蛇床子素對(duì)佐劑性大鼠關(guān)節(jié)炎模型治療作用研究

程永杰，張府君，吉海杰

（1.山西藥科職業(yè)學(xué)院中藥系，山西太原030031； 2.山西省中醫(yī)院，山西太原030012）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種以慢性侵蝕性關(guān)節(jié)炎為特征的自身免疫性疾病，臨床上治療的傳統(tǒng)藥物包括非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑，這些藥物的聯(lián)合應(yīng)用可緩解類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病情，但長(zhǎng)期服用這些藥物具有副作用，例如非甾體抗炎藥可引起胃腸道反應(yīng)，免疫抑制劑可抑制機(jī)體免疫力，增加患者感染肺炎、肺結(jié)核的風(fēng)險(xiǎn)。因此，研究標(biāo)本兼治、安全有效的天然藥物有重要的意義。

弗氏完全佐劑誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎與臨床類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的慢性系統(tǒng)性炎癥具有很多相似性，因此通常被用做臨床前研究模型［1］。其誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎有兩個(gè)階段，急性局部炎癥反應(yīng)一般在3~4 d內(nèi)出現(xiàn)，慢性系統(tǒng)性反應(yīng)階段一般出現(xiàn)在開始的2 w并持續(xù)數(shù)月［2］。弗氏完全佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎可以很好地用于研究病理生理學(xué)以及炎癥過程機(jī)制，同時(shí)可以用于評(píng)價(jià)藥物的抗關(guān)節(jié)炎作用［3］。蛇床子素屬香豆素類化合物，具有抗炎、抗凝血、抗心律失常以及抗過敏等藥理作用［4-9］。本研究建立佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，觀察蛇床子素對(duì)大鼠關(guān)節(jié)腫脹以及炎癥相關(guān)因子的影響，探討蛇床子素對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥品與試劑 蛇床子素，購(gòu)自成都龍泉高科天然藥業(yè)公司，批號(hào)：484-12-8；完全弗氏佐劑，美國(guó)Chondrex公司；脫脂奶粉，德國(guó)歐蒙公司；大鼠TNF-α、IL-10 ELISA試劑盒，上海滬尚生物科技公司。二甲苯、乙醇、碳酸、伊紅、中性樹脂等化學(xué)試劑均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)Wistar大鼠50只，雌雄各半，體質(zhì)量（150±10）g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：syxk（京）2006-0024。將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分籠，飼養(yǎng)于實(shí)訓(xùn)中心動(dòng)物房，自由攝食和飲水，飲水瓶每日更換1次，墊料每2 d更換1次。

1.1.3 主要儀器 Sunrise酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司；醫(yī)用注射器，美國(guó)BD公司；電子天平秤（EL104型），上海越平科學(xué)儀器有限公司；-20℃冰箱，青島海爾集團(tuán)；數(shù)碼照相機(jī)，日本尼康公司；病理切片機(jī)、自動(dòng)脫水機(jī)、組織包埋機(jī)，德國(guó)Leica公司；倒置顯微鏡，日本Olympus公司；3K15型臺(tái)式冷凍離心機(jī)，Sigma公司。

1.2 方 法

1.2.1 模型制備 將大鼠置于自制的固定盒子中，右后足跖皮內(nèi)注射0.1 mL弗氏完全佐劑，誘導(dǎo)致炎，9 d后參照關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)選取4分以上的大鼠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。正常對(duì)照大鼠注射0.1 mL生理鹽水。

1.2.2 動(dòng)物分組與給藥 造模10 d后選擇造模成功大鼠隨機(jī)分為蛇床子素低劑量組、高劑量組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組，同時(shí)設(shè)正常組，每組10只。除模型組與空白對(duì)照組以自來水灌胃外，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃給予10 mg/kg的雷公藤多苷，蛇床子素低劑量組和高劑量組分別按照10 mg/kg和50 mg/kg灌胃給藥，灌胃體積10 mL/kg，每日1次，連續(xù)2 w。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)表1標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。每只大鼠的評(píng)分包括大鼠所有病變關(guān)節(jié)評(píng)分的總和，最大分?jǐn)?shù)為16分，評(píng)分越高，其癥狀越明顯。

表1 大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.4 大鼠繼發(fā)側(cè)足體積測(cè)量 采用排水法分別于給藥后第0、7和14天測(cè)量大鼠左后足體積，以最后1次左后足體積作為治療效果評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.2.5 T淋巴細(xì)胞亞群分析 末次給藥后取外周血，EDTA抗凝；取2個(gè)試管，1個(gè)試管分別加入3種單抗（Mouse Anti-Rat CD3PE、Mouse Anti-Rat CD4FITC、Mouse Anti-Rat CD8PE-Cy7），1 個(gè)試管依次加入3種同型對(duì)照，充分混勻。然后，分別加入100 μL EDTA抗凝血，混勻，避光，室溫孵育20 min；加入 500 μL 溶血素，混勻，避光，孵育 30 min；試管中加入3 mL PBS，混勻，1500 r/min離心5 min，上清液倒去，加入500 μL PBS，混勻；采用三色流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)分析，激發(fā)激光為488 nm，F(xiàn)SvSS設(shè)門，依次測(cè)定同型對(duì)照管和相應(yīng)標(biāo)本管。應(yīng)用Navios Software分析得到各種T亞群數(shù)據(jù)和散點(diǎn)圖，分析 CD3+、CD4+和 CD8+百分比，并計(jì)算 CD4+/CD8+。

