鋅離子螯合修飾河蜆抗氧化肽的工藝

劉晶晶，徐蘊(yùn)桃，林秋逸，賁蕾潔，韓曜平，王雪鋒

常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院（常熟 215500）

河蜆（Corbicula fluminea）是一種環(huán)境適應(yīng)能力極強(qiáng)的雙殼類軟體水生生物，遍及全國(guó)各地，分布十分廣泛，而且資源豐富，產(chǎn)量極高。河蜆通常棲居在咸淡水、淡水水域內(nèi)，它們的生長(zhǎng)速度快，繁殖能力強(qiáng)，含有種類齊全的氨基酸，其脂肪品質(zhì)高，富含EPA和DHA，還含有鈣、鈉、鉀、鎂、鐵、鋅、銅和錳等多種無(wú)機(jī)鹽[1]。但目前我國(guó)對(duì)河蜆的加工利用率較低，主要以鮮食作為食用途徑，也有一小部分被制成蜆干、咸蜆、罐頭等廉價(jià)食品，與一些沿海國(guó)家如日本、韓國(guó)相比，我國(guó)的河蜆深加工技術(shù)還很落后，沒(méi)有體現(xiàn)出其應(yīng)有的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2]。

近年來(lái)興起的蛋白質(zhì)水解物與鋅離子螯合，其原理是兩個(gè)氨基酸分子挾制著一個(gè)鋅離子，形成超穩(wěn)固的螯合狀態(tài)，然后利用氨基酸通路使機(jī)體同時(shí)吸收鋅和氨基酸，能很大程度上增加其吸收率[3]。多肽鋅螯合物具有抗氧化能力、抗菌效果、降血脂和降血糖等功能[4]，包括鰱魚(yú)、帶魚(yú)、羅非魚(yú)等水產(chǎn)品以及金針菇、紅豆、大豆等農(nóng)副產(chǎn)品，其多肽金屬螯合物已被證明具有不同程度的抗氧化性[5-10]，因此，螯合物具有極大的研究潛能和廣闊的應(yīng)用市場(chǎng)。但是以河蜆蛋白為原料進(jìn)行酶解反應(yīng)再利用螯合技術(shù)制備多肽鋅的研究還寥寥無(wú)幾。試驗(yàn)將河蜆抗氧化肽與鋅離子螯合，探究其最佳的螯合工藝條件。旨在開(kāi)發(fā)新型抗氧化劑、鋅補(bǔ)充劑，拓展河蜆的深加工途徑、提高河蜆產(chǎn)品的品質(zhì)和附加值，為河蜆螯合物的研究提供了有力的理論依據(jù)，為河蜆的研究開(kāi)辟了一個(gè)新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

河蜆肉，宿遷楠景水產(chǎn)食品有限公司；中性蛋白酶（蛋白酶活力不小于60 000活力單位/g），上海奧宇生物科技有限司公司；七水合硫酸鋅、無(wú)水乙醇、雙硫腙、鹽酸、氫氧化鈉、EDTA、氨水緩沖液、鉻黑T和溴化鉀，均為分析純。

EL 104型電子分析天平，梅特勒托利多儀器（上海）有限公司；UV-754型紫外分光光度計(jì)，上海市精密科學(xué)儀器制造有限公司；BCD-216 TDXZA型超低溫冰箱，海爾股份有限責(zé)任公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州市國(guó)華電器制造公司；ALPHA 1-4型冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Martin Christ凍干機(jī)制造公司；TGL-20 M型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙市湘儀有限責(zé)任公司；PHS-2 F型數(shù)字pH計(jì)，上海市精密科學(xué)儀器制造有限責(zé)任公司；DF-101 S集熱式恒溫磁力攪拌器，常州市萬(wàn)合儀器制造有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 河蜆抗氧化肽的制備[11]

速凍河蜆肉于常溫的流水下解凍洗去泥沙等雜質(zhì)，擠干稱量。在高速組織搗碎機(jī)中添加2倍質(zhì)量的純凈水進(jìn)行勻漿，在勻漿液中加入3.76%的中性蛋白酶。于55.36 ℃的水浴鍋內(nèi)酶解4 h，酶解完成后煮沸20 min。冷卻后以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心30 min，上清液進(jìn)行冷凍干燥，即可制得河蜆抗氧化肽，冷藏待用。

