C-erbB-2 與KRAS 基因在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其相互關(guān)系

潘理會(huì) 李育莊 李春輝

1承德醫(yī)學(xué)院血流變研究室（河北承德067000）；承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2神經(jīng)內(nèi)科，3病理科（河北承德067000）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)生、發(fā)展與多種基因突變及其所構(gòu)成的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)控異常有關(guān)，其中表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）介導(dǎo)的RAS/RAF/MAPK 信號(hào)傳導(dǎo)通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用［1］。表皮生長(zhǎng)因子受體-2（C-erbB-2）與EGFR 同源，二者具有高度相似的生物學(xué)特性；KRAS 是RAS 基因家族中與人類腫瘤關(guān)系最為密切的一種表現(xiàn)形式，為C-erbB-2 信號(hào)通路下游的重要效應(yīng)分子。目前，有關(guān)處在同一信號(hào)通路上的C-erbB-2與KRAS 在腫瘤中的表達(dá)及與其與腫瘤生物學(xué)行為的關(guān)系倍受關(guān)注，本研究分別采用FISH 法和實(shí)時(shí)熒光定量-PCR 法檢測(cè)CRC 組織中C-erbB-2 基因的擴(kuò)增和KRAS 基因的突變，為判斷患者預(yù)后及靶向治療的潛在靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2012年12月至2016年10月間承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院行結(jié)直腸癌根治術(shù)并經(jīng)病理證實(shí)的CRC 蠟塊標(biāo)本共238 例（所選取標(biāo)本術(shù)前均未經(jīng)任何放化療治療且均具備完整病理資料）。在238例CRC 中，男124例，女114例；≤58歲89 例，＞58 歲149 例（中位年齡58 歲）；右半結(jié)腸癌39 例，左半結(jié)腸癌52 例，直腸癌147 例；非黏液腺癌201 例，黏液腺癌37 例；高分化52 例，中分化154 例，低分化32 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移175 例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移63 例；Duke′s 分期A 期47 例，B 期82 例，C期71 例，D 期38 例；浸潤(rùn)黏膜層及黏膜下層17 例，浸潤(rùn)肌層74 例，浸潤(rùn)漿膜層147 例。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 FISH 檢測(cè)法切取石蠟切片3 μm 厚，置硅烷玻片上65 ℃過(guò)夜，常規(guī)脫蠟至水化；50 ℃下30%酸性亞硫酸鈉處理切片30 min；200 μg/mL 蛋白酶K 37 ℃消化30 min；-20 ℃預(yù)冷的70%、85%、100%乙醇梯度脫水2 min，再丙酮浸泡脫脂2 min；探針混合液73 ℃預(yù)熱5 min 滴加10 μL 于玻片上42 ℃雜交過(guò)夜，甲酰胺洗滌，自然干燥；滴加15 μL DAPI 復(fù)染，靜置20 min，熒光鏡檢。

1.2.2 FISH 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)癌細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光信號(hào)，C-erbB-2 基因位于核內(nèi)，呈紅色熒光信號(hào)；17 號(hào)染色體著絲粒位于核內(nèi)，呈綠色熒光信號(hào)。隨機(jī)計(jì)數(shù)30 個(gè)腫瘤細(xì)胞，計(jì)算紅綠比值。比值≥2.2 判斷為（＋），即C-erbB-2 基因擴(kuò)增；比值＜1.8判斷為（－），即C-erbB-2 基因未擴(kuò)增，比值介于1.8 ～2.2 之間，則選擇增加計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目或重做實(shí)驗(yàn)來(lái)確定判最終結(jié)果。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR切取石蠟切片10 μm厚5 片，常規(guī)脫蠟水化，1 張用于HE 染色鏡下觀察形態(tài)，其余用于DNA 提取，顯微鏡下觀察HE 切片選取腫瘤成分超過(guò)70%區(qū)域刮入裂解液，充分混均；1 300 r/min離心10 min，吸取上清。紫外分光光度計(jì)測(cè)量DNA 質(zhì)量和濃度。從試劑盒中取出陽(yáng)性質(zhì)控品和Tag 酶室溫融化，混均后2 000 r/min 離心15 s；分別向45 μL待測(cè)樣品DNA（濃度約2 ng/μL）、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照（NTC）中加入2.25 μL Tag 酶，混均后2 000 r/min 離心15 s，放在PCR 管架上，輕輕揭開(kāi)反應(yīng)條管蓋，將混好的DNA 樣品依次取5 μL 加入PCR 反應(yīng)條中，蓋緊管蓋，移至PCR 儀檢測(cè)。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：預(yù)變性95 ℃5 min，1 個(gè)循環(huán)；95 ℃25 s、64 ℃20 s、72 ℃20 s，15 個(gè)循環(huán)；93 ℃25 s、60 ℃35 s、72 ℃20 s，31 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系為25 μL。在第3 階段60 ℃時(shí)收集信號(hào)，保存文件。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)以無(wú)模板對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)設(shè)定閾值。沒(méi)出現(xiàn)擴(kuò)增曲線或Ct 值為0 的標(biāo)本為（-）；出現(xiàn)擴(kuò)增曲線且Ct ≤26.0 的標(biāo)本為（+）；26.0 ≤Ct ≤28.0 的標(biāo)本為可疑陽(yáng)性，需重復(fù)檢測(cè)。

