銀杏葡萄酒自由基清除能力及其與總酚含量的關(guān)系

馮濤，趙宇，桑敏，王旭增，張鈺*

1. 上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精技術(shù)與工程學(xué)院（上海 201418）；2. 上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)技術(shù)轉(zhuǎn)移中心（上海 200235）

銀杏（Gingko，Gingko biloba L.）主要種植于在溫帶、亞熱帶地區(qū)，是世界上最古老的樹種之一，并且在我國資源豐富，占世界總資源的70%以上[1]。近年來，關(guān)于銀杏葉提取物的藥用價(jià)值和保健價(jià)值得到各行各業(yè)的廣泛關(guān)注。然而，目前對于銀杏種仁的研究較少，銀杏果的深加工還處在初始階段，造成銀杏果經(jīng)濟(jì)效益不樂觀。作為一種傳統(tǒng)食品和藥品的來源，銀杏種仁早在五千年前就被用于添加到甜點(diǎn)、飲料和酒當(dāng)中，并且作為中國傳統(tǒng)藥材也被記錄在《本草綱目》當(dāng)中[2]。銀杏果實(shí)中富含淀粉、維生素、蛋白質(zhì)以及多種氨基酸；成熟的果實(shí)中還含有多種N、K等常量元素以及Zn、Fe等微量元素[3]。除此之外，果實(shí)中含有豐富的黃酮類、酚類及內(nèi)酯類等生物活性成分，能夠降血脂、促進(jìn)血液循環(huán)、止咳平喘及清除自由基，具有極高的藥用價(jià)值及保健價(jià)值[4-5]。

目前銀杏在釀酒行業(yè)的應(yīng)用主要體現(xiàn)在銀杏葉提取物參與酒精發(fā)酵以及銀杏果釀造白酒上[6-7]，對于銀杏果應(yīng)用于葡萄酒行業(yè)的還未見報(bào)道。因此以葡萄酒為依托，開發(fā)一種新型葡萄酒，既可以豐富葡萄酒的種類，又可以延長銀杏產(chǎn)業(yè)鏈的發(fā)展，提高其經(jīng)濟(jì)附加值。

氧自由基與衰老、癌癥、心腦血管疾病和炎癥的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)，因此清除自由基的能力是評價(jià)抗氧化能力大小的一個(gè)重要指標(biāo)[8-9]。流行病學(xué)研究表明，適量飲用葡萄酒對于人體健康具有很大的益處[10-11]，還可以增加血清抗氧化能力，這是由于葡萄酒中含有豐富的酚類化合物，具有預(yù)防冠心病、減少癌癥發(fā)病率和慢性疾病的作用[12-13]。此外，有研究表明，銀杏果中含有豐富的銀杏多糖、銀杏蛋白以及黃酮類、酚類、萜類、內(nèi)酯類化合物，具有清除自由基活性以及預(yù)防心血管疾病的能力[14]。流行病學(xué)研究建議適當(dāng)食用某些具有抗氧化生物活性的植物材料（比如銀杏、葡萄等）可減少氧化應(yīng)激相關(guān)慢性疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，從而加強(qiáng)身體健康[15-16]。

為此，試驗(yàn)以葡萄酒為依托釀造銀杏葡萄酒，開發(fā)出一種新型保健酒。新產(chǎn)品不但具有較好的營養(yǎng)保健作用，而且風(fēng)味口感協(xié)調(diào)，為銀杏葡萄酒的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論與試驗(yàn)依據(jù)，并對其總酚含量以及抗氧化活性進(jìn)行測定，同時(shí)研究總酚含量與抗氧化活性之間的相關(guān)性，為消費(fèi)者選擇有益于身體健康的葡萄酒提供有力參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄（Vitis L.），上海市奉賢區(qū)海灣鎮(zhèn)葡萄種植園；銀杏（Gingko biloba L.），市售；釀酒酵母，安琪酵母有限公司。

