谷物中玉米赤霉烯酮殘留的膠體金免疫層析法測定

何方洋 ，萬宇平 ，崔廷婷 ，張慧，王琳琛 ，王兆芹

1. 北京勤邦生物技術(shù)有限公司（北京 102206）；2. 河南雙匯投資發(fā)展股份有限公司（漯河 462003）；3. 北京市食品安全免疫快速檢測工程技術(shù)研究中心（北京 102206）

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN），又名F-2毒素，是一種由多種鐮刀菌產(chǎn)生的具有雌激素作用的非甾體霉菌毒素[1]，多見于霉變的農(nóng)作物中，是世界范圍內(nèi)糧食飼料的污染物之一，在動物源性食品中也常被檢出，污染率較高[2]。研究表明，ZEN具有細胞毒性、免疫毒性、肝腎毒性、生殖毒性、遺傳毒性及可疑致癌性，可通過食物鏈進入人體，嚴重危害人類健康[3-4]。我國GB 2761—2017中規(guī)定谷物及其制品中ZEN的限量為60 μg/kg[5]。

目前比較常用的檢測ZEN的方法有薄層色譜法（TLC）[6]、高效液相色譜法（HPLC）[7-9]、液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）[10-11]及酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[12-13]等，但由于樣品前處理過程繁瑣，對儀器設(shè)備、人員技術(shù)依賴性較高，不能實現(xiàn)對大批量樣品的現(xiàn)場快速篩選。膠體金免疫層析技術(shù)（GICA）是一種將膠體金免疫技術(shù)和色譜層析技術(shù)相結(jié)合的固相膜免疫分析方法，具有操作簡便、靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于食品中有害物質(zhì)殘留檢測中。因此試驗基于膠體金免疫層析技術(shù)，擬開發(fā)一種快速檢測谷物中玉米赤霉烯酮的膠體金試紙條，為真菌毒素的快速檢測提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米赤霉烯酮及各種交叉反應(yīng)真菌毒素標準品，北京標準物質(zhì)研究中心；玉米赤霉烯酮單克隆抗體，北京勤邦生物技術(shù)有限公司自制；氯金酸（HAuCl4·4H2O）、牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、羊抗鼠IgG，美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑；硝酸纖維素膜（NC膜）、樣品墊、吸水墊、PVC底板，上海金標生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

2000 SBL電子天平，美國Setra公司；JEM-1230透射電子顯微鏡，日本電子株式會社；90-2磁力攪拌器，上海振榮科學(xué)儀器有限公司；LGJ-50 C凍干機，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；XYZ 3000點膜儀，Bio-Dot公司；CT 300數(shù)控切條機，上海金標生物科技有限公司；TDL-40 B低速大容量離心機、TGL-20 bR高速冷凍離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；液相色譜儀，配有熒光檢測器，Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米赤霉烯酮半抗原的合成

合成路線見圖1。取100 mg對氨基苯丙酸，加40 μ L 1 mol/L稀鹽酸，加1 mL蒸餾水稀釋溶解，冷卻到0℃攪拌，加47 mg亞硝酸鈉，攪拌2 h，得到苯丙氨酸的重氮鹽溶液；取120 mg玉米赤霉烯酮加乙醇溶解，加20 mg碳酸鉀，于0 ℃攪拌，加入上述重氮鹽溶液，攪拌2 h；停止反應(yīng)，加水，乙酸乙酯萃取，蒸干，上硅膠柱層析，石油醚-乙酸乙酯（1︰1，V/V）洗脫分離，得到半抗原產(chǎn)物。其化學(xué)結(jié)構(gòu)用核磁共振鑒定。

圖1 玉米赤霉烯酮半抗原的合成路線

1.3.2 人工抗原的制備

采用混合酸酐法[14]，將玉米赤霉烯酮半抗原與卵清蛋白偶聯(lián)，作為包被原。

1.3.3 膠體金的制備及質(zhì)量分析

采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金[15]。制備好的膠體金通過肉眼觀察溶液是否渾濁，有無漂浮物及顆粒沉淀物；并使用透射電鏡觀察膠體金顆粒大小是否均勻一致，有無發(fā)生顆粒聚集現(xiàn)象。

