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    超聲微波協(xié)同酶法提取黃精多糖與抗氧化特性分析

    2019-05-23 05:52:18巫永華劉恩岐張建萍陳尚龍陳安徽邵穎
    食品工業(yè) 2019年5期
    關(guān)鍵詞:黃精組分微波

    巫永華,劉恩岐,張建萍*,陳尚龍,陳安徽,邵穎

    徐州工程學(xué)院江蘇省食品資源開(kāi)發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室(徐州 221111)

    黃精(Polygonatum sibiricum)為百合科草本類植物[1],中醫(yī)研究表明,其具有益氣、補(bǔ)腎、益脾、滋陰、潤(rùn)肺等功效,2 000多年前就被作為藥物,用以治療咳嗽、肺部疾病等[2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),黃精含有大量多糖、一定量多酚類[3-4]、皂苷類[5]和氨基酸等[6]活性成分,研究表明,這些活性物質(zhì)是黃精具有抗病毒、抗疲勞、降血糖、降血脂、延緩衰老、提高免疫力、改善記憶力和較好的抗氧化能力[7-9]的物質(zhì)基礎(chǔ)。生黃精經(jīng)炮制后做成制黃精后不僅可以去除麻味,而且藥效得以增強(qiáng)。目前,關(guān)于黃精多糖的研究已有大量報(bào)道,陳鋼等[10]利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了黃精多糖的提取工藝,結(jié)果顯示在料液比1︰21.5(g/mL)、溫度73.5 ℃下提取2.5 h,黃精多糖的提取率可達(dá)12.25%。傅圣斌等[11]采用水溶劑煎煮提取黃精多糖,獲得9.2%的提取率,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)黃精多糖可明顯改善環(huán)磷酰胺致免疫抑制小鼠的免疫功能。何連軍等[12]研究多花黃精多糖的單糖組成,表明多花黃精多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖組成。徐世忱等[13]分析黃精炮制前后粗多糖的提取率與總糖含量,結(jié)果表明生黃精與制黃精中粗多糖的提取率分別為13.0%和6.3%,說(shuō)明炮制會(huì)對(duì)多糖有降解作用。陳艷等[14]研究閃式提取法提取黃精多糖,并探討其對(duì)乳酸菌發(fā)酵特性的影響,結(jié)果表明該方法能快速高效制備黃精多糖,所制備的黃精多糖能加快乳酸菌發(fā)酵時(shí)產(chǎn)酸速率、促進(jìn)乳酸生長(zhǎng)的增殖作用,具有一定的益生元特性。

    試驗(yàn)研究超聲-微波協(xié)同酶法提取黃精多糖的工藝,采用乙醇分級(jí)醇沉獲得不同的生黃精和制黃精多糖的多糖組分,對(duì)其得率和基本成分進(jìn)行分析,并測(cè)定DPPH·和O2-·清除能力以初步評(píng)價(jià)其體外抗氧化能力,以期為制備高抗氧化活性的黃精多糖組分提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    黃精(安徽亳州千草藥業(yè)有限公司);纖維素酶(上海源葉生物科技有限公司);DPPH(Sigma公司);H2O2(Aladdin公司);鄰苯三酚(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。其余試劑均為分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    CW-2000超聲-微波協(xié)同萃取儀(上海新拓分析儀器科技有限公司);R 206旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司);真空冷凍干燥機(jī)(CHRIST公司);TU-1810紫外分光光度計(jì)(北京普析通用有限公司);L 550離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

    1.3 方法

    1.3.1 黃精的預(yù)處理

    用粉碎機(jī)將生黃精和制黃精粉碎,過(guò)80目篩,用塑料自封袋保存,置于干燥器中,備用。

    1.3.2 超聲微波協(xié)同酶法提取黃精多糖工藝

    試驗(yàn)從果膠酶、木瓜蛋白酶和纖維素酶中篩選出最佳的酶,在此基礎(chǔ)上,采用單因素試驗(yàn)探討料液比、酶添加量、酶解溫度和酶解時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響,采用正交試驗(yàn)確定最佳的黃精多糖提取工藝。

    1.3.3 黃精多糖的制備、去蛋白與分級(jí)醇沉

    分別取適量的生黃精和制黃精,按試驗(yàn)所得最優(yōu)條件提取黃精多糖,采用Sevage法除蛋白3次,減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以除去殘余的氯仿和正丁醇,加入一定純水復(fù)溶后,離心取上清液,加入無(wú)水乙醇至終醇濃度40%,攪拌均勻后于冰箱中過(guò)夜,以4 000 r/min離心10 min,得到40%醇沉多糖,收集上清液,并加入無(wú)水乙醇至終醇濃度60%,同上述操作,獲得60%和80%的醇沉多糖。各組分經(jīng)乙醚和丙酮洗滌后,冷凍干燥,稱重,置于-20 ℃冰箱中保存待用。40%,60%和80%乙醇沉淀的生黃精和制黃精多糖分別命名為PPs-40,PPs-60,PPs-80和PPPs-40,PPPs-60,PPPs-80。

