不同基原腎精子藥效的比較研究

王 飄，趙思俊，張 蕻，崔宇宏，常雅卉，王春芳

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西晉中030619； 2.山西省食品藥品檢驗(yàn)所，山西 太原030001）

腎精子為豬科動(dòng)物豬Sus scrofadomestica Brisson或?？苿?dòng)物黃牛Bos taurusdomesticus Gmelin、水牛 BubalusbubalisLinnaeus的膀胱結(jié)石［1］。腎精子在古本草中無記載，始載于《中藥材手冊(cè)拾遺》［2］，記載了腎精子“以牛膀胱結(jié)石入藥，利水消脹，主治小便不通，肚腹脹滿”，簡單描述了該藥的性狀與功效。有文獻(xiàn)報(bào)道腎精子有利水消腫及通淋的作用，將其單味用藥或復(fù)方用藥治療前列腺增生癥有較好效果［3］。本課題組前期研究初步驗(yàn)證了豬源腎精子有明顯抑制前列腺增生的作用，并確定了其藥效劑量［4］。在本研究中我們首次進(jìn)行兩種基原腎精子藥效的比較，同時(shí)驗(yàn)證牛源腎精子治療前列腺增生的效果，為以后該藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立、藥理學(xué)研究及臨床用藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試藥與試劑 腎精子（豬源腎精子與牛源腎精子均來自文水縣胡蘭鎮(zhèn)貴細(xì)藥材收購商，由山西省藥檢所副主任藥師羅晉萍鑒定為正品）使用前磨成細(xì)粉；丙酸睪酮注射液（上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)131213）、非那雄胺片（規(guī)格：5 mg，批號(hào)L029346，廠家：杭州默沙東制藥有限公司）、前列康普樂安片（規(guī)格：0.64 g，批號(hào)ZLC1629，廠家：云南白藥集團(tuán)股份有限公司）；羧甲基纖維素鈉CMC-Na（批號(hào)20160816，廠家：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、注射用花生油（批號(hào)20170910，廠家：山東魯花集團(tuán)有限公司）。

1.1.2 儀器 ME204/02電子天平（梅特勒托利多儀器有限公司）；LEICAeg1150C型包埋機(jī)（徠卡）；LEICA-RM2235輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（徠卡）；DM6000顯微鏡（徠卡）。

1.1.3 動(dòng)物 SPF級(jí)成年Sprague Dawley（SD）雄性大鼠 80只，（180±220）g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，質(zhì)量合格證號(hào)0031232。

1.2 方 法

1.2.1 造模與給藥 取雄性SD大鼠80只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，除空白組10只大鼠外，其余70只大鼠根據(jù)文獻(xiàn)去勢(shì)后皮下注射丙酸睪酮5 mg/（kg·d）復(fù)制前列腺增生動(dòng)物模型，將其分為模型組、豬源腎精子中劑量組20 mg/（kg·d）、低劑量組10 mg/（kg·d）、牛源腎精子中劑量組20 mg/（kg·d）、低劑量組10 mg/（kg·d）、前列康組1.9 g/（kg·d）及非那雄胺組0.5 mg/（kg·d）?？瞻捉M皮下注射等量植物油，連續(xù)5 w。在造模1 w后，開始灌胃給予相應(yīng)藥物5 mL/（kg·d），模型組和空白組給等量生理鹽水，連續(xù) 4 w［5-6］。

1.2.2 大鼠體質(zhì)量及一般情況觀察 每日給藥前后均觀察大鼠的一般狀態(tài)，每周稱1次體質(zhì)量以調(diào)整給藥量。

1.2.3 前列腺濕重、體積及臟器指數(shù) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，解剖大鼠（解剖前12 h禁食不禁水），完整摘取前列腺組織，小心剔除周圍脂肪，分別稱其濕重，并計(jì)算臟器指數(shù)［臟器指數(shù)=臟器濕重（mg）/體質(zhì)量（g）×100%］，用排水法測(cè)其體積。