福林-肖卡（Folin-Ciocalteau，F(xiàn)C）試劑；DPPH（1, 1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl）、ABTS [2, 2’-Azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）]、Trolox，美國Sigma-Aldrich公司；沒食子酸、槲皮素、阿魏酸、咖啡酸、香豆酸、兒茶素、表兒茶素（均為色譜純）、乙腈（色譜純）、沒食子酸、碳酸鈉、過硫酸鉀、無水乙醇，均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2350紫外分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司；QL-901漩渦混合儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；1260 Indinity高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 銀杏葡萄酒釀造工藝流程

1.3.2 主要理化指標(biāo)的測定

酒精度、總糖、總酸、揮發(fā)酸、游離二氧化硫含量的測定方法參照GB/T 15038—2006[17]。

1.3.3 自由基清除活性的測定

1.3.3.1 DPPH自由基清除活性

DPPH自由基清除活性參考Miti?等[18]的方法，稍作修改后進(jìn)行測定。吸取0.1 mL 10倍稀釋后的酒樣，加到3.9 mL 25 mg/L的DPPH/乙醇溶液中，漩渦混合均勻，避光條件下反應(yīng)20 min后，于515 nm處測定反應(yīng)液吸光度。每個(gè)樣品做3次平行試驗(yàn)。以15%的乙醇溶液代替酒樣作為對照。DPPH自由基清除能力根據(jù)Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線以TEAC當(dāng)量（Tro1ox equivalent antioxidant capacity，TEAC）表示。

1.3.3.2 ABTS+自由基清除活性

ABTS+自由基清除活性參考Wang等[19]的方法，稍作修改后進(jìn)行測定。吸取0.1 mL 10倍稀釋后的酒樣，加到3.9 mL ABTS+工作溶液[2.45 mmol/L K2(SO4)2溶液與7 mmol/L ABTS溶液等體積混合，黑暗中反應(yīng)12～16 h；稀釋至在734 nm處吸光度為0.7±0.02]中，漩渦混合均勻，避光條件下反應(yīng)8 min后，于734 nm處測定反應(yīng)液吸光度。每個(gè)樣品做3次平行試驗(yàn)。以15%的乙醇溶液代替酒樣作為對照。ABTS+自由基清除能力根據(jù)Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線以TEAC當(dāng)量（Tro1ox equivalent antioxidant capacity，TEAC）表示。

1.3.4 總酚含量的測定

總酚含量的測定參考Wang等[19]的方法，稍作修改后進(jìn)行測定。吸取1 mL 10倍稀釋后的酒樣，加入5 mL去離子水，漩渦混合均勻，加入0.1 mL 1 mol/L的FC試劑，混合均勻；1 min后加入3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%的Na2CO3溶液，最后加入0.9 mL去離子水，漩渦振蕩混合均勻后，于75 ℃恒溫振蕩水槽中水浴加熱反應(yīng)10 min。于765 nm處測定反應(yīng)液吸光度。每個(gè)樣品做3次平行試驗(yàn)。以15%的乙醇溶液代替酒樣作為對照。總酚含量結(jié)果根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線以GAE當(dāng)量（Gallic acid equivalent，沒食子酸當(dāng)量）表示。

1.3.5 HPLC-DAD測定單體酚組成

色譜條件：參考Miti?等[18]的方法，稍作修改。

色譜柱：Agilent HC-C18柱（5 μm×4.6 mm×250 mm）；柱溫，30 ℃；進(jìn)樣量，10 μL；檢測波長，320 nm；流速，0.8 mL/min。

流動相A，1%磷酸水溶液；流動相B，乙腈。洗脫程序：0～2 min，流動相A 90%～70%，2～8 min，流動相A 70%～35%，8～14 min，流動相A 35%～5%，14～18 min，流動相A 5%～35%，18～20 min，流動相A 35%～90%，20～22 min，流動相A/流動相B為90︰10。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：配制質(zhì)量濃度均為120 mg/L的沒食子酸、咖啡酸、阿魏酸、香豆酸、槲皮素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，并稀釋成不同的濃度梯度。

酒樣單體酚測定：參考?eruga等[20]的方法，稍作修改。樣品測定前用0.22 μm微孔濾膜過濾。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有試驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）。采用SPSS 19.0（IBM，Armonk，NY，USA）軟件進(jìn)行酒樣自由基清除活性與總酚含量的相關(guān)性分析（p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 主要理化指標(biāo)