1.3 試劑與儀器石蠟組織DNA 提取試劑盒及C-erbB-2 基因擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒與KRAS 12、13 密碼子基因突變檢測(cè)試劑盒由福建廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)。Mx3000P 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為美國(guó)Stratagene 公司產(chǎn)品。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRC 中C-erbB-2 擴(kuò)增及與病理特征的關(guān)系238 例CRC 中有4 例發(fā)生C-erbB-2 擴(kuò)增，總擴(kuò)增率為1.7%（4/238）。C-erbB-2 擴(kuò)增與年齡、性別、腫瘤位置、組織學(xué)分類、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)、Duke′s 分期及浸潤(rùn)深度等病理參數(shù)，組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1 和圖1、2。

圖1 CRC 組織中C-erbB-2 FISH 檢測(cè)發(fā)生擴(kuò)增Fig.1 Amplification of C-erbB-2 in FISH of colorectal cancer

圖2 CRC 組織中C-erbB-2 FISH 檢測(cè)未發(fā)生擴(kuò)增Fig.2 Non amplification of C-erbB-2 in FISH of colorectal cancer

表1 CRC 中C-erbB-2 擴(kuò)增及KRAS 突變與病理參數(shù)的關(guān)系Tab.1 C-erbB-2 amplification in the colorectal cancer and the relationship between the KRAS mutations and pathological characteristics

2.2 CRC 中KRAS 突變及與病理參數(shù)的關(guān)系238 例CRC 中有88 例發(fā)生KRAS 突變（圖3），總突變率為32.3%（88/238）。KRAS 突變與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Duke′s 分期明顯相關(guān)，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組突變率分別為47.4%（83/175）、36.5%（23/63）（P = 0.043），組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在Duke′s 分期A、B、C、D 期突變率分別為23.4%（11/47）、31.7%（26/82）、42.3%（30/71）、50.0%（19/38）（P = 0.019），組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與其他臨床病理特征比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

圖3 KRAS 基因突變圖Fig.3 The amplification plots of KRAS gene mutation

2.3 CRC 中C-erbB-2 擴(kuò)增與KRAS 突變間的相關(guān)性相關(guān)分析顯示，C-erbB-2 擴(kuò)增與KRAS 突變沒(méi)有相關(guān)關(guān)系（P = 0.076，表2），但238 例CRC 中有4 例C-erbB-2 擴(kuò)增，在4 例C-erbB-2 擴(kuò)增中有1例KRAS 突變，3 例未發(fā)生突變，二者突變重疊率為25%，在234 例C-erbB-2 擴(kuò)增中有85 例KRAS 突變，149 例未發(fā)生突變，二者重疊比例為57%，可見(jiàn)，二者存在正相關(guān)關(guān)系。

表2 CRC 中C-erbB-2 擴(kuò)增與KRAS 突變的相關(guān)性Tab.2 The amplification of C-erbB-2 and the mutations value of KRAS in colorectal cancer