    1.3.4 多糖含量的測(cè)定

    多糖的測(cè)定采用苯酚-硫酸法[15]測(cè)定。以D-葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,獲得回歸方程y=8.925x-0.005 9,R2=0.997 4,并在此基礎(chǔ)上計(jì)算多糖含量和提取率。

    1.3.5 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

    以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品,采用考馬斯亮藍(lán)法[16]進(jìn)行測(cè)定。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,獲得回歸方程y=0.007 38х+0.073 5,R2=0.994 6。

    1.3.6 多酚含量的測(cè)定

    測(cè)定采用福林酚法[17]。以沒(méi)食子酸作為校正品。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,獲得回歸方程y=0.016 03х-0.030 3,R2=0.999 5。

    1.3.7 黃精多糖體外抗氧化活性的測(cè)定

    1.3.7.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

    測(cè)定DPPH自由基的清除能力能較為快速地評(píng)價(jià)天然產(chǎn)物的抗氧化特性。參照唐仕榮等[18]的方法,稍作修改。試驗(yàn)用純凈水將各黃精多糖組分配成一定濃度的溶液,備用,用無(wú)水乙醇配制成質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL的DPPH·溶液。分別取4 mL不同濃度的多糖溶液,各加入2 mL DPPH·溶液,混合均勻,室溫暗處反應(yīng)30 min后以4 000 r/min離心10 min。上清液于517 nm處測(cè)吸光度。并以蒸餾水代替待測(cè)液作空白試驗(yàn)。樣品對(duì)DPPH自由基的清除率用式(1)計(jì)算。

    式中:A0為4 mL蒸餾水和2 mL DPPH的吸光度;A1為4 mL樣品溶液和2 mL DPPH的吸光度;A2為4 mL樣品溶液和2 mL蒸餾水的吸光度。

    1.3.7.2 超氧自由基清除率的測(cè)定

    參照龔霞等[19]報(bào)道的方法測(cè)定。將各黃精多糖組分用蒸餾水配成一定濃度的溶液備用。取1 mL質(zhì)量溶度0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 8.2),于25 ℃水浴中保溫20 min,后分別加入1 mL不同濃度的樣品溶液和1 mL 25 mmol/L的鄰苯三酚溶液,振蕩搖勻后在25 ℃水浴中反應(yīng)5 min,加入1 mL 2% HCl快速混勻以終止反應(yīng),于325 nm處測(cè)定吸光度(Ax),空白對(duì)照組以相同體積蒸餾水代替樣品。按式(2)計(jì)算·清除率。

    式中:A0表示空白對(duì)照吸光度;Ax表示樣品溶液吸光度。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    所有試驗(yàn)均重復(fù)3次以上,并采用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、繪制曲線。半數(shù)抑制率(IC50)定義為清除自由基達(dá)50%時(shí)的樣品濃度。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 黃精多糖超聲微波協(xié)同酶法提取工藝條件的確定

    2.1.1 酶種類的確定

    以生黃精為原料,為篩選最佳的作用酶,試驗(yàn)在料液比1︰20(g/mL)下分別添加0.5%果膠酶、纖維素酶和木瓜蛋白酶,置于超聲微波協(xié)調(diào)萃取儀中,在55 ℃處理10 min后,離心,測(cè)定上清液中多糖含量,計(jì)算多糖提取率。試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

    較沒(méi)有加酶的CK組,加入果膠酶、木瓜蛋白酶和纖維素酶能一定程度提高黃精多糖的提取率,其中,加入纖維素酶的多糖提取率比CK組提高80.13%,具有極顯著差異;較添加木瓜蛋白酶和果膠酶組提高57.70%和30.03%。原因可能是黃精中含有較多的植物纖維,其自身就是一種多糖類,加入纖維素酶將其分解,從而提高多糖提取率。故選用纖維素酶做后續(xù)試驗(yàn)。

    圖1 不同酶處理對(duì)黃精多糖提取率的影響

    2.1.2 料液比對(duì)黃精多酚提取效果的影響

    選擇纖維素酶為作用酶,在添加量0.5%、pH 5.5、酶解溫度55 ℃和處理10 min條件下,考察不同料液比對(duì)黃精多糖提取率的影響。試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

    隨著料液比的提高,黃精多糖提取率逐漸升高,當(dāng)料液比為1︰20(g/mL)時(shí)提取率最高,之后提取率基本不變。原因可能是料液比過(guò)高會(huì)導(dǎo)致樣品溶液被稀釋,減少了樣品與酶的接觸,從而影響提取率,導(dǎo)致相同時(shí)間內(nèi)的提取率降低。故后續(xù)試驗(yàn)中采用料液比1︰20(g/mL)左右做進(jìn)一步優(yōu)化。

