核酸檢測技術在無償獻血者血液篩查中的應用

陶剛 李曉燕

[摘要] 目的 分析探討核酸技術在無償獻血者血液篩查中應用的必要性。方法 方便選取該血站2017年6月—2018年6月共20 000人份標本進行研究，樣本檢驗采用ELISA（酶聯(lián)免疫吸附實驗）法，對于ELISA單項陰性的標本再進行核酸檢測，觀察無償獻血者HbsAg、抗-HCV、抗-HIV檢測的陽性率從而評價核酸檢測的價值。結果 經過血清學ELISA檢測共260份陽性樣本（1.31%），ELISA檢測陰性的標本經過核酸檢測有20例陽性（0.10%）。結論 通過核酸檢測發(fā)現(xiàn)血清學ELISA檢測合格的血液仍舊存在輸血傳播疾病的風險，主要是HBV（乙型肝炎），因此核酸檢測技術在獻血者血液篩查中的應用能夠最大程度的防止輸血疾病的傳播，血液篩查的質量明顯提升，提高了獻血的安全性。

[關鍵詞] 無償獻血；血液篩查；核酸檢測；應用

[中圖分類號] R19 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2019）01（b）-0183-03

[Abstract] Objective To analyze the necessity of application of nucleic acid technology in blood screening of unpaid blood donors. Methods A total of 20，000 specimens from June 2017 to June 2018 were convenient selected for the study. Samples were tested by ELISA （enzyme-linked immunosorbent assay）. Nucleic acid detection was performed on ELISA single negative samples to observe unpaid blood donors. The positive rate of HbsAg， anti-HCV， and anti-HIV detection thus evaluates the value of nucleic acid detection. Results A total of 260 positive samples （1.31%） were detected by serological ELISA. The negative samples by ELISA were positive for 20 cases（0.10%） after nucleic acid detection. Conclusion The risk of transfusion-transmitted diseases is still found in the blood of serological ELISA test by nucleic acid test， mainly HBV （hepatitis B）. Therefore， the application of nucleic acid detection technology in blood screening of blood donors can prevent blood transfusion diseases to the greatest extent spreading， the quality of blood screening is significantly improved， and the safety of blood donation is improved.

[Key words] Unpaid blood donation； Blood screening； Nucleic acid detection； Application

臨床中預防和控制輸血相關的傳染病非常重要，現(xiàn)在我國供血機構病毒血清學檢測模式為HbsAg、抗-HCV、抗-HIV聯(lián)合ELISA檢測，這種標志物間接檢測雖然極大地降低了輸血疾病傳播的風險，但是有較長的“窗口期”， 從感染病原開始至能夠某種檢測方法檢測到該病原存在的一段時間為“窗口期”[1-2]。試劑越來越優(yōu)化最大限度的縮短了“窗口期”仍存在免疫沉默性感染、病毒滴度、變異，輸血傳染病時有發(fā)生[3]。NAT為病毒核酸擴增技術，現(xiàn)在不少發(fā)達國家將NAT運用在獻血者血液篩查中，國內少數(shù)血站初步應用，為了進一步分析NAT在血液篩查中的必要性，方便選取該站20 000份樣本進行研究的具體報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

方便選取該血站共20 000人份標本進行研究，所有無償獻血者均資源參與此次研究并且簽署知情同意書，均符合《獻血者健康檢查的要求》[4]的相關標準。20 000名無償獻血者中11 242人為男性，8 758人為女性，年齡18～50歲，平均（25.32±5.34）歲。采血需要使用3支EDTA抗凝管，血量5 mL，1600 r/min低溫離心15 min，放置2～8℃冰箱留樣，3支試管中2支帶分離膠，其中1支需要無熱源、無酶。分離血漿需要在24 h內，48 h后血清學篩查只能用不帶分離膠的試管內樣本，NAT檢測使用帶分離膠、無酶、無熱源的留樣試管，另外一管進行標本保存。

1.2 方法

所有血液樣本檢驗采用兩種試劑進行ELISA法檢測，任何一種試劑有反應都需要進行雙孔復查，對于其中任何一孔有反應均判定為不合格。留取標本當天進行ELISA檢測，第2天待查標本進行核酸檢測，所有操作均在生物安全柜內進行。對于ELISA單項陰性的標本再進行核酸檢測，1份0.96 mL混樣池由6份原始樣本各160 μL匯集成，混樣不足6份的由加樣系統(tǒng)自動補足0.96 mL，對混樣池進行核酸提取，聚合酶鏈式反應45個循環(huán)。所有操作均按照SOP操作規(guī)程進行，核酸檢測技術結果報告：陰性結果混樣池的所有標本報陰性結果，結果有反應性混樣池需要進行拆分檢測（原始樣本0.96 mL單樣本檢測），拆分的單樣本檢測有反應報陽性結果。

ELISA檢測試劑：HbsAg試劑生產廠家為北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司和廈門新創(chuàng)，抗-HCV生廠廠家為北京萬泰和廈門新創(chuàng)，抗-HIV試劑生廠廠家為廈門新創(chuàng)和法國伯樂。所有試劑均為合格產品，通過國家食品藥品監(jiān)督管理部門批準，使用嚴格遵循SOP的操作規(guī)程。核酸檢測試劑：華益美生產的乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒（1型）核酸檢測試劑盒，采用PCR-熒光法使用儀器：全自動酶免分析儀、全自動酶免加樣儀（Tecan），全自動核酸提取儀（華益美），全自動擴增分析儀（華益美）。