1.3.4 單克隆抗體-膠體金標記物的制備

取100 mL膠體金溶液至錐形瓶中，在磁力攪拌下，用0.2 mol/L K2CO3調(diào)節(jié)pH至7.2，室溫下加入24 μg ZEN單克隆抗體，攪拌混勻，室溫靜置10 min；加入質(zhì)量分數(shù)為10%的BSA至終質(zhì)量分數(shù)為1%，靜置10 min。于4 ℃、以12 000 r/min離心40 min，棄上清液，如此洗滌2～4次，將沉淀用含2% BSA（質(zhì)量分數(shù)）的PBS緩沖液（pH 7.4，0.01 mol/L）溶解，用0.22 μm無菌過濾器過濾后，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

向微孔條中加入50 μL ZEN單克隆抗體-膠體金標記物，放入冷凍干燥機中，在冷阱溫度-50 ℃條件下，預(yù)凍3 h后，再真空20 ℃干燥15 h，取出，即得到凍干有ZEN單克隆抗體-膠體金標記物的微孔試劑，密封保存。

1.3.5 膠體金免疫層析試紙條的組裝

將樣品墊置于含0.5% BSA（質(zhì)量分數(shù)）的PBS緩沖液（pH 7.2，0.1 mol/L）中浸泡2 h，于37 ℃烘干2 h備用。包被原ZEN-OVA用PBS緩沖液（pH 7.4，0.01 mol/L）稀釋至1 mg/mL，用噴膜儀噴于NC膜上，噴量為1 μL/cm，為檢測線；在檢測線上5 mm處噴涂羊抗鼠IgG（0.5 mg/mL），噴量為1 μL/cm，為質(zhì)控線，于37 ℃干燥2 h。將樣品墊、樣品墊貼紙膜、NC膜、吸水墊及PVC底板組裝好后，切成4 mm寬，與凍干有ZEN單克隆抗體-膠體金標記物的微孔試劑配合使用。

1.3.6 樣品檢測

小麥、大米、黃豆、玉米為市售，經(jīng)免疫親和柱凈化-液相色譜法[16]驗證為空白的樣品，具體前處理方法如下：稱取5.0±0.05 g粉碎的樣品至50 mL聚苯乙烯離心管中，加入15 mL 80%的甲醇，將瓶塞蓋緊，用渦旋儀渦動5 min，于3 000 r/min以上離心5 min；取100 μ L上清液，加入300 μ L樣品稀釋液中混勻，待檢。

1.3.7 檢測方法

用微量移液器吸取200 μL待檢樣品溶液于微孔中，緩慢抽吸且充分與微孔中的ZEN單克隆抗體-膠體金標記物混勻，于20～25 ℃孵育5 min后，將試紙條插入微孔中，使之充分浸入溶液中；再次于20～25 ℃孵育5 min后，取出試紙條，判定結(jié)果。如果檢測線和質(zhì)控線上均出現(xiàn)紅色條帶，說明樣品呈陰性（-）；如果質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色條帶，檢測線上沒出現(xiàn)紅色條帶，說明樣品呈陽性（+）。

1.3.8 試紙條的性能評價1.3.8.1 檢測限

采用1.3.6所述的樣品前處理方法時，在空白樣品中分別添加ZEN標準品至質(zhì)量濃度為10，20，50，80，100，200，500，800和1 000 μg/L，另設(shè)陰性對照，用試紙條進行檢測，每個濃度樣品重復(fù)3次，判斷試紙條的檢測限。

1.3.8.2 靈敏度、特異性、假陰性率、假陽性率

隨機取空白小麥、大米、黃豆、玉米樣品，共50份，分別添加ZEN標準品質(zhì)量濃度為1.3.8.1所確定的檢測限的0.5，1和2倍水平，共計樣品200份，用試紙條進行檢測，根據(jù)《食品快速檢測方法評價技術(shù)規(guī)范》[17]計算靈敏度等性能指標。

1.3.8.3 有效性驗證

取不同產(chǎn)地的小麥、大米、黃豆、玉米樣品各5份，采用1.3.6所述的方法經(jīng)前處理后，用試紙條進行檢測，每個樣品重復(fù)3次。同時按GB/T 5009.209—2016[16]中的液相色譜法（對糧食和糧食制品中玉米赤霉烯酮的檢出限為5 μg/kg），用儀器方法進行對比。