    圖2 料液比對(duì)黃精多糖提取率的影響

    2.1.3 酶添加量的確定

    在料液比1︰20(g/mL)、pH 5.5、酶解溫度55℃和處理10 min條件下,考察不同纖維素酶添加量對(duì)黃精多糖提取率的影響。試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

    酶添加量的多少會(huì)直接影響底物與酶的接觸機(jī)會(huì),影響提取效果。由圖3可知,當(dāng)纖維素酶添加量由0.25%提高到0.75%時(shí),黃精多糖提取率逐漸升高;0.75%的纖維素酶添加量達(dá)到最優(yōu),之后提取率反而下降。原因可能是過(guò)量的酶會(huì)降解一部分多糖,從而導(dǎo)致多糖提取率下降。因此,后續(xù)試驗(yàn)中采用纖維素酶添加量0.75%左右做進(jìn)一步優(yōu)化。

    圖3 酶添加量對(duì)黃精多糖提取率的影響

    2.1.4 酶解溫度的確定

    在料液比1︰20(g/mL)、pH 5.5,酶添加量0.75%和處理時(shí)間10 min條件下,考察不同酶解溫度對(duì)黃精多糖提取率的影響。試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

    由于超聲微波萃取儀最低只能設(shè)置50 ℃,試驗(yàn)考察50~70 ℃條件下的酶解效果。由圖4可知,在60℃之前,黃精多糖的提取率隨著溫度的提高而逐漸升高,在60 ℃時(shí),提取率最高,隨后提取率下降,特別是到70 ℃時(shí),提取率較最優(yōu)時(shí)下降29.83%。這與文獻(xiàn)報(bào)道的纖維素酶的最優(yōu)溫度在60 ℃左右一致。故后續(xù)正交試驗(yàn)中采用酶解溫度60 ℃左右做進(jìn)一步試驗(yàn)。

    圖4 提取溫度對(duì)黃精多糖提取率的影響

    2.1.5 酶解時(shí)間的確定

    在料液比1︰20(g/mL)、pH 5.5、酶添加量0.75%和酶解溫度60 ℃條件下,考察不同酶解時(shí)間對(duì)黃精多糖提取率的影響。試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

    由圖5可知,提取時(shí)間對(duì)黃精多糖的提取率影響明顯,提取時(shí)間從10 min到20 min時(shí),提取率由13.98%增加到16.78%,提高20.03%。之后,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),提取率開(kāi)始下降。這可能是超聲-微波協(xié)調(diào)纖維素酶法能在20 min左右就將黃精中的糖類提出,而時(shí)間過(guò)長(zhǎng),超聲波能將部分多糖進(jìn)一步水解,從而影響提取率。故后續(xù)正交試驗(yàn)中采用20 min左右做進(jìn)一步試驗(yàn)。

    圖5 提取時(shí)間對(duì)黃精多糖提取率的影響

    2.1.6 超聲微波協(xié)同纖維素酶提取黃精多糖正交試驗(yàn)結(jié)果

    在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選擇以纖維素酶為作用酶,采用L9(34)正交試驗(yàn)對(duì)料液比、酶添加量、酶解溫度和酶解時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,以確定超聲微波協(xié)同纖維素酶提取黃精多糖的最佳工藝條件。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1所示。

    由表1中的R值可知,在試驗(yàn)所選的4個(gè)因素中,對(duì)黃精多糖提取效果的影響大小順序?yàn)椋篋(酶解時(shí)間)>A(料液比)>B(纖維素酶添加量)>C(酶解溫度);結(jié)合表2方差分析可知,酶解時(shí)間和料液比對(duì)超聲微波協(xié)調(diào)纖維素酶提取黃精多糖的提取效果具有顯著的影響(p<0.05)。綜合得出,試驗(yàn)的最優(yōu)組合為A3B3C2D2,即料液比1︰23(g/mL)、纖維素酶添加量0.85%、酶解溫度60 ℃、酶解時(shí)間20 min。取3份一定量黃精粉,在最佳條件下做驗(yàn)證試驗(yàn),得出黃精多糖提取率為17.53%,高于正交表中的各個(gè)組合,所以得出該條件為超聲微波纖維素酶協(xié)同提取黃精多糖的最佳工藝條件。