1.2.2 鋅離子螯合修飾河蜆抗氧化肽的單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取1.2.1小節(jié)制備的河蜆抗氧化肽，配制河蜆抗氧化肽質(zhì)量濃度為10 mg/mL，與一定量的硫酸鋅在不同的pH和溫度條件下螯合，用磁力攪拌的方式構(gòu)建螯合環(huán)境，螯合結(jié)束后，在4 000 r/min的條件下離心20 min，加入無(wú)水乙醇洗滌直至雙硫腙檢測(cè)上清液不變色（4～5次），分別測(cè)定螯合率，考察各因素對(duì)螯合率的影響。

1.2.2.1 pH的篩選

稱取適量的河蜆抗氧化肽粉末配制成10 mg/mL溶液，調(diào)節(jié)不同的pH（4，5，6，7和8）。在河蜆抗氧化肽與鋅離子質(zhì)量比為2.0︰1，螯合時(shí)間為45 min，螯合溫度為45 ℃的條件下螯合，螯合結(jié)束后測(cè)定其螯合率，從而篩選最合適的pH。

1.2.2.2 抗氧化肽與鋅離子質(zhì)量比的篩選

稱取適量的河蜆抗氧化肽粉末配制成10 mg/mL溶液，在pH為6，固定多肽液的濃度，按照多肽與鋅離子的質(zhì)量比分別為1.0︰1，1.5︰1，2.0︰1，2.5︰1，3.0︰1稱取相應(yīng)的七水合硫酸鋅，在螯合時(shí)間為45 min，螯合溫度為45 ℃的條件下螯合，螯合結(jié)束后測(cè)定其螯合率，從而篩選最合適的質(zhì)量比。

1.2.2.3 螯合時(shí)間的篩選

稱取適量的河蜆抗氧化肽粉末配制成10 mg/mL溶液，在pH為6，抗氧化肽與鋅離子質(zhì)量比為2.0︰1的條件下，調(diào)節(jié)不同的螯合時(shí)間（15，30，45，60和75 min）。螯合溫度為45 ℃，螯合結(jié)束后測(cè)定其螯合率，從而篩選最合適的螯合時(shí)間。

1.2.2.4 螯合溫度的篩選

稱取適量的河蜆抗氧化肽粉末配制成10 mg/mL溶液，在pH為6，抗氧化肽與鋅離子質(zhì)量比為2.0︰1，螯合時(shí)間為45 min的條件下，調(diào)節(jié)不同的螯合溫度（15，30，45和60 ℃），螯合結(jié)束后測(cè)定其螯合率，確定最佳的螯合溫度。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 8.0.6來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理，以pH（A）、抗氧化肽與鋅離子質(zhì)量比（B）、螯合時(shí)間（C）和螯合溫度（D）為自變量，螯合率（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)抗氧化肽-Zn2+螯合的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，其編碼水平和因素見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

1.2.4 傅立葉紅外光譜分析

分別取適量固體樣品河蜆抗氧化肽和1～1.5 mg螯合物，加入干燥好的KBr作稀釋劑，樣品與溴化鉀的比約為1︰200，放進(jìn)瑪瑙研缽中，在瑪瑙研缽里進(jìn)行研磨，直至樣品粒子成細(xì)小而均勻狀態(tài)，再壓至透明薄片，將薄片放入樣品架，用傅立葉變換紅外光譜儀在4 000～400 cm-1光譜范圍進(jìn)行掃描，得到兩組光譜，進(jìn)行定性分析。

1.2.5 螯合率的測(cè)定方法

參考文獻(xiàn)[12]進(jìn)行改動(dòng)。螯合率按式（1）進(jìn)行計(jì)算：

式中：E為螯合率，%；C為EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol·L-1；V1為滴定螯合態(tài)鋅離子所消耗的EDTA溶液體積，mL；V0為滴定鋅離子的總量所消耗的EDTA溶液體積，mL。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均需進(jìn)行不得少于3次的平行試驗(yàn)以降低誤差，用Microsoft Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 pH的篩選試驗(yàn)

