翼狀胬肉與瞼裂斑組織病理結構及磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶、含IQ模序的GTP酶活化蛋白1表達的對比研究

董舒婷 彭娟 沙翔垠 姚達強 戴棐曌 毛雁

廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院（廣州510260）

翼狀胬肉主要表現(xiàn)為局部球結膜纖維血管呈三角形增生并侵犯角膜［1］，輕則影響美觀，重則影響視力。主要采用手術的方式治療［2］，發(fā)病機制較復雜，目前尚不明確。

瞼裂斑是位于瞼裂區(qū)鼻側(cè)或顳側(cè)的結膜的良性的病變，呈黃色，輕微隆起［3］，一般無不適，通常不予處理，部分人因影響美觀或反復出現(xiàn)眼紅、眼癢等炎癥癥狀而手術切除。與翼狀胬肉相比，瞼裂斑的范圍一般僅局限于結膜，通常不會侵犯角膜。目前國內(nèi)外關于瞼裂斑發(fā)病機制的研究較少，有學者認為翼狀胬肉可由瞼裂斑演變而來。

翼狀胬肉與瞼裂斑是與紫外線暴露相關常見的眼表疾病，均有較高的發(fā)病率，發(fā)病機制均尚不明確。研究表明，翼狀胬肉中細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號通路異常激活，可能與翼狀胬肉上皮細胞的增殖相關，p-ERK 即磷酸化的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶。含IQ 模序的GTP 酶活化蛋白1（IQGAP1）是一種GTP 酶活化蛋白，參與多種重要的細胞活動，如細胞骨架結構、細胞間的黏附、細胞遷移和信號轉(zhuǎn)導。本研究通過比較翼狀胬肉與瞼裂斑組織病理改變的差異，以及p-ERK、IQGAP1在翼狀胬肉和瞼裂斑組織中的表達差異，探討兩者的發(fā)病機制的異同。旨在加深對翼狀胬肉、瞼裂斑兩種常見的眼表疾病的認識，以及探討兩者的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2018年1～6月在廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院眼科行翼狀胬肉切除聯(lián)合結膜瓣轉(zhuǎn)位加角膜緣干細胞移植術的翼狀胬肉患者及行單純瞼裂斑切除術的瞼裂斑患者，前者為8 例8 眼的單眼翼狀胬肉標本，男2 例，女6例。后者為8 例8 眼的單眼瞼裂斑標本，男3 例，女5 例。8 例正常結膜組織取自眼庫中捐獻者死后24 h 內(nèi)正常眼的非角膜緣結膜組織。患者術前均簽署知情同意書，所有試驗均遵循赫爾辛基宣言，并通過醫(yī)院倫理委員會審查。

1.2 翼狀胬肉及瞼裂斑病理組織觀察將翼狀胬肉組、瞼裂斑組、正常結膜組3 組織標本固定在40%多聚甲醛，常規(guī)脫水、石蠟包埋，作4 μm 連續(xù)切片，進行HE 染色，在光學顯微鏡下觀察標本各層次組織結構，對翼狀胬肉與瞼裂斑病理表現(xiàn)進行比較：（1）先在低倍鏡（× 100）下確定上皮層區(qū)域，然后在高倍鏡（× 400）下隨機觀察10 個區(qū)域，計數(shù)每個區(qū)域的上皮層數(shù)，取其平均值作為該例患者上皮層數(shù)量；（2）觀察翼狀胬肉和瞼裂斑上皮細胞較正常結膜的形態(tài)改變；（3）血管數(shù)量計數(shù)：先在低倍鏡（× 100）下觀察整個標本的大體輪廓，確定血管密度較高的區(qū)域，然后在高倍鏡（× 400）下隨機觀察5 個視野并計數(shù)其血管數(shù)量，取其平均值作為該視野的血管數(shù)量。