銀杏葡萄酒的主要理化指標(biāo)測定結(jié)果見表1。結(jié)果表明，銀杏葡萄酒和對照葡萄酒的酒精度、總糖、總酸、揮發(fā)酸和游離二氧化硫等指標(biāo)均符合葡萄酒國家標(biāo)準(zhǔn)GB 15038—2006。

表1 理化指標(biāo)分析結(jié)果

2.2 自由基清除活性

2.2.1 DPPH自由基清除活性

Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)方程為y=0.685 1-0.000 587 5x，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2=0.996 1，表明曲線具有較好的相關(guān)性。

銀杏葡萄酒的DPPH自由基清除能力見圖1。對照葡萄酒DPPH自由基清除能力相當(dāng)于694.39 μmol/L Trolox當(dāng)量，而銀杏酶解液的加入對葡萄酒的DPPH自由基清除能力有明顯的提高作用。其中，當(dāng)酶解液添加量為20%時(shí)，提高得最多（提高263.51 μmol/L），其DPPH自由基清除能力相當(dāng)于957.9 μmol/L Trolox當(dāng)量。而當(dāng)酶解液添加量為30%時(shí)，其DPPH自由基清除能力相當(dāng)于922.16 μmol/L Trolox當(dāng)量，相對于對照組提高了227.77 μmol/L，僅次于20%添加量的銀杏葡萄酒。

根據(jù)該試驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為銀杏酶解液的加入能提高葡萄酒DPPH自由基清除能力，從而具有較好的抗氧化、延緩衰老的作用。具有較好抗氧化效果的是銀杏酶解液添加量為20%的銀杏葡萄酒。

圖1 銀杏葡萄酒的DPPH自由基清除能力（以TEAC當(dāng)量表示）

2.2.2 ABTS+自由基清除活性

Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)方程為y=0.688 3-0.000 658 2x，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2=0.998 4，表明曲線具有較好的相關(guān)性。

銀杏葡萄酒的ABTS+自由基清除能力見圖2。對照葡萄酒ABTS+自由基清除能力相當(dāng)于724.20 μmol/L Trolox當(dāng)量，而銀杏酶解液的加入對葡萄酒的ABTS+自由基清除能力有提高作用。其中，當(dāng)酶解液添加量為20%和30%時(shí)，提高得最多，其ABTS+自由基清除能力分別相當(dāng)于844.79和857.39 μmol/L Trolox當(dāng)量。其次，其他添加量的銀杏葡萄酒ABTS+自由基清除能力相對于對照葡萄酒均有不同程度的提高。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為銀杏酶解液的加入能在不同程度上提高葡萄酒ABTS+自由基清除能力，從而具有較高的抗氧化活性。因此，具有較好抗氧化效果的是銀杏酶解液添加量為20%和30%的銀杏葡萄酒。

圖2 銀杏葡萄酒的ABTS自由基清除能力（以TEAC當(dāng)量表示）

2.3 總酚含量

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)方程為y=0.000 959 5x-0.003 55，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8，表明曲線具有較好的相關(guān)性。

銀杏葡萄酒的總酚含量見圖3。對照葡萄酒的總酚含量為1 193.71 mg/L，而銀杏酶解液的加入對葡萄酒的總酚含量具有增加的作用。銀杏葡萄酒的總酚含量變化范圍為1 327.46～2 130.71 mg/L，其中，當(dāng)酶解液添加量為20%時(shí)，葡萄酒總酚含量提高了937 mg/L，總酚含量達(dá)到2 130.71 mg/L。銀杏葡萄酒的總酚含量由大到小依次為：20%添加量＞30%添加量＞40%添加量＞10%添加量＞50%添加量。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為銀杏酶解液的加入能在不同程度上提高葡萄酒的總酚含量，且具有高總酚含量的是銀杏酶解液添加量為20%的銀杏葡萄酒。

圖3 銀杏葡萄酒的總酚含量（以GAE當(dāng)量表示）

2.4 單體酚測定

以峰面積為橫坐標(biāo)x，標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為縱坐標(biāo)y，得到每個(gè)單體酚的回歸方程，結(jié)果見表2。沒食子酸、咖啡酸、香豆酸、阿魏酸和槲皮素5種單體酚標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度與相應(yīng)的峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

