精子印記基因甲基化和胎停育關(guān)系的病例對(duì)照研究

劉志朝 楊 佳 王 莉 強(qiáng) 梅

山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 (太原 ，030001)

胎停育是指孕早期胚胎發(fā)育自然終止及胚胎丟失的病理過(guò)程[1]。其發(fā)生與環(huán)境、內(nèi)分泌、染色體、免疫系統(tǒng)及心理衛(wèi)生等因素有密切關(guān)系，但仍有50%的病因尚未闡明[1]。不良妊娠結(jié)局的表觀遺傳學(xué)異常研究已成為近年來(lái)生殖與發(fā)育研究的前沿領(lǐng)域[2]。動(dòng)物研究表明印記基因的敲除與胚胎發(fā)育有關(guān)[3]。作為一種表觀遺傳學(xué)修飾，DNA甲基化可以控制印記基因的表達(dá)[4]。精子的印記基因的甲基化修飾又能穩(wěn)定遺傳給子代[5]。故本研究通過(guò)分析胎停育與精子印記基因H19、Peg3、Meg3甲基化之間的關(guān)系，探索胎停育發(fā)生的可能表觀遺傳學(xué)機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

2015年3-4月和2016年3-4月，使用方便抽樣的方法選擇本院生殖中心行孕前檢查的已婚男性。入選標(biāo)準(zhǔn)：22～60歲已婚男性。排除標(biāo)準(zhǔn)：家族有遺傳病史、不育史者；精液<0.5ml)。通過(guò)自行設(shè)計(jì)的問(wèn)卷，包括人口學(xué)特征、生活習(xí)慣和心理健康狀況等。由經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的調(diào)查員對(duì)入選者進(jìn)行面對(duì)面訪談，簽署知情同意書(shū)。男性就診者禁欲3～7d，手淫法收集全程精液。因?yàn)榻?jīng)費(fèi)有限，從信息比較全的對(duì)象中用方便抽樣的方法選取442份精液樣本進(jìn)行DNA提取及甲基化檢測(cè)。以此為基線，從隨訪檔案記錄或通過(guò)電話隨訪其配偶妊娠情況及結(jié)局。截至2018年3月，共得到394個(gè)隨訪結(jié)果。其中胎停育35例，作為胎停育組；配偶分娩正?；町a(chǎn)兒144例，從中通過(guò)1:1配對(duì)選取35例作為對(duì)照組。匹配條件：年齡相差不超過(guò)6歲；體質(zhì)量指數(shù)(BMI)相差不超過(guò)6 kg/m2；吸煙情況一致；飲酒情況一致；受孕方式一致。正?；町a(chǎn)兒：足月(孕周≥37周)、新生兒出生體重正常(≥2500～≤4000g)和無(wú)先天畸形。吸煙：≥1支/d，且持續(xù)1年以上。飲酒：≥1次/周，每次≥2兩，且持續(xù)1年以上。受孕方式包括自然妊娠和輔助生殖(IVF/ICSI)。

1.2 精子DNA中H19、Peg3和Meg3印記基因甲基化水平的檢測(cè)

采用異硫氰酸胍法[6]提取精子DNA；用EZ Methylation Gold-Kit試劑盒 (Zymo Research, Orange, CA, 美國(guó))進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理；用PyroMark PCR Kit試劑盒(Qiagen，CA, 美國(guó))進(jìn)行PCR擴(kuò)增；再經(jīng)單鏈PCR產(chǎn)物純化、測(cè)序引物雜交等步驟后使用PSQ96 焦磷酸測(cè)序儀 ( Biotage AB, Uppsala, 瑞典)及 PyroMark Gold Q96 kit試劑盒(Qiagen, CA, 美國(guó))對(duì)H19、Peg3、Meg3的目的片段進(jìn)行甲基化水平的檢測(cè)。本研究選取H19、Peg3和Meg3的DMR進(jìn)行分析，分析的CpGs位點(diǎn)數(shù)目分別為H19 7個(gè)、Meg3 8個(gè)、Peg3 8個(gè)。PCR引物序列見(jiàn)表1；PCR擴(kuò)增后的電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

表1 PCR 擴(kuò)增的引物信息

*生物素標(biāo)記的引物

(DNA分子量標(biāo)記條帶從下至上依次為100bp，150bp，300bp，450bp)圖1 印記基因H19、Peg3和Meg3的PCR擴(kuò)增后的電泳圖

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用IBM SPSS 24.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用配對(duì)t檢驗(yàn)對(duì)兩組間年齡和BMI進(jìn)行比較；使用K-S檢驗(yàn)對(duì)DNA的H19、Meg3、Peg3平均甲基化水平及各位點(diǎn)甲基化水平進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，除H19的CpG3甲基化服從正態(tài)分布(P=0.2)，其余均不服從正態(tài)分布(P<0.05),使用Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)分析配對(duì)的兩組精子印記基因甲基化水平的差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 基本特征比較

研究對(duì)象共35對(duì)，年齡25～45歲，配對(duì)年齡相差3歲以內(nèi)27對(duì)(77%)，年齡相差4～6歲8對(duì)(23%)，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.233,P=0.817)。體質(zhì)指數(shù)(BMI)相差3kg/m2以內(nèi)31對(duì)(89%)，相差4～6kg/m2共4對(duì)(11%)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.113,P=0.911)。吸煙21對(duì)(60%)。飲酒8對(duì)(23%)；自然妊娠19對(duì)(54%)，輔助生殖(IVF/ICSI)15對(duì)(46%)。

2.2 印記基因平均甲基化水平比較

兩組精子的H19、Peg3和Meg3甲基化水平比較無(wú)差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 印記基因各CpG位點(diǎn)甲基化水平比較