1.3 免疫組織化學S-P 法檢測將手術切除的組織立即置于磷酸鹽緩沖液（PBS）中，用PBS 沖洗組織3 次，常規(guī)置于4%多聚甲醛中固定。標本常規(guī)石蠟包埋，以4 μm 連續(xù)切片后，按試劑說明進行S-P 法免疫組化染色。其中抗原修復采用高壓修復，二氨聯(lián)苯胺（DAB）顯色5 min，蘇木素輕度復染，脫水，透明，封片，光鏡觀察。以PBS 代替一抗孵育，作為陰性對照，以已知有p-ERK、IQGAP1蛋白表達的切片做陽性對照。結果判定：表達的強弱均以免疫組化評分為準。HIS=結合陽性細胞百分比（a）×陽性細胞染色強弱（b）。每張切片在高倍顯微鏡（× 400）隨機選擇5 個視野，計算每個視野陽性細胞率，取平均值為該標本的陽性細胞百分比。陽性細胞百分比（a）分4 個等級：無陽性細胞為0 級，陽性細胞占1% ～10%為1 級，占11%～50%為2 級，占51%～80%為3 級，占81%～100%為4 級。陽性細胞染色強弱（b）分4 個等級：陰性為0 級，弱陽性為1 級，中度陽性為2 級，強陽性為3 級。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。各項測量指標用均數(shù)±標準差表示，每一項指標均經(jīng)過方差齊性檢驗及正態(tài)性檢驗。樣本比較采用完全隨機設計的方差分析，所有資料的相關性分析采用Spearman 相關分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HE 染色結果

2.1.1 正常結膜組織正常結膜分為上皮層和基質(zhì)層。上皮層近角膜緣處為復層鱗狀上皮，排列整齊；基質(zhì)層由疏松的結締組織構成，其間有散在的毛細血管，少量成纖維細胞、淋巴細胞及中性粒細胞（圖1A）。

2.1.2 翼狀胬肉病理學改變翼狀胬肉上皮細胞較正常結膜明顯增多。體部上皮細胞呈多邊形，大小均勻；而頭部上皮細胞明顯增加，上皮的基底細胞層可見大量核漿比較大的細胞，排列緊密?；|(zhì)層主要由膠原纖維、成纖維細胞和大量新生血管構成（圖1C）。

2.1.3 瞼裂斑病理學改變瞼裂斑分為上皮層和基質(zhì)層。瞼裂斑上皮細胞與結膜相比無明顯增多，基質(zhì)層主要為無定型、嗜伊紅染色的玻璃樣變性或顆粒樣變性的膠原物質(zhì)，其間點綴著斷裂、卷曲或碎片狀的彈力樣纖維（圖1B）。

圖1 正常結膜、瞼裂斑、翼狀胬肉的病理切片（HE×600）Fig.1 Pathological section of normal conjunctiva，pinguecula and pterygium（HE×600）

2.1.4 翼狀胬肉與瞼裂斑的比較（1）上皮層數(shù)比較：翼狀胬肉上皮層數(shù)較瞼裂斑及結膜上皮層數(shù)增多，差異有統(tǒng)計學意義。（2）血管數(shù)量的比較：翼狀胬肉血管數(shù)量明顯多于瞼裂斑及結膜血管數(shù)量，差異有統(tǒng)計學意義。瞼裂斑血管數(shù)量較結膜血管數(shù)量輕度增加，差異有統(tǒng)計學意義（表1）。

2.2 免疫組織化學結果

2.2.1 p-ERK 的表達情況p-ERK 光鏡下主要表達于細胞質(zhì)中，少數(shù)于細胞核中，陽性染色棕黃色或褐色顆粒。p-ERK 在翼狀胬肉、瞼裂斑、結膜組織中均表達，主要表達在上皮層，基底細胞層表達最強，其中在翼狀胬肉中表達最強，瞼裂斑次之，結膜最弱。翼狀胬肉、瞼裂斑組織中p-ERK 表達水平明顯高于正常結膜（表2、圖2）。

2.2.2 IQGAP1 的表達情況IQGAP1 在翼狀胬肉及瞼裂斑中表達，主要在上皮層表達，其中基底細胞中表達最強。IQGAP1 在結膜組織中未見陽性表達。IQGAP1 光鏡下主要表達于細胞膜和胞漿著色，陽性染色為棕黃色或褐色顆粒。翼狀胬肉、瞼裂斑組織中IQGAP1 表達水平明顯高于正常結膜（表2、圖3）。

