響應面法優(yōu)化微波提取劍河雙鉤藤中的鉤藤堿

蔣華梅，王向前，張嬌嬌

1. 貴陽學院化學與材料工程學院（貴陽 550005）；2. 貴陽學院圖書館（貴陽 550005）

貴州“道地藥材”劍河鉤藤，2011年獲國家地理標志性產(chǎn)品。劍河鉤藤屬茜草科（Rubiaceae）鉤藤屬（Uncaria）植物，又名金鉤、鶯爪風。鉤藤有大葉鉤藤、華鉤藤、雙鉤藤。劍河鉤藤以雙鉤藤為主，帶鉤莖枝入藥，其主要成分鉤藤堿，具有清熱平肝、息風定驚、降壓的功能，用于小兒驚啼、高熱驚厥、驚癇抽搐、妊娠子癇、高血壓等[1-2]，藥用價值高，媲美于黃金，擁有“一克鉤藤堿一克金”的美譽。

劍河鉤藤的藥用、種植、貿(mào)易歷史起源于明代末年。發(fā)展至今，貴州省劍河縣已建立全省最大的鉤藤苗木繁殖基地，劍河鉤藤是國內(nèi)50余種中藥制劑的主要原料，遠銷于日本、韓國等國家。目前，對貴州劍河鉤藤的報道主要集中于育苗、種植、選育、生產(chǎn)與加工規(guī)范、微量元素等方面的研究[3-8]，有少量涉及鉤藤堿的溶劑萃取及含量測定的報道[9-13]，關于鉤藤堿的微波提取、超聲提取及提取條件優(yōu)化方面的內(nèi)容鮮有涉及。試驗以貴州省劍河縣當年生雙鉤藤曬干莖枝為原料，采用微波萃取及響應面法對鉤藤堿的提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化，旨在為貴州劍河鉤藤的藥用研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

劍河雙鉤藤（2017年9月購自貴州省劍河縣中藥店），粉碎機粉碎后過80目篩，得鉤藤粉末備用。

鉤藤堿標準品（≥99%，貴州迪大生物有限公司）；無水乙醇（重慶川東化工有限公司）。

CW-1000超聲-微波協(xié)同萃取儀（上海比朗儀器制造有限公司）；FA 1104電子分析天平（上海舜禹恒平科學儀器有限公司）；Blue Star型紫外可見分光光度計（北京萊伯泰科儀器股份有限公司）；KQ-300 DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；RE-52 A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 鉤藤堿測定波長的選擇[14]

準確稱取0.6 mg鉤藤堿標準品，用體積分數(shù)70%乙醇溶液溶解定容于25 mL容量瓶中。用紫外及可見分光光度計在200～500 nm范圍內(nèi)掃描波譜圖，確定鉤藤堿的測定波長。

1.2.2 鉤藤堿標準曲線繪制[14]

精確稱取8.0 mg鉤藤堿標準品，用體積分數(shù)70%乙醇溶液溶解定容于50 mL的容量瓶中，即為鉤藤堿標準溶液，濃度0.16 mg/mL。再分別準確移取1，2，3，4，5，6，7和8 mL鉤藤堿標準溶液，用體積分數(shù)70%乙醇溶液定容至50 mL，245 nm處測吸光度，以吸光度為橫坐標，鉤藤堿的濃度為縱坐標，繪制出標準曲線，并計算出鉤藤堿標準曲線方程及相關系數(shù)。

1.2.3 鉤藤堿質(zhì)量及得率的測定方法

準確移取0.1 mL鉤藤堿提取液，用體積分數(shù)70%乙醇溶液稀釋定容至10 mL，測吸光度，代入鉤藤堿一元線性方程求出樣品溶液鉤藤堿濃度（mg/mL），根據(jù)式（1）（2）計算樣品鉤藤堿質(zhì)量和含量。

樣品鉤藤堿質(zhì)量（mg）=樣品溶液鉤藤堿濃度（mg/mL）×10×500 （1）

樣品鉤藤堿得率（mg/g）=樣品鉤藤堿質(zhì)量（mg）/樣品質(zhì)量（g） （2）

1.2.4 單因素試驗

1.2.4.1 微波功率

稱取4份各1 g鉤藤粉末，加入100 mL體積分數(shù)70%乙醇溶液，在微波功率50，100，150和200 W分別萃取15 min，萃取3次，抽濾，合并濾液，濾液于60 ℃減壓旋轉(zhuǎn)濃縮，用70%乙醇定容至50 mL，即為鉤藤堿提取液。按1.2.3小節(jié)的方法測定計算鉤藤堿的質(zhì)量及得率。

1.2.4.2 萃取次數(shù)

稱取4份各1 g鉤藤樣品粉末，加入100 mL體積分數(shù)為70%乙醇溶液，在微波功率150 W萃取15 min，分別萃取1，2，3和4次，抽濾，合并濾液，濾液60 ℃減壓旋轉(zhuǎn)濃縮，用70%乙醇定容至50 mL，即為鉤藤堿提取液。按1.2.3小節(jié)的方法測定計算鉤藤堿的質(zhì)量及得率。