1.3 觀察指標

觀察無償獻血者HbsAg、抗-HCV、抗-HIV檢測的陽性率并進行分析，評價核酸檢測的價值。

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析，正態(tài)計量資料用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，樣本率的比較采用χ2檢驗；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 所有標本血清學ELISA檢測的結果

經過血清學ELISA檢測共260份陰性標本（1.31%），結果見表1。

2.2 所有標本中血清學ELISA陰性樣本核酸檢測結果

ELISA檢測陽性的標本經過核酸檢測有20份陽性（10.10%），見表2。

3 討論

《血站技術操作規(guī)程》（2012版）規(guī)定將HBV、HCV、HIV核酸檢測方法納入到經血傳播感染的檢測方法常規(guī)模式中，血液篩查中的核酸檢測技術主要包括兩種，一種為TMA，另一種為Taqman PCR技術[5]。TMA應用較為廣泛，無償獻血者采用單人份核酸檢測技術后分析的靈敏度明顯提升，技術較為成熟和客觀。聯(lián)檢試劑HBV DNA達10.0 IU/mL，HCV RNA達3.0 IU/mL，HIV-1 RNA達45.0 IU/mL；鑒別試劑d-HBV達8.5 IU/mL，d-HCV達3.2 IU/mL，d-HIV-1達50.0 IU/mL[6]。

90年代，歐美一些發(fā)達國家開始在獻血人群中使用核酸檢測技術對HBV、HCV和HIV進行篩查，證明了可以有效降低血液疾病傳播的風險，安全性較好[7]。但不同地區(qū)病毒流行率差異較為明顯，可受多種因素影響如檢測標本數(shù)量差異、ELISA試劑選擇差異、核酸檢測技術試劑或設備差異等[8]。通過此次研究得出結果：經過血清學ELISA檢測共260份陽性樣本（1.31%），ELISA檢測陰性的標本經過核酸檢測有20例陽性（0.10%）。所采用的的核酸檢測技術篩查系統(tǒng)具有較高的林敏性，但是混合性樣品檢測的模式降低了系統(tǒng)本身的靈敏度導致核酸檢測技術篩查系統(tǒng)靈敏度高于混合檢測核酸檢測技術篩查系統(tǒng)靈敏度[9]。原因可能為核酸檢測技術可能存在較高假陽性概率，也可能在取樣方面存在誤差[10]。核酸聯(lián)檢和鑒別試劑具有較高靈敏度，單項檢測的陽性標本病毒分布不規(guī)則，在載量方面有缺陷，所有可能每次取量不同影響檢測的結果[11]。通過研究發(fā)現(xiàn)，HbsAg血液篩查之后仍然存在傳播的主要因素是OBI（隱匿性乙型肝炎病毒）的獻血者的存在，OBI病毒無法有效檢出HbsAg但在核酸檢測技術中會呈現(xiàn)陽性，說明輸血的風險是發(fā)生OBI[12]。實際工作中ALT是無償獻血者獻血前的基本篩查項目，一般ALT不合格標本會進行報廢處理，其異常結果的原因不一定是HCV和HBV感染，也可能由其他病理性原因引起，因此實效性不理想[13]。

血清學的抗原抗體檢測具有較長的窗口期，ELISA試劑檢測HbsAg的“窗口期”為56 d，抗-HCV為82天，抗-HIV為22 d，而NAT檢測HBV的“窗口期”縮短至25 d，HCV為59 d，HIV為11 d，明顯縮短了病毒的窗口期，有效檢測出ELISA漏檢的病毒早期感染的標本[14]。我國是HBV感染概率較高的地區(qū)，雖然酶免試劑質量提高降低了輸血后感染疾病的風險，但是ELISA“窗口期”的漏檢仍舊為影響血液安全性的關鍵，ELISA陰性的血液仍舊有可能漏檢導致輸血安全隱患，因此引進NAT檢測確保輸血安全非常必要[15]。NAT技術是新型的輸血傳播傳染病因子的篩查方法，研究表明NAT可有效提升輸血安全系數(shù)，其反復性和靈敏度較為理想，WHO核酸檢測標準稀釋之后HCV、HIV檢測結果顯示以100%標準檢出50 IU/mLHCV和50 IU/mLHIV-1的核酸，混合檢測單份血液檢測的靈敏度達到了95%。同時病毒核酸在血液標本的采集、儲存、運輸、檢測過程中不會降解，需要在4 h內分離血漿、2～8℃保存、72 h內完成檢測，若特殊情況無法完成檢測需要在-20℃環(huán)境下凍存，但是一份樣本僅可以進行一次凍融，說明外界因素不會影響檢測的結果。在規(guī)范性操作和實驗室質量管理標準中核酸檢測技術達到了臨床檢驗技術的相關標準。國內的研究機構做了一些血液殘余風險評估發(fā)現(xiàn)NAT篩查得到的HBV結果各地不一，仍舊需要更多的數(shù)據積累，需要擴大標本檢測數(shù)量，為核酸檢測技術提供量化的、科學的證據。

綜上所述，通過核酸檢測發(fā)現(xiàn)血清學ELISA檢測合格的血液仍舊存在輸血傳播疾病的風險，主要是HBV，因此核酸技術在獻血者血液篩查中的應用能夠最大程度的防止輸血疾病的傳播，血液篩查的質量明顯提升，提高了輸血的安全性。

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（收稿日期：2018-10-19）