表1 翼狀胬肉、瞼裂斑、結膜中上皮層數(shù)及血管數(shù)量Tab.1 The amount of epithelial layer and blood vessels in pterygium，pinguecula and conjunctiva ±s

表1 翼狀胬肉、瞼裂斑、結膜中上皮層數(shù)及血管數(shù)量Tab.1 The amount of epithelial layer and blood vessels in pterygium，pinguecula and conjunctiva ±s

分組結膜瞼裂斑翼狀胬肉F 值P 值上皮層數(shù)4.4±0.699 5.4±1.504c 10±4.137b 13.47＜0.05血管數(shù)量5.4±0.894 6.8±0.837c 12.2±1.483b 52.27＜0.05

表2 結膜、瞼裂斑、翼狀胬肉中p-ERK 及IQGAP1 的表達量Tab.2 The expression of P-ERK and IQGAP1 in conjunctiva，pinguecula and pterygium ±s

表2 結膜、瞼裂斑、翼狀胬肉中p-ERK 及IQGAP1 的表達量Tab.2 The expression of P-ERK and IQGAP1 in conjunctiva，pinguecula and pterygium ±s

注：a，瞼裂斑與結膜相比，P ＜0.05；b，翼狀胬肉與結膜相比，P ＜0.05；C，瞼裂斑與翼狀胬肉相比，P ＜0.05

分組結膜瞼裂斑翼狀胬肉F 值P 值p-ERK 免疫組化評分1.8±0.447 9.6±0.548a 10.8±1.643b 111.938＜0.05 IQGAP1 免疫組化評分1.0±0.000 5.0±0.000ac 10.2±1.789b 99.75＜0.05

圖2 正常結膜、瞼裂斑、翼狀胬肉中p-ERK 的表達（SP×600）Fig.2 The expression of p-ERK in normal conjunctiva，pinguecula，and pterygium（SP×600）

圖3 正常結膜、瞼裂斑、翼狀胬肉組織中IQGAP1 的表達（SP×600）Fig.3 The expression of IQGAP1 in normal conjunctiva，pinguecula and pterygium（SP×600）

2.2.3 相關性分析在翼狀胬肉中，p-ERK 與IQGAP1 的表達呈正相關（r=0.982，P＜0.05）。

3 討論

翼狀胬肉與瞼裂斑均為常見眼表疾病。兩者的發(fā)病機制尚不明確。兩者均為球結膜上的病變，兩者在病理組織結構存在相似之處。具體兩者發(fā)病機制差別的相關研究較少。

本研究發(fā)現(xiàn)，翼狀胬肉及瞼裂斑上皮的基底細胞，均為形態(tài)規(guī)則，核漿比大的細胞，顯示是增殖活躍的細胞。與正常結膜相比，翼狀胬肉上皮層數(shù)與瞼裂斑上皮層數(shù)增加。翼狀胬肉與瞼裂斑相比，上皮層數(shù)明顯增加。說明翼狀胬肉上皮細胞的增殖較瞼裂斑活躍，瞼裂斑上皮細胞也存在增殖潛能。既往的研究顯示翼狀胬肉與瞼裂斑上皮均存在增殖潛能，翼狀胬肉上皮增殖能力較強［3-4］。與本研究的結果一致。本研究同時發(fā)現(xiàn)，翼狀胬肉基質(zhì)層中血管數(shù)量也較瞼裂斑基質(zhì)層的血管數(shù)量明顯增加。翼狀胬肉上皮的增殖較瞼裂斑活躍，基質(zhì)層血管數(shù)量明顯增多，是翼狀胬肉通常侵犯角膜，而瞼裂斑通常原位生長的病理學基礎。兩者的基質(zhì)深層均可見大片的膠原變性。翼狀胬肉與瞼裂斑病理結構有一定的相似性，提示兩者存在部分相同的發(fā)病機制。