由于平均甲基化水平由各CpG位點(diǎn)組成，平均甲基化水平可能掩蓋某些CpG位點(diǎn)間的變化，因此將對(duì)照組和胎停育組精子的H19的7個(gè)、Peg3的7個(gè)和Meg3的8個(gè)CpG位點(diǎn)分別進(jìn)行Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)，胎停育組的Meg3的CpG3位點(diǎn)和CpG6位點(diǎn)甲基化水平顯著性減少(P<0.05)。其余CpG位點(diǎn)組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。去除極端值(n=4)后，發(fā)現(xiàn)胎停育組的Meg3的CpG3位點(diǎn)還是顯著減少(P<0.05)，而Meg3的CpG6位點(diǎn)甲基化水平組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。提示精子Meg3的CpG3位點(diǎn)甲基化水平的改變與胎停育發(fā)生有關(guān)聯(lián)。見(jiàn)表3。

表2 兩組印記基因平均甲基化水平比較[%，M(P25，P75)]

表3 兩組印記基因各CpG位點(diǎn)甲基化水平比較[% ， M(P25，P75)]

*兩組比較P<0.05

3 討論

有研究指出印記基因H19與胎盤(pán)的形成和胚胎發(fā)育有關(guān)，敲除H19會(huì)導(dǎo)致胚胎死亡[3]。目前，關(guān)于人類H19基因與精液質(zhì)量的研究相對(duì)較多，如李建波等[7]發(fā)現(xiàn)H19甲基化水平與少精子癥和精子濃度有關(guān)，H19可能通過(guò)影響精子質(zhì)量影響胚胎發(fā)育。因此本研究通過(guò)匹配受孕方式減少精子質(zhì)量對(duì)結(jié)果的影響。Ankolkar等[8]的研究發(fā)現(xiàn)反復(fù)自發(fā)性流產(chǎn)組中研究對(duì)象精子的H19印記基因甲基化水平低于對(duì)照組。然而，在本次選用的人群樣本研究中，未觀察到胎停育與精子H19印記基因甲基化水平有關(guān)。胎停育發(fā)生的病因尚未明了，其與遺傳和環(huán)境關(guān)系極為復(fù)雜，需要進(jìn)一步研究揭示。

Peg3是一個(gè)父系表達(dá)的印記基因，有研究顯示，敲除小鼠Peg3基因可導(dǎo)致胎盤(pán)異常、生殖能力及輔助行為缺陷、代謝異常和自主吸奶等行為缺陷[9]。以往的動(dòng)物研究中敲除Peg3的DMR的雄鼠與正常雌鼠結(jié)合后，胚胎死亡與低出生體重小鼠的發(fā)生率上升[10]。胎盤(pán)Peg3 mRNA的高表達(dá)可能使巨大胎兒的發(fā)生率上升[11]。但是本次選用的人群樣本的研究中，未觀察到胎停育組與對(duì)照組精子Peg3印記基因甲基化水平的差異 。可能是人群研究更為復(fù)雜，有待于進(jìn)一步探討。

Miyoshi等[12]在2000年發(fā)現(xiàn)小鼠Glt2的人類同系物，命名為Meg3。雌鼠此基因的敲除導(dǎo)致圍產(chǎn)期小鼠死亡和骨骼肌缺陷，表明小鼠Meg3在胚胎發(fā)育中有重要作用[13]。本次選用的人群樣本研究中，發(fā)現(xiàn)胎停育組Meg3的CpG3位點(diǎn)甲基化水平顯著低于對(duì)照組，說(shuō)明精子Meg3甲基化水平與胚胎發(fā)育有關(guān)。前期研究表明，Meg3的DMR低甲基化會(huì)導(dǎo)致Meg3表達(dá)升高，例如，培養(yǎng)肝癌細(xì)胞的過(guò)程中加入甲基化抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-Aza-CdR) 后Meg3的表達(dá)顯著增加[14]。而Meg3的表達(dá)與細(xì)胞增殖呈負(fù)相關(guān)，Meg3高表達(dá)抑制細(xì)胞增殖[15]。因此Meg3的低甲基化可能通過(guò)使Meg3的表達(dá)升高而抑制胚胎細(xì)胞的增殖與分化，從而影響胚胎正常發(fā)育。

就樣本量來(lái)說(shuō)，因?yàn)殛P(guān)于印記基因甲基化水平對(duì)胎停育的危險(xiǎn)性的研究很少，尤其是某些印記基因的甲基化水平高或者低是否是胎停育的危險(xiǎn)因素的結(jié)論尚不能判定，OR值難以估計(jì)，所以樣本量不易計(jì)算。參考先前類似研究的樣本量，如Ankolkar等[8]的研究有23個(gè)病例和23個(gè)對(duì)照，Vidal等[16]的研究中有19個(gè)病例和60個(gè)對(duì)照，因此本研究用35個(gè)病例和35個(gè)對(duì)照進(jìn)行分析。同時(shí)，本研究利用可供選擇的對(duì)照多的優(yōu)勢(shì)(n=144)，對(duì)一些因素進(jìn)行了匹配，減小了混雜因素的影響，并且提高了研究效率。但是匹配的變量與所研究的變量之間的交互作用未能考慮，這是本研究的局限性。表觀遺傳學(xué)改變?nèi)菀资墉h(huán)境因素的影響，因此進(jìn)一步的研究應(yīng)該對(duì)同一個(gè)時(shí)間內(nèi)研究對(duì)象的精液樣本中印記基因甲基化水平與相關(guān)的環(huán)境改變和發(fā)育狀況之間的相關(guān)性作比較。