從圖1可以看出，隨著反應(yīng)溶液pH的增加，河蜆抗氧化肽螯合率逐漸升高，當(dāng)反應(yīng)pH增加到6時(shí)，抗氧化肽的螯合率達(dá)到最大；繼續(xù)增加反應(yīng)pH，螯合率又呈下降趨勢(shì)。蛋白質(zhì)具有最適的pH范圍，只有在適當(dāng)?shù)膒H環(huán)境中才能保持穩(wěn)定的狀態(tài)。反應(yīng)體系pH過(guò)低，河蜆抗氧化肽的結(jié)構(gòu)易破壞，導(dǎo)致螯合率的降低；反應(yīng)體系的pH在7～8時(shí)，蛋白質(zhì)達(dá)到其等電點(diǎn)，溶解度最小，因而體系中抗氧化肽濃度降低，螯合率降低。因此，選擇pH 6.0作為螯合反應(yīng)的較適pH。

圖1 pH對(duì)螯合效果的影響

2.1.2 抗氧化肽與鋅離子質(zhì)量比的篩選試驗(yàn)

由圖2可知，螯合率隨著抗氧化肽與鋅離子質(zhì)量比的增加而升高，到2.0︰1時(shí)達(dá)到最大值。原因可能是由于抗氧化肽與鋅離子質(zhì)量比太低，河蜆抗氧化肽鋅螯合物無(wú)法合成穩(wěn)固的環(huán)狀構(gòu)造，因此螯合率偏低；而質(zhì)量比過(guò)大時(shí)，可供螯合的鋅離子量不足而河蜆抗氧化肽剩余，螯合達(dá)到飽和，螯合率趨于平穩(wěn)。因此，選擇抗氧化肽與鋅離子質(zhì)量比2.0︰1作為較適條件。

2.1.3 螯合時(shí)間的篩選試驗(yàn)

由圖3可知，螯合率隨著時(shí)間的增加呈上升趨勢(shì)，當(dāng)螯合時(shí)間達(dá)到45 min時(shí)，螯合率達(dá)到頂峰。延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，可能是由于螯合環(huán)狀結(jié)構(gòu)變得不穩(wěn)定而導(dǎo)致螯合率呈下降趨勢(shì)，但沒(méi)有顯著性差異。因此，選定為45 min為河蜆抗氧化肽與鋅離子螯合的較適時(shí)間。

圖2 河蜆抗氧化肽與鋅離子質(zhì)量比對(duì)螯合效果的影響

圖3 螯合時(shí)間對(duì)螯合效果的影響

2.1.4 螯合溫度的篩選試驗(yàn)

圖4表明，溫度對(duì)螯合率有著一定的影響，隨著反應(yīng)溫度的升高，多肽的螯合率緩慢的增大，當(dāng)溫度為45 ℃左右時(shí)，多肽螯合率達(dá)到峰值。在低溫下，螯合反應(yīng)緩慢的進(jìn)行；螯合率在45 ℃后降低可能是因?yàn)轵戏磻?yīng)產(chǎn)生的熱量使得體系溫度升高，螯合物分解，最終螯合率反而降低。因此，試驗(yàn)的螯合溫度控制在45 ℃為宜。

圖4 螯合溫度對(duì)螯合效果的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

使用響應(yīng)面軟件對(duì)pH、質(zhì)量比、時(shí)間和溫度設(shè)計(jì)四因素三水平試驗(yàn)，共進(jìn)行29組試驗(yàn)，試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 方差分析

使用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)所得結(jié)果進(jìn)行處理與分析，得到結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知：模型F=4.58，p=0.003 7。由于模型p＜0.05，因此模型中的回歸方程對(duì)河蜆抗氧化肽鋅的螯合率具有顯著性，而且由于失擬項(xiàng)p=0.157 6＞0.05，因此失擬項(xiàng)不顯著。這說(shuō)明設(shè)計(jì)的模型與試驗(yàn)擬合較好，自變量與響應(yīng)值之間的關(guān)系顯著，可以用于該反應(yīng)的理論推測(cè)并能正確地預(yù)算出最佳螯合工藝條件。單因素中pH和螯合時(shí)間對(duì)螯合率的影響是顯著的（p＜0.05）；交互因素中pH與螯合時(shí)間對(duì)螯合率的影響顯著（p＜0.05）。

2.2.2 回歸模型優(yōu)化

將軟件計(jì)算所得模型中的不顯著項(xiàng)手動(dòng)刪除，優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表4。