1.2.6 繼發(fā)側(cè)后肢關(guān)節(jié)滑膜病理觀察 繼發(fā)側(cè)膝關(guān)節(jié)正中縱行切開皮膚，分離肌肉，露出髕骨，繼續(xù)向下分離纖維層，取出滑膜層組織，在10%福爾馬林溶液中浸泡6 h，在4℃下于30%蔗糖溶液中過夜，用冷凍切片機(jī)切片，厚度為5 μm。冷凍切片置于溶液（無水乙醇和甲醛液各半）中固定30 s，自來水洗1~2 min。蘇木素溶液染色1 min，自來水沖洗1~2 min。1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒后，自來水沖洗。1%氨水返藍(lán)30 s后，流水沖洗。1%伊紅染色 1 min，逐級(jí)乙醇（80%、95%、100%）脫水各5 min，二甲苯透明5 min，中性樹膠封片。

1.2.7 血清細(xì)胞因子檢測(cè)［10］取大鼠血清，用ELISA方法檢測(cè)TNF-α和IL-10，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各細(xì)胞因子的相對(duì)濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行結(jié)果處理，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。統(tǒng)計(jì)分析采用OnewayANOVA或Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況比較

實(shí)驗(yàn)期間，正常組大鼠飲水、進(jìn)食、運(yùn)動(dòng)正常，體重穩(wěn)定上升，皮毛整潔，精神狀態(tài)良好；與正常組比較，模型組大鼠進(jìn)食、飲水量下降，活動(dòng)減少，皮毛光澤降低，且體重減輕，精神倦怠。各治療組大鼠狀態(tài)、活力、毛色等指標(biāo)均優(yōu)于模型組，體重均明顯增加。結(jié)果見表2。

2.2 各組大鼠繼發(fā)側(cè)足腫脹度比較

與正常組比較，模型組大鼠繼發(fā)側(cè)足腫脹度隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸加??；與模型組比較，各治療組均能降低足體積，并與劑量相關(guān)。結(jié)果見表3。

表2 各組大鼠體質(zhì)量變化比較 （g，x±s）

表3 各組大鼠繼發(fā)側(cè)足腫脹變化比較 （mL，x±s）

2.3 各組大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分比較

從造模第14天開始，模型組關(guān)節(jié)炎評(píng)分隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高，與正常組比較顯著提高。與模型組比較，蛇床子素各治療組關(guān)節(jié)炎評(píng)分降低，并呈現(xiàn)與劑量相關(guān)趨勢(shì)。結(jié)果見表4。

表4 各組大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分比較 （分，x±s）

2.4 各組大鼠T淋巴細(xì)胞亞群分析

與正常組比較，模型組T細(xì)胞亞群中CD4+無明顯變化，而CD3+和CD8+均顯著增加，從而導(dǎo)致CD4+/CD8+降低。與模型組比較，蛇床子素各治療組均不同程度降低CD3+和CD8+的比例，增加CD4+比例，從而提高CD4+/CD8+比值。結(jié)果見表5。

表5 各組大鼠T淋巴細(xì)胞亞群分析 （%，x±s）

2.5 各組大鼠繼發(fā)側(cè)關(guān)節(jié)滑膜病理觀察［11］

正常組滑膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰完整，排列整齊，無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，關(guān)節(jié)軟骨光滑、完整；模型組關(guān)節(jié)滑膜增厚明顯，滑膜內(nèi)大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，成纖維細(xì)胞增生，關(guān)節(jié)軟骨局部出現(xiàn)腫脹，脫落。與模型組比較，蛇床子素各治療組滑膜表面光滑，有少量炎細(xì)胞，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和膠原纖維增生改善明顯，關(guān)節(jié)軟骨光滑，其中以高劑量蛇床子素治療組改善最為明顯。結(jié)果見圖1。

2.6 各組大鼠血清細(xì)胞因子TNF-α和IL-10含量比較

與正常組比較，模型組血清中TNF-α和IL-10含量顯著升高；蛇床子素各治療組與模型組比較，TNF-α和IL-10含量均有所降低，尤其是蛇床子素高劑量組最為明顯。結(jié)果見表6。

表6 各組大鼠血清中TNF-α和IL-10含量比較 （ng/L，x±s）

3 討 論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎在發(fā)達(dá)國(guó)家影響了人口的1%［12］，很多具有緩解類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎癥狀的藥用植物具有與傳統(tǒng)治療藥物類似的效果［13］。在人類關(guān)節(jié)炎以及佐劑誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎模型中，常見四肢腫脹、炎癥細(xì)胞增殖、關(guān)節(jié)滑膜增生、骨和軟骨結(jié)構(gòu)侵蝕等臨床癥狀。由于病理特征類似，佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型被廣泛用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的研究，以評(píng)估抗炎藥物的有效性［14］。

本研究結(jié)果表明，蛇床子素具有一定的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎保護(hù)作用，能夠顯著改善弗氏完全佐劑引起的佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的足腫脹程度以及炎癥相

圖1 各組大鼠滑膜組織HE染色

關(guān)因子的改變。但是，目前對(duì)其抗炎作用機(jī)制的研究還不甚清楚，有待于在今后的工作中進(jìn)一步研究。