3 討論

原癌基因C-erbB-2 它定位于17 號(hào)染色體q11-21 上，其結(jié)構(gòu)同EGFR 蛋白的氨基酸排列順序具有50%左右的同源性，因此C-erbB-2 與EGFR 二者具有相同的蛋白激酶活性，并在控制細(xì)胞得分裂及分化中起著非常重要的作用；KRAS 基因當(dāng)其發(fā)生異常改變時(shí)，則導(dǎo)致細(xì)胞的過(guò)度持續(xù)生長(zhǎng)，并且能阻止細(xì)胞自我毀滅的發(fā)生，由于細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路的改變，當(dāng)KRAS 基因發(fā)生突變時(shí)，該基因就發(fā)生了永久活化，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的改變，使細(xì)胞過(guò)度增殖、失控而導(dǎo)致癌的發(fā)生。C-erbB-2 是一種細(xì)胞來(lái)源的原癌基因是EGFR 家族成員之一，其激活后可通過(guò)不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分裂及凋亡的調(diào)控［1-2］，有學(xué)者研究證實(shí)C-erbB-2 基因的擴(kuò)增程度在CRC中比正常大腸黏膜高，并且C-erbB-2 基因的擴(kuò)增程度在CRC 中隨著CRC 組織學(xué)分級(jí)程度的加重C-erbB-2 基因擴(kuò)增也逐漸的向高拷貝轉(zhuǎn)移，組織學(xué)分級(jí)越低的CRC，C-erbB-2 基因擴(kuò)增越強(qiáng)，由此說(shuō)明C-erbB-2 基因的擴(kuò)增可以在一定程度上反映著CRC 的惡性轉(zhuǎn)化以及其生物學(xué)的行為，也就是說(shuō)CRC 的惡性轉(zhuǎn)化以及其生物學(xué)的行為有賴于C-erbB-2 基因的活化［1，3］，另外，也有學(xué)者研究證實(shí)，CRC 患者C-erbB-2 基因的擴(kuò)增在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者明顯強(qiáng)于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，也就是說(shuō)CRC 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與C-erbB-2 基因擴(kuò)增有密切關(guān)系，CRC中C-erbB-2 基因擴(kuò)增使CRC 侵襲、轉(zhuǎn)移的能力增強(qiáng)，提示CRC 患者預(yù)后不良，這也揭示了C-erbB-2基因的擴(kuò)增有可能成為CRC 患者預(yù)后參考指標(biāo)，具有重要的理論意義和實(shí)際意義［4-6］。本研究的結(jié)果顯示C-erbB-2 基因的擴(kuò)增與CRC 患者的性別、年齡、CRC 的部位、CRC 分期、CRC 分化程度、CRC 組織學(xué)類型、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及Duke′s分期無(wú)關(guān)，這個(gè)結(jié)果提示C-erbB-2 基因的擴(kuò)增未參與CRC 的分化及侵襲轉(zhuǎn)移，與患者的預(yù)后無(wú)關(guān)，導(dǎo)致上述結(jié)果的原因可能是C-erbB-2 基因的擴(kuò)增對(duì)CRC 預(yù)后的影響較弱，并且CRC 本身預(yù)后較差，使C-erbB-2 基因的擴(kuò)增對(duì)CRC 預(yù)后影響表現(xiàn)的不夠穩(wěn)定，得出這樣的結(jié)果，因此如果C-erbB-2 基因發(fā)生擴(kuò)增，那么患者就可用靶向藥進(jìn)行分子靶向治療，表明C-erbB-2 基因的擴(kuò)增是應(yīng)用分子靶向治療的主要依據(jù)，C-erbB-2 基因的擴(kuò)增不能作為分子靶向治療獨(dú)立的指標(biāo)，同時(shí)C-erbB-2 基因的擴(kuò)增也不能作為判斷CRC 的預(yù)后的單一指標(biāo)，與腫瘤發(fā)生有關(guān)的RAS 基因家族成員有3 種，即分別定位在11、12 和1 號(hào)染色體上的HRAS、KRAS、NRAS 基因，KRAS 基因又稱p21 基因，其是編碼為21 kD 的RAS 蛋白。在RAS 基因家族中，KRAS 基因與人類癌癥的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系最為密切，它就如一個(gè)分子開(kāi)關(guān)：當(dāng)其在正常生理狀態(tài)時(shí)可調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的傳導(dǎo)路徑；當(dāng)其發(fā)生異常改變時(shí)，則導(dǎo)致細(xì)胞的過(guò)度持續(xù)生長(zhǎng)，并且能阻止細(xì)胞自我毀滅的發(fā)生，由于細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路的改變KRAS 基因可以是野生型或突變型，在正常生理情況下，細(xì)胞受到外界刺激后激活EGFR 等信號(hào)通路，野生型KRAS 被活性的EGFR 短暫活化，活化的KRAS 激活該信號(hào)傳導(dǎo)通路中的下游信號(hào)組件蛋白，使KRAS 迅速的失活，在正常情況下KRAS 激活或失活效應(yīng)是受控的。KRAS 突變型蛋白可導(dǎo)致蛋白功能異常，在無(wú)EGFR 活化信號(hào)刺激的情況下仍處于激活狀態(tài)，那么它的功能狀態(tài)則不可控，就導(dǎo)致腫瘤的持續(xù)增殖，繼而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，KRAS 是RAS 家族成員之一，參與C-erbB-2 信號(hào)通路的傳導(dǎo)，KRAS 基因是最常見(jiàn)的突變基因之一［7-13］，KRAS 基因突變與腫瘤生物學(xué)行為的關(guān)系，各家報(bào)道眾說(shuō)不一，分歧較大。王璇等［14］報(bào)道CRC 中KRAS 突變率為38.8%，與性別及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。MANNAN 等［15］報(bào)道CRC 中KRAS 突變率高達(dá)50%，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期顯著相關(guān)性，也有研究認(rèn)為KRAS 突變比較頻繁，在患者的結(jié)腸腫瘤中時(shí)常出現(xiàn)突變［16-17］，沙如拉等［18］和常江等［19］報(bào)道CRC 中KRAS 突變率分別為37.8%和36.6%，與所有臨床病理指標(biāo)均無(wú)明顯相關(guān)，本研究與上述部分結(jié)果相符。本研究顯示CRC中KRAS 總突變率為32.3%；與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Duke′s 分期顯著相關(guān)，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中KRAS 突變率分別為47.4%和36.5%，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這一結(jié)果表明KRAS 在腫瘤細(xì)胞向癌旁及系膜組織的局部侵潤(rùn)及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，KRAS 突變率的高低可作為臨床評(píng)估腫瘤侵襲性、轉(zhuǎn)移力、患者預(yù)后的重要參考指標(biāo)；在Duke′s 分期的A、B、C、D 期KRAS 突變率依次為23.4%、31.7%、42.3%、50.0%，兩兩間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，KRAS 突變?cè)礁?，浸?rùn)深度越深，這一結(jié)果表明KRAS 在腫瘤細(xì)胞向腸壁浸潤(rùn)的過(guò)程中起著一定作用。