表2 多酚物質(zhì)保留時(shí)間和回歸方程

根據(jù)前述色譜條件檢測對照組葡萄酒和銀杏葡萄酒中5種單體酚含量，結(jié)果見表3。由表3可知，在對照組葡萄酒和銀杏葡萄酒中均檢測到了上述5種單體酚，且沒食子酸含量最高。隨著銀杏酶解液添加量的增加，5種單體酚的含量均呈現(xiàn)減少的趨勢，這是由于銀杏果中含有的酚類物質(zhì)主要是烷基酚類化合物，包括白果酚、白果二酚等，而上述5種單體酚的含量較少。因此，隨著銀杏酶解液的添加量的增加，沒食子酸等5種單體酚的含量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。

表3 葡萄酒中單體酚含量的測定 mg/L

2.5 總酚含量與自由基清除活性的相關(guān)性分析

試驗(yàn)結(jié)果表明，銀杏葡萄酒的DPPH、ABTS自由基清除活性與總酚含量的變化趨勢具有一定的一致性。由圖4可知，總酚含量與自由基清除活性呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性，擬合線性回歸方程分別為y=0.262 6x+406.965 1和y=0.134 6x+571.375 9，且皮爾遜相關(guān)性系數(shù)分別為0.72和0.74。由此說明銀杏葡萄酒的總酚含量與自由基清除能力具有較好的相關(guān)性，且酚類化合物是抗氧化活性的主要貢獻(xiàn)者，當(dāng)酚類化合物的羥基數(shù)目增多，其抗氧化活性就越強(qiáng)[21]。

Linda等[22]研究了巴西蜂蜜及其提取物酚類物質(zhì)以及抗氧化活性。結(jié)果表明：酚類物質(zhì)是影響蜂蜜抗氧化活性的主要組分，表明其總酚含量和抗氧化活性可以用來評估蜂蜜的品質(zhì)。Burns等[23]研究了紅葡萄酒抗氧化活性與總酚含量之間的關(guān)系。結(jié)果表明：總酚含量越高，其抗氧化活性越強(qiáng)，表明不同多酚含量的葡萄酒可以產(chǎn)生不同程度的抗氧化活性，紅葡萄酒可以為消費(fèi)者提供更多對于健康有益的可能性。除此之外，許多學(xué)者研究表明：抗氧化活性與總酚含量之間具有不同程度的相關(guān)性[24-25]。

圖4 總酚含量與抗氧化活性的相關(guān)性

3 討論與結(jié)論

多酚類物質(zhì)是葡萄、葡萄酒等物質(zhì)中含有的一類主要的抗氧化活性成分，而其起到抗氧化活性的成分主要來源于黃酮類以及酚酸類物質(zhì)[26]。目前大量研究表明：膳食攝入適量的植物生物活性物質(zhì)與降低心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)之間具有強(qiáng)有力的聯(lián)系。尤其是膳食攝入黃酮及酚類物質(zhì)對于冠狀動脈疾病和心肌梗死的發(fā)病率之間呈現(xiàn)一定的相關(guān)性[27]。試驗(yàn)采用DPPH、ABTS自由基清除能力探討銀杏葡萄酒的抗氧化活性。結(jié)果表明：銀杏葡萄酒的總酚含量變化范圍介于1 588.76～2 130.71 mg/L之間，平均含量為1 693.68 mg/L。銀杏葡萄酒總酚含量與DPPH自由基清除能力相關(guān)性較好（R2=0.72，p=0.02），與此同時(shí)銀杏葡萄酒總酚含量與ABTS自由基清除能力相關(guān)性較好（R2=0.74，p=0.01），表明銀杏葡萄酒中多酚類物質(zhì)與其抗氧化活性之間的關(guān)系密切，說明酚類物質(zhì)是銀杏葡萄酒發(fā)揮抗氧化活性的一個(gè)重要因素。綜上所述，銀杏葡萄酒總酚含量高于對照葡萄酒，且其總酚含量與清除自由基能力呈現(xiàn)出較好的相關(guān)性。