2 結(jié)果與分析

2.1 半抗原的核磁共振氫譜鑒定

取半抗原產(chǎn)物經(jīng)核磁共振得1H-NMR（CDCl3，300 MHz）δ：11.0（s，1H，COOH），8.53（d，2H，ArH），7.53，7.49（d，2H，ArH），6.76（s，1H，ArH），5.89（s，2H，—HC==CH—），5.35（s，2H，ArOH），4.13（m，1H，—O—CH—），2.79（t，2H，—CH2—），2.51（t，2H，—CH2—），2.44-2.47（m，4H，—CH2—C==O—CH2—），1.96（t，4H，—CH2—），1.37（s，3H，—CH3）。圖譜中化學(xué)位移δ=11為羧基氫，δ=2.51，2.79為苯丙氨酸支鏈氫，δ=8.53，7.49為苯丙氨酸苯環(huán)上的氫，這些化學(xué)位移氫的存在說明重氮偶合反應(yīng)成功，證明玉米赤霉烯酮半抗原結(jié)構(gòu)正確。

2.2 膠體金質(zhì)量鑒定

通過肉眼觀察，制備好的膠體金為清亮透明的酒紅色溶液，未發(fā)現(xiàn)漂浮物及顆粒沉淀物。圖2為膠體金的透射電鏡100 000×掃描圖，可以看出膠體金顆粒大小均勻，間距比較松散，未出現(xiàn)聚集現(xiàn)象。隨機選取100個顆粒并測定直徑，初步確定平均直徑約為20 nm。

2.3 檢測限

對質(zhì)量濃度0 μg/L的空白樣品檢測時，檢測線均出現(xiàn)較深的紅色條帶；隨著ZEN標準品質(zhì)量濃度的增加，檢測線條帶逐漸減弱，當質(zhì)量濃度增加至100 μ g/L時，檢測線無紅色條帶；繼續(xù)增加至1 000 μ g/L時，檢測線都無紅色條帶出現(xiàn)；質(zhì)控線均出現(xiàn)較深的紅色條帶（見表1）。以只出現(xiàn)質(zhì)控線時的最低標準品質(zhì)量濃度作為試紙條的檢測限，即為100 μg/L。

表1 玉米赤霉烯酮殘留檢測試紙條的檢測限

2.4 靈敏度、特異性、假陰性率、假陽性率

根據(jù)《食品快速檢測方法評價技術(shù)規(guī)范》，該方法靈敏度、特異性、假陰性率、假陽性率各性能指標的計算方法及結(jié)果見表2。

表2 玉米赤霉烯酮殘留檢測試紙條性能指標計算方法及結(jié)果

2.5 有效性驗證

20份樣品經(jīng)試紙條檢測后，有1份小麥、2份黃豆和1份玉米結(jié)果顯示陽性，其他樣品檢測結(jié)果均為陰性。用儀器方法檢測20份樣品，檢測結(jié)果顯示也僅有上述4份樣品中ZEN高于陽性判定線（100 μg/kg），表明兩種方法結(jié)果一致，結(jié)果見表3。

表3 GICA與儀器方法檢測樣品中玉米赤霉烯酮結(jié)果的比較

3 結(jié)論

試驗基于競爭抑制免疫層析原理，建立了一種快速、簡便、針對谷物中玉米赤霉烯酮殘留的檢測方法，方法的檢測限為100 μg/kg，靈敏度為99%，特異性為94%，假陰性率為1%，假陽性率為6%，從樣品前處理到檢測，整個分析流程耗時20 min。與其他方法相比，該方法具有快速、簡便、靈敏度高和經(jīng)濟適用等特點，在樣品提取步驟中不需要復(fù)雜的凈化過程，大大提高了檢測效率，十分適合現(xiàn)場大批量樣品的快速檢測。而且采用了將膠體金標記的單克隆抗體直接凍干在微孔試劑中，這樣在檢測過程中，能夠使金標抗體與待檢樣品液充分接觸，充分反應(yīng)，從而減少誤差，增加整個體系的反應(yīng)靈敏度，易于對樣品中的毒素殘留情況進行分析。但由于膠體金免疫層析法主要通過目測顏色來判斷結(jié)果，比較主觀，可能出現(xiàn)假陽性問題，因此對于陽性樣品，還需要用液相色譜法等儀器方法進行確證。盡管如此，但此方法作為一種快速篩查手段，可以有效地彌補因設(shè)備和經(jīng)費問題而無法開展谷物中玉米赤霉烯酮檢測和監(jiān)控的問題，具有重要的經(jīng)濟價值和社會價值。