4種典型菌株具有最高的同源性。采用CAS 檢測法表明，20 菌株中 H47、H98、H114 和H124 4個菌株菌產(chǎn)鐵載體，且HC值均高于2.5。Csáky反應(yīng)和Arnow反應(yīng)結(jié)果表明，H47菌株所產(chǎn)鐵載體為兒茶酚型（106 μmol/L），H114 菌株所產(chǎn)鐵載體為異羥肟酸型（91 μmol/L），H98 和 H124 菌株所產(chǎn)鐵載體為混合型（75 μmol/L 和 68 μmol/L）。 4種菌株鐵載體發(fā)酵液對B.dothidea Ces.&De Not ACCC 38026均有抑制效果。H47菌株和H114菌株為解淀粉芽孢桿菌，其鐵載體粗提物對B.dothidea Ces.&De Not ACCC 38026的毒力回歸方程分別為y=1.432x+0.578，（EC50和 EC90分別為 0.395 g/L 和3.099 g/L）和y=1.744x+0.063 （EC50和EC90分別為0.921 g/L和5.001 g/L）。所以可以推測兒茶酚型鐵載體和異羥肟酸型鐵載體對葡萄座腔菌的孢子萌發(fā)及菌絲體的生長抑制效果，H47和H114菌株具有發(fā)展成為生物防治劑的潛力。