C-erbB-2 和KRAS 同 為RAS/RAF/MAPK 信 號(hào)通路的上下游調(diào)控因子，C-erbB-2 可通過(guò)與家族中其他受體酪氨酸激酶形成異源二聚體發(fā)生磷酸化，募集下游信號(hào)蛋白SH2 和Grb2，活化調(diào)控分子SOS，隨之依次活化RAS 和RAF，最后級(jí)聯(lián)激活MAPK，將傳導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)入核內(nèi)活化轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增殖、異常分化、引發(fā)癌變［20-21］。從理論上講C-erbB-2 和KRAS 具有協(xié)同作用。關(guān)于CRC中C-erbB-2 和KRAS 表達(dá)相關(guān)性的研究未見(jiàn)報(bào)道，本研究對(duì)C-erbB-2 擴(kuò)增和KRAS 突變進(jìn)行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)二者表達(dá)并無(wú)相關(guān)關(guān)系；然而在本研究中檢出的4 例C-erbB-2 擴(kuò)增中有發(fā)生1 例KRAS 突變，不難看出隨著樣本量的增大過(guò)表達(dá)量也會(huì)相應(yīng)增加，表明C-erbB-2 擴(kuò)增和KRAS 突變可發(fā)生在同一腫瘤組織中，且呈正相關(guān)，推測(cè)C-erbB-2 自身作用可能對(duì)CRC 的發(fā)生、發(fā)展影響不大，而通過(guò)激活下游信號(hào)分子進(jìn)而刺激信號(hào)傳導(dǎo)通路的持續(xù)活化而發(fā)揮作用，也就是說(shuō)兩者基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著協(xié)同作用。對(duì)C-erbB-2 和KRAS 之間的調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步的臨床研究和綜合資料的論證分析。