手動(dòng)優(yōu)化后的二次回歸方程為：

Y=71.84-10.50A+5.91C-8.04AC-10.73A2-6.34B2-6.24D2

對(duì)結(jié)果影響較強(qiáng)的交互項(xiàng)響應(yīng)曲面圖見(jiàn)圖5。

圖5顯示，反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)螯合率越高，而當(dāng)pH為5～6、反應(yīng)時(shí)間為46 min左右時(shí)出現(xiàn)峰值，整個(gè)圖形呈現(xiàn)上升趨勢(shì)并且其坡度較為陡峭，表明pH與反應(yīng)時(shí)間的相互作用能顯著影響螯合率，所以控制一定的pH與反應(yīng)時(shí)間可以達(dá)到較理想的螯合率。

通過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件計(jì)算分析并預(yù)測(cè)出最優(yōu)工藝條件：pH為5.07，抗氧化肽與鋅離子質(zhì)量比2.18︰1，反應(yīng)時(shí)間為46.50 min，反應(yīng)溫度為52.65 ℃。

表3 回歸方程顯著性檢驗(yàn)和方差分析

表4 刪除不顯著項(xiàng)后的優(yōu)化結(jié)果

圖5 pH與反應(yīng)時(shí)間及其相互作用對(duì)螯合率影響的響應(yīng)曲面和等高線

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

參照軟件計(jì)算、優(yōu)化的工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得河蜆抗氧化肽螯合鋅的螯合率為81.78%，而理論預(yù)測(cè)值為83.39%，與之相差1.61%。可見(jiàn)模型預(yù)測(cè)值在實(shí)際值的誤差范圍之內(nèi)，說(shuō)明該模型適合用來(lái)優(yōu)化制備河蜆抗氧化肽螯合鋅。

2.4 河蜆抗氧化肽及肽鋅螯合物紅外光譜比較

抗氧化肽及抗氧化肽-Zn2+螯合物紅外光譜圖見(jiàn)圖6和圖7。

由圖6和圖7可知，河蜆抗氧化肽螯合后，各主要基團(tuán)的吸收峰表現(xiàn)出一定程度的改變。在特征區(qū)，河蜆抗氧化肽在3 419.32 cm-1處是由于N—H的伸縮振動(dòng)引起的，當(dāng)抗氧化肽與Zn2+螯合后，該峰移動(dòng)到3 441.13 cm-1處，波數(shù)增加21.81 cm-1，是發(fā)生螯合的特征峰，可見(jiàn)抗氧化肽中的氨基與Zn2+發(fā)生了螯合反應(yīng)。而且，河蜆抗氧化肽紅外光譜圖中的C==O吸收峰由1 657.63 cm-1處位移至1 635.95 cm-1處，吸收強(qiáng)度也隨之發(fā)生了明顯的變化，可能是河蜆抗氧化肽中的COO-參加了鋅離子的配位反應(yīng)。由此可以說(shuō)明河蜆抗氧化肽中的氨基和羧基參與了螯合反應(yīng)，進(jìn)一步說(shuō)明河蜆抗氧化肽和鋅離子螯合生成河蜆抗氧化肽-Zn2+螯合物。

圖6 河蜆多肽的紅外光譜

圖7 河蜆抗氧化肽-Zn2+螯合物的紅外光譜

3 結(jié)論

1) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面分析軟件Design-Expert 8.0.6得出的回歸方程，確定出螯合工藝優(yōu)化條件：pH為5.07，抗氧化肽與鋅離子質(zhì)量比為2.18︰1，螯合時(shí)間為46.50 min，螯合溫度為52.65 ℃。模型預(yù)測(cè)此條件下螯合率為83.39%，而以此工藝測(cè)得的河蜆抗氧化肽鋅螯合率僅為81.78%，屬于試驗(yàn)可接受誤差范圍內(nèi)。因此，此模型可用來(lái)優(yōu)化肽鋅螯合物的工藝參數(shù)，具有較高的準(zhǔn)確性和良好的實(shí)用價(jià)值。

2) 在對(duì)河蜆肉進(jìn)行酶解的基礎(chǔ)上，考慮到利用螯合技術(shù)，進(jìn)一步將河蜆肉進(jìn)行深加工。這不僅為制備一種新型抗氧劑和具有抗氧化功效的鋅制劑以及開(kāi)發(fā)系列功能食品奠定強(qiáng)有力的理論基礎(chǔ)，也為河蜆的深度加工提供一條新的途徑。