1.2.4.3 乙醇體積分數(shù)

稱取4份各1 g鉤藤樣品粉末，分別加入100 mL體積分數(shù)30%，50%，70%和90%的乙醇溶液，在微波功率150 W萃取15 min，萃取3次，抽濾，合并濾液，濾液于60 ℃減壓旋轉(zhuǎn)濃縮，用70%乙醇定容至50 mL，即為鉤藤堿提取液。按1.2.3小節(jié)的方法測定計算鉤藤堿的質(zhì)量及得率。

1.2.4.4 料液比

稱取4份各1 g鉤藤樣品粉末，按料液比1︰50，1︰100，1︰150和1︰200（g/mL）加入體積分數(shù)70%乙醇溶液，在微波功率150 W分別萃取15 min，萃取3次，抽濾，合并濾液，濾液于60 ℃減壓旋轉(zhuǎn)濃縮，用70%乙醇定容至50 mL，即為鉤藤堿提取液。按1.2.3小節(jié)的方法測定計算鉤藤堿的質(zhì)量及得率。

1.2.4.5 萃取時間

稱取4份各1 g鉤藤樣品粉末，加入100 mL體積分數(shù)70%乙醇溶液，在微波功率150 W，分別萃取5，10，15和20 min，各萃取3次，抽濾，合并濾液，濾液于60 ℃減壓旋轉(zhuǎn)濃縮，用70%乙醇定容至50 mL，即為鉤藤堿提取液。按1.2.3小節(jié)的方法測定計算鉤藤堿的質(zhì)量及得率。

1.2.5 響應曲面試驗設計

根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理及單因素試驗結(jié)果，選擇乙醇體積分數(shù)（A）、料液比（B）、萃取時間（C）3個因素，鉤藤堿得率為響應值，利用Design-Expert 8.0.6進行三因素三水平響應面試驗設計，以確定劍河雙鉤藤中鉤藤堿的最佳微波提取條件，因素水平見表1。

表1 響應面試驗因素水平表

1.2.6 驗證試驗

稱取3份各1 g劍河雙鉤藤粉末，按響應面法篩選出的最優(yōu)提取條件進行提取，按1.2.3的方法測定計算鉤藤堿的質(zhì)量及得率，計算相對標準偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 鉤藤堿測定波長的選擇

由圖1可知，鉤藤堿最大吸收波長為245 nm，即為試驗鉤藤堿的測定波長。

圖1 鉤藤堿紫外-可見吸收光譜圖

2.2 鉤藤堿的標準曲線和一元線性方程

以吸光度為橫坐標，鉤藤堿濃度為縱坐標，繪制出鉤藤堿的標準曲線（圖2）。經(jīng)計算，吸光度與鉤藤堿濃度的一元線性方程為Y=0.018 3X-0.000 1（X為吸光度；Y為濃度，mg/mL），相關系數(shù)R2=0.999 6，說明在0～0.025 6 mg/mL范圍內(nèi)，鉤藤堿質(zhì)量濃度與吸光度線性關系優(yōu)良。

圖2 鉤藤堿的標準曲線圖

2.3 單因素試驗結(jié)果

2.3.1 微波功率

如圖3所示，隨著微波功率的增大，鉤藤堿得率先增大后降低。功率150 W時，鉤藤堿得率達到最大值。微波功率的升高使鉤藤堿更易溶出，得率增大。但功率過大，造成反應體系溫度太高，促使鉤藤堿分解，得率下降。因此，選擇150 W作為提取功率。

2.3.2 萃取次數(shù)

如圖3所示，萃取3次時，鉤藤堿得率最高。此后，萃取次數(shù)增加，反應時間過長，造成鉤藤堿的分解，得率略有下降。因此，選擇萃取3次作為萃取次數(shù)。

2.3.3 乙醇體積分數(shù)

如圖3所示，隨著乙醇體積分數(shù)的增大，鉤藤堿得率呈先增后降趨勢。乙醇體積分數(shù)50%時，鉤藤堿得率達到最大。因此，選擇乙醇體積分數(shù)30%，50%和70%作為該因素的水平條件。

2.3.4 料液比

如圖3所示，隨著料液比的增大，鉤藤堿得率先急劇增大后緩慢降低。料液比1︰150（g/mL）時，鉤藤堿充分溶出，達到萃取平衡，鉤藤堿得率最高。隨后再增大料液比，得率基本不變。因此，選擇料液比1︰100，1︰150和1︰200（g/mL）作為該因素的水平條件。

2.3.5 萃取時間

如圖3所示，隨著萃取時間的增加，鉤藤堿得率先快速增大后緩慢降低。萃取時間15 min時，萃取反應完全，得率最高。隨后，萃取時間增加，體系反應溫度也升高，造成部分鉤藤堿的分解，得率下降。因此，選擇萃取時間10，15和20 min作為該因素的水平條件。