    表1 正交試驗(yàn)結(jié)果

    表2 方差分析結(jié)果

    2.2 黃精多糖各組分得率及多糖、蛋白質(zhì)和多酚含量分析

    乙醇分級(jí)沉淀多糖是根據(jù)多糖的分子量大小和多糖所含的羥基等基團(tuán)所表現(xiàn)出的極性大小來(lái)分離的,分子量大的和極性強(qiáng)的多糖會(huì)在較低溶度的乙醇中沉淀。由表3可知,在相同提取條件下,生黃精中60%和80%醇沉的多糖得率極顯著高于40%的醇沉多糖;制黃精中80%醇沉的多糖得率極顯著高于40%和60%的醇沉多糖,生黃精和制黃精多糖的不同分布可能與制黃精在炮制過(guò)程中發(fā)生的美拉德反應(yīng)、多糖降解等反應(yīng)有關(guān)。生黃精各組分的多糖含量較高,而制黃精多糖中多糖含量都沒(méi)有超過(guò)80%,說(shuō)明各制黃精各醇沉組分中還含有較多的非糖類成分,需要進(jìn)一步純化。另外,各自組分中蛋白質(zhì)和多酚含量極少,說(shuō)明蛋白質(zhì)去除較為徹底。

    表3 黃精多糖各組分得率及組分分析結(jié)果

    2.3 黃精多糖的抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果

    DPPH·在乙醇溶液中呈紫色,且較為穩(wěn)定,但體系中存在抗氧化劑時(shí),DPPH·的孤電子會(huì)被配成對(duì),顏色變淺,在517 nm處吸光度變小,且其吸光度大小與配對(duì)電子數(shù)成化學(xué)計(jì)量關(guān)系,可以方便快速地評(píng)價(jià)抗氧化物的自由基清除能力。鄰苯三酚在堿性條件下會(huì)發(fā)生自氧化,生成O2-·,而抗氧化劑能夠終止鏈反應(yīng),通過(guò)檢測(cè)有色中間體產(chǎn)生的多少可以反映出抗氧化劑對(duì)O2-·的清除能力。試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定黃精多糖各組分對(duì)DPPH·和O2-·的清除能力來(lái)評(píng)價(jià)其抗氧化特性。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6、圖7和表4。

    由圖6和圖7可以看出,黃精多糖各組分均具有一定的DPPH·和O2-·的清除能力,其清除效果與多糖的濃度呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系。由表4可以看出,PPs-40對(duì)DPPH·的清除能力顯著高于其他組分;PPPs-40對(duì)O2-·的清除能力顯著高于其他組分。說(shuō)明分子量較大的、極性較強(qiáng)的多糖組分具有較好的抗氧化活性。另外,對(duì)于DPPH·的清除率而言,生黃精獲得的各多糖組分總體上優(yōu)于制黃精的,而對(duì)于O2-·的清除率而言,制黃精獲得的各多糖組分總體上優(yōu)于生黃精,2個(gè)指標(biāo)表現(xiàn)出的差異可能與2種體系下的起抗氧化作用的主要活性物質(zhì)有關(guān),前者含有較多多糖,而后者在炮制加工中,多糖降解,但新產(chǎn)生5-羥甲基麥芽酚和5-羥甲基糠醛等抗氧化物質(zhì)[20]。

    圖6 黃精多糖各組分對(duì)DPPH·的清除效果

    圖7 黃精多糖各組分對(duì)O2-·的清除效果

    表4 黃精多糖各組分抗氧化特性分析結(jié)果IC50 mg/mL

    3 結(jié)論與討論

    試驗(yàn)探討超聲微波協(xié)同酶法提取黃精多糖的工藝條件,結(jié)果表明,以生黃精為原料時(shí),在以纖維素酶為作用酶,料液比1︰23(g/mL),酶添加量0.85%,溫度60 ℃下酶解20 min,黃精多糖的提取率為17.53%。經(jīng)用乙醇分級(jí)沉淀該條件下制備生黃精,獲得多糖組分PPs-40,PPs-60和PPs-80,其得率分別為5.61%,46.11%和48.28%,多糖含量分別為79.66%,88.92%和99.28%;制備得到的制黃精多糖,獲得多糖組分PPPs-40,PPPs-60和PPPs-80,其得率分別為21.08%,21.08%和57.84%,多糖含量分別為57.94%,70.18%和75.24%,生黃精和制黃精多糖幾乎不含蛋白質(zhì)和多酚。以DPPH·和O2-·清除率來(lái)評(píng)價(jià)各多糖組分的抗氧化特性,結(jié)果表明各組分均具有較好的抗氧化活性,且劑量-效果關(guān)系明顯,其中PPs-40具有最優(yōu)DPPH·清除能力,其IC50值為0.59 mg/mL;PPPs-40對(duì)O2-·具有最強(qiáng)的清除能力,其IC50值為0.64 mg/mL。不同指標(biāo)下的最強(qiáng)抗氧化組分不一致,可能與不同的抗氧化體系有關(guān),后續(xù)可以對(duì)PPs-40和PPPs-40這2個(gè)組分進(jìn)行純化和結(jié)構(gòu)解析,以制備出具有較強(qiáng)抗氧化活性的單一多糖組分。

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