1.2.4 前列腺組織的形態(tài)學(xué)變化 將分離出的前列腺組織固定于中性福爾馬林溶液中，經(jīng)取材、水洗、脫水、浸蠟、石蠟包埋、切片、HE染色、封片后于顯微鏡下觀察其形態(tài)變化［7-9］。在每個(gè)切片隨機(jī)取5個(gè)高倍視野（×40），每組10個(gè)組織切片，共50個(gè)視野，采用IPP圖像處理軟件統(tǒng)計(jì)上皮高度和腺腔面積，具體步驟如下：打開IPP軟件界面。通過換算像素大?。?360×1024）和校準(zhǔn)后大小219.3 μm×165.1 μm 的比例尺為 1∶9，校準(zhǔn)軟件中的比例尺；打開切片圖，用套索工具選擇圖片中的腺腔，軟件自動(dòng)標(biāo)紅并計(jì)算腺腔面積；用直線工具選中上皮最大高度和最小高度，軟件自動(dòng)標(biāo)記為直線，并計(jì)算出長度；IPP軟件導(dǎo)出數(shù)據(jù)于Excell中，用SPSS進(jìn)行組間分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)選用單因素方差分析（One-WayANOVA），組間差異進(jìn)一步采用Dunnet－t檢驗(yàn)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠體質(zhì)量及一般情況

剛完成去勢(shì)手術(shù)時(shí)大鼠狀態(tài)不好，1 w后傷口愈合完好，狀態(tài)良好。實(shí)驗(yàn)過程中空白組大鼠性情較溫順，毛色有光澤，雙目有神，生活狀態(tài)較好，無死亡。模型組大鼠脾氣暴躁，毛色不光滑，泛黃枯槁，且有部分皮膚腫脹（由于皮下注射丙酸睪酮所致），墊料潮濕快，無死亡。各組大鼠體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 腎精子對(duì)前列腺體積、濕重及臟器指數(shù)的影響

由圖1可以看出，與空白組比較，模型組前列腺組織明顯增大；與模型組比較，各給藥組大鼠前列腺組織有所減小。

與空白組比較，模型組前列腺體積及濕重增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），表明造模成功；與模型組比較，豬源中劑量組、牛源低劑量組、牛源中劑量組、前列康組及非那雄胺組大鼠前列腺體積及濕重有所減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

與空白組比較，模型組大鼠前列腺臟器指數(shù)增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），表明造模成功；與模型組比較，各給藥組大鼠前列腺臟器指數(shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

腎精子各給藥組之間前列腺體積、前列腺濕重、前列腺指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；分別與前列康組及非那雄安組比較，腎精子給藥組前列腺體積、前列腺濕重、前列腺指數(shù)差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說明兩種基源腎精子抑制前列腺增生的作用與前列康及非那雄胺相當(dāng)。結(jié)果見圖2。

2.3 腎精子對(duì)前列腺組織形態(tài)學(xué)的影響

模型組與空白組比較，大鼠前列腺上皮細(xì)胞大量增生、增厚，局部腺泡細(xì)胞排列紊亂，增生腺體多數(shù)呈乳頭狀向腔內(nèi)突出，腺腔面積不規(guī)則，間質(zhì)和腺泡內(nèi)充滿大量分泌物，并且有散在的炎癥細(xì)胞，表明造模成功。與模型組比較，腎精子豬源低劑量組、中劑量組、牛源低劑量組及中劑量組部分前列腺上皮細(xì)胞層數(shù)減少，部分乳頭狀腺體減少，極少數(shù)突入腔內(nèi)。非那雄胺組、前列康組局部組織腺體增生變厚，個(gè)別腺泡有擴(kuò)張，形成乳頭狀突入腺腔，無明顯炎細(xì)胞散在，鏡下與空白組相近。各給藥組與模型組比較，均有明顯的抑制前列腺組織增生的作用。病理組織結(jié)果見圖3，上皮高度及腔面積測(cè)量結(jié)果見表1。

圖1 各組大鼠前列腺組織圖

圖2 各組大鼠前列腺體積、濕重及臟器指數(shù)比較

圖3 大鼠前列腺組織病理切片圖（HE×100）

3 討 論

目前良性前列腺增生（BPH）是中老年男性最常見的疾病之一，該病對(duì)患者的生活質(zhì)量有顯著影響［10-11］。隨著預(yù)期壽命的增加，BPH流行率逐漸上升，但是其發(fā)病機(jī)理還不太清楚。BPH的治療手段主要有手術(shù)治療或服用5α-還原酶抑制劑及α-受體阻滯劑等，但顯示出各種類型的副作用［12-14］。中藥療效確切，毒副作用小，從整體調(diào)節(jié)及改善病情［15］，因此臨床治療多選用中藥保守防治前列腺增生癥。本實(shí)驗(yàn)通過前列腺增生動(dòng)物模型對(duì)兩種基原腎精子藥效進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)二者都可以抑制前列腺增生且療效指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 前列腺組織上皮高度及腺腔面積

目前由于腎精子來源稀少，各方面的研究幾乎處于空白，限制了該藥的臨床應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步研究其化學(xué)成分，明確藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，探索其治病機(jī)理，不斷完善該藥各方面研究，為以后更好的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。