圖3 各影響因素對鉤藤堿得率的影響

2.4 響應面試驗結(jié)果

2.4.1 響應面試驗設計及結(jié)果分析

基于單因素試驗結(jié)果，選擇對鉤藤堿得率影響較顯著的3個因素，即乙醇體積分數(shù)（A）、料液比（B）、萃取時間（C）為自變量，以鉤藤堿得率（Y）為響應值，設計三因素三水平響應面試驗，試驗方案設計及結(jié)果見表2。用Design-Expert軟件對表2的試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合分析，得到劍河雙鉤藤中鉤藤堿得率（Y）的回歸模擬方程：Y=19.504 32+0.192 72A+0.184 76B+0.831 25C+2.702 00×10-4AB+0.015 009 AC-2.023 80×10-3BC-4.229 91×10-3A2-4.779 55×10-4B2-0.035 908 C2。

表2 響應曲面試驗結(jié)果

2.4.2 方差分析結(jié)果

由表3可知，該響應曲面回歸模型的p=0.003 5＜0.01，說明回歸模型極顯著，具有統(tǒng)計學意義。校正絕對系數(shù)R2=0.925 1＞0.80，變異系數(shù)CV為1.75%，說明模型擬合程度較好，響應值的變化有92.51%來自于所選的變量；模型調(diào)整系數(shù)R2adj=0.828 8，說明模型的預測性較好，實際值與預測值較接近；模型精密度為8.665＞4，說明此模型是可行的，其可靠性可通過方差分析及相關系數(shù)來考察。方程的失擬項p=0.375 0＞0.05，不顯著，表明該回歸模型擬合程度好，無失擬因素存在，誤差小，可用模型方程代替試驗真實點對試驗結(jié)果進行分析。因此，該模型可用來對微波提取劍河鉤藤中鉤藤堿的工藝條件優(yōu)化。

由各因素F值的大小可知，3個因素對鉤藤堿得率的影響程度次序為：料液比＞萃取時間＞乙醇體積分數(shù)。其中，B、AC、A2對鉤藤堿得率的影響極顯著，A、C、B2對鉤藤堿得率的影響顯著。

2.4.3 交互作用對鉤藤堿得率的影響

根據(jù)回歸方程繪出響應面圖及等高線圖，見圖4～圖6，分析乙醇體積分數(shù)、料液比、萃取時間3個因素對劍河雙鉤藤中鉤藤堿得率的交互影響。

由圖4可知，隨著乙醇體積分數(shù)和料液比的增大，劍河雙鉤藤中鉤藤堿得率先緩慢增大后減少，響應面的坡度平緩，說明兩因素的交互作用不顯著；由圖5可知，隨著乙醇體積分數(shù)和萃取時間的增加，鉤藤堿得率呈先快速增大后減少趨勢，坡度陡峭，等高線呈橢圓形，說明交互作用極顯著；由圖6可知，隨著料液比和萃取時間的增大，鉤藤堿得率先增大后減少，坡度較平緩，說明兩因素的交互作用不顯著。從等高線可知3個因素對鉤藤堿得率的影響為：料液比＞萃取時間＞乙醇體積分數(shù)。

表3 回歸模型方差分析

圖4 乙醇體積分數(shù)與料液比交互影響鉤藤堿得率的響應面圖及等高線圖

圖5 乙醇體積分數(shù)與萃取時間交互影響鉤藤堿得率的響應面圖及等高線圖

圖6 料液比與萃取時間交互影響鉤藤堿得率的響應面圖及等高線圖

2.4.4 最佳條件的確定及驗證實驗

通過Design-Expert 8.0.6軟件分析得到劍河雙鉤藤中鉤藤堿的最佳提取條件：乙醇體積分數(shù)63.66%、料液比1︰168.92（g/mL）、微波萃取時間20 min，得率49.642 7 mg/g?？紤]實際操作，將提取條件調(diào)整為：乙醇體積分數(shù)64%、料液比1︰169（g/mL）、微波萃取時間20 min。進行5次平行試驗，測得劍河雙鉤藤中鉤藤堿得率為49.553 8 mg/g，與模擬計算機值49.642 7 mg/g非常接近，表明預測值與真實值之間有很好的擬合性，進一步驗證模型的可靠性，說明采用響應面法優(yōu)化得到的最佳工藝條件可靠。

3 結(jié)論

通過對影響劍河雙鉤藤中鉤藤堿得率的微波功率、萃取次數(shù)、乙醇體積分數(shù)、料液比、微波萃取時間進行單因素和響應面試驗，建立回歸模型方程，確定劍河雙鉤藤中鉤藤堿的最佳提取工藝參數(shù)：微波功率150 W、乙醇體積分數(shù)64%、料液比1︰169（g/mL）、微波萃取時間20 min、萃取3次，該條件下鉤藤堿的得率可達49.553 8 mg/g。說明微波輔助萃取技術(shù)有利于鉤藤中鉤藤總堿的浸出。同時，試驗鉤藤樣品經(jīng)充分粉碎并過80目篩后，溶劑對樣品可進行高效、充分的萃取，萃取效率更高。