ERK 是MAPK 家族成員之一，屬于絲氨酸/蘇氨殘基的蛋白激酶，是細胞信號傳導的重要途徑。ERK 磷酸化后即p-ERK，進入細胞核調(diào)節(jié)相關基因的轉(zhuǎn)錄，參與細胞生長、發(fā)育、分裂及細胞間的功能同步等多種生理過程［5］。本研究發(fā)現(xiàn)，與結膜相比，p-ERK 在翼狀胬肉中表達增加。研究顯示，翼狀胬肉中增殖標志物如Ki-67、PCNA、cyclin D1等表達上調(diào)［6］。ERK信號通路與細胞增殖密切相關，在多種細胞中調(diào)控細胞增殖活動［7-9］。翼狀胬肉上皮細胞及血管內(nèi)皮中p-ERK 表達，提示上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞中ERK 信號通路激活，可能跟上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞的增殖活動增加相關。本研究還發(fā)現(xiàn)，與結膜相比，p-ERK 在瞼裂斑中表達增加。研究顯示，瞼裂斑上皮具有增殖潛能［3］。筆者推測，與翼狀胬肉相似，ERK 信號通路同樣參與瞼裂斑上皮細胞及血管內(nèi)皮細胞增殖?？赡苡捎趦烧呔鶠槁∑鹩谘郾淼募膊。掀ぜ毎┞对诳諝庵?，從而引起兩者的上皮鱗狀化生。提示兩者發(fā)病機制存在一定的相似性。有可能是疾病發(fā)展不同階段，或者是某個通路的激活的導致疾病的轉(zhuǎn)化。

IQGAP1 是一種GTP 酶活化蛋白，調(diào)節(jié)多種重要的細胞活動，如細胞骨架結構、細胞間的黏附、細胞遷移和信號轉(zhuǎn)導。對細胞的正常發(fā)育和疾病過程都產(chǎn)生重要影響［10-11］。還參與細胞的增殖和侵襲的調(diào)控［12-13］。本研究首次發(fā)現(xiàn)，IQGAP1 在結膜幾乎未見陽性表達，而在翼狀胬肉頭部上皮全層均呈陽性表達，在基底細胞及鄰近基底細胞的上層細胞表達最強；在翼狀胬肉體部，IQGAP1 主要表達在基底細胞中。既往的研究表明，IQGAP1參與細胞的增殖的調(diào)控，筆者推測IQGAP1 對翼狀胬肉細胞增殖有一定的作用。本研究也發(fā)現(xiàn)，在瞼裂斑組織中也可見陽性表達，與翼狀胬肉體部的表達相似。筆者進一步對翼狀胬肉與瞼裂斑的IQGAP1 的表達量行統(tǒng)計學分析，顯示翼狀胬肉的IQGAP1 表達量較瞼裂斑增加?；准毎麑雍休^多的干細胞，高增殖潛能是干細胞的特點之一，在損傷等條件下較其他細胞具有更高的增殖潛能。筆者推測在紫外線等致病因素損傷角膜緣基底細胞，激活基底細胞的IQGAP1，使角膜緣基底細胞較其他細胞有更高增殖潛能，從而導致翼狀胬肉與瞼裂斑的發(fā)生。

本研究顯示，翼狀胬肉中p-ERK 與IQGAP1 的表達量具有正相關性。多項研究表明，ERK 信號通路的激活依賴IQGAP1 的活化［14-17］。筆者推測，IQGAP1 在紫外線等致病因素的作用下活化，激活了ERK 信號通路，使細胞異常分化與增殖。而這一作用主要體現(xiàn)在翼狀胬肉上皮細胞的基底細胞中。同時也可能在瞼裂斑的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，在翼狀胬肉及瞼裂斑中，ERK 信號通路激活可能依賴IQGAP1 的活化參與兩者的發(fā)病過程，提示兩者發(fā)病機制有一定的相似之處。由于樣本量不足，筆者計劃在增加樣本量的前提下，對翼狀胬肉及瞼裂斑中p-ERK、IQGAP1 表達進一步作定量研究。以期找到新的治療翼狀胬肉和瞼裂斑的靶點。