足細(xì)胞損傷與糖尿病腎病

張馨元 米焱 綜述 王彩麗 審校

糖尿病腎病(DN)是糖尿病的主要微血管并發(fā)癥之一，患病率約為20%～40%。若不及時(shí)干預(yù)，約80%的1型糖尿病和20%～40%的2型糖尿病伴微量白蛋白尿的患者在10～15年發(fā)展為臨床腎病，最終進(jìn)展為終末期腎病(ESRD)[1]。DN早期表現(xiàn)為微量白蛋白尿，因癥狀不明顯，易被忽視，疾病逐漸演變可產(chǎn)生大量白蛋白尿伴腎功能下降，其發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，確切研究還未明確。最近的研究通過證明足細(xì)胞對(duì)維系腎小球?yàn)V過屏障的重要性，突出了足細(xì)胞及相關(guān)蛋白的損傷與DN之間的密切聯(lián)系。

DN足細(xì)胞損傷機(jī)制

足細(xì)胞即腎小球臟層上皮細(xì)胞，其參與穩(wěn)定腎小球毛細(xì)血管,維持腎小球?yàn)V過屏障的功能,調(diào)節(jié)超濾系數(shù)K/f以及保持腎小球基膜(GBM)的正常形態(tài),是維持腎小球?yàn)V過屏障結(jié)構(gòu)和功能正常的主要細(xì)胞之一[2]。研究表明，足細(xì)胞損傷在DN的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵性作用[3]，包括表觀遺傳因素、氧化應(yīng)激、糖代謝異常、血流動(dòng)力學(xué)改變、細(xì)胞因子、胰島素抵抗等，這些變化導(dǎo)致各種細(xì)胞反應(yīng)，分泌因子和細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)，最終導(dǎo)致腎小球?yàn)V過屏障的破壞，以及組織學(xué)變化，包括系膜擴(kuò)張，結(jié)節(jié)性腎小球硬化和腎小管-間質(zhì)纖維化。

表觀遺傳因素表觀遺傳修飾參與了DN等多種糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。近日非編碼RNA中的微小RNA(micro RNA，miRNA)在腎臟病理學(xué)中的作用受到廣泛關(guān)注，特別是在DN方面。如miRNA-27a的敲低可減少鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)誘導(dǎo)的DN大鼠的腎臟細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)積累和尿蛋白[4]。此外，miRNA-27a/PPARr/β-連環(huán)蛋白軸能促進(jìn)DN中足細(xì)胞損傷的進(jìn)度[5]。研究發(fā)現(xiàn)，DN大鼠模型中增加的異黏蛋白(metadherin,MTDH)可通過下調(diào)miRNA-30s的表達(dá)而活化p38 MARK依賴通路促進(jìn)足細(xì)胞凋亡[6]。組蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾(post-translational histone modification，PTHMs)作為重要的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，和DN足細(xì)胞的損傷有著潛在的聯(lián)系。其中，最具特點(diǎn)的為乙?；图谆?，這兩種修飾均參加病理基因和保護(hù)基因的表達(dá)調(diào)控。Majumder等[7]特異性地從足細(xì)胞中刪除組蛋白-賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2或者抑制EZH2活性系統(tǒng)從而降低H3K27me3標(biāo)記的水平，引起Notch途徑激活，進(jìn)而促進(jìn)足細(xì)胞去分化和加速腎小球損傷。另外，抑制賴氨酸特異性去甲基化酶，可通過改變組蛋白模式而有利地改善腎小球疾病的進(jìn)展。甲基化、組蛋白修飾測序技術(shù)不僅僅是單純的DNA測序,有望成為認(rèn)識(shí)DN遺傳易感性的一個(gè)新途徑。

氧化應(yīng)激DN時(shí)機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)可通過多途徑、多方面影響足細(xì)胞的形態(tài)和功能，造成足細(xì)胞損傷。高糖刺激晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)的形成和積累，增加活性氧(ROS)的合成，從而引起持續(xù)的氧化應(yīng)激。ROS主要由NADPH氧化酶介導(dǎo)的途徑產(chǎn)生,過量的葡萄糖通過多種輔助途徑代謝，如多元醇途徑、蛋白激酶C(PKC)、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)等誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡。所有這些途徑都是互為因果，相互關(guān)聯(lián)的，即AGEs和PKC促進(jìn)氧化應(yīng)激,氧化應(yīng)激反過來加劇了AGEs和PKC的產(chǎn)生[8]。進(jìn)一步研究后發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞中糖酵解及其代謝產(chǎn)物的改善可能誘導(dǎo)線粒體的再生，這可逆轉(zhuǎn)表觀遺傳變化，或者加速細(xì)胞外基質(zhì)更新和重塑，隨后會(huì)改善腎小球功能，并延緩疾病的進(jìn)展(圖1)[9]。

圖1 氧化應(yīng)激、糖代謝異常、炎性細(xì)胞因子等機(jī)制致糖尿病腎病示意圖糖尿病腎病時(shí)，糖、脂代謝異常、氧化應(yīng)激、炎性細(xì)胞因子等多種途徑致足細(xì)胞損傷、凋亡，并出現(xiàn)蛋白尿；AGEs：晚期糖基化終產(chǎn)物；PKC：蛋白激酶C；TNF-α：腫瘤壞死因子α；MCP-1：人單核細(xì)胞趨化蛋白1；IL-6:白細(xì)胞介素6；IL-1β:白細(xì)胞介素1β；NADPH：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；MAPK：絲裂原活化蛋白激酶通路；ROS：活性氧；NF-κB：核因子κB；caspase：含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶；TGF-β：轉(zhuǎn)化生長因子β；ET-1:內(nèi)皮素1

糖代謝異常高糖直接增加腎小球系膜細(xì)胞的氧化應(yīng)激，包括葡萄糖自氧化和高血糖引起的代謝應(yīng)激。高糖狀態(tài)下葡萄糖與游離氨基酸或組織蛋白結(jié)合,并最終形成不可逆AGEs,而后者可直接引起足細(xì)胞損傷[10]。生理?xiàng)l件下腎臟晚期糖基化終末化產(chǎn)物受體(RAGE)主要在足細(xì)胞表達(dá),DN時(shí)足細(xì)胞RAGE表達(dá)增加,因而推測AGEs可能是通過RAGE介導(dǎo)的機(jī)制損傷足細(xì)胞。AGE與細(xì)胞膜上的RAGE結(jié)合后,激活多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等,增加炎癥因子等的表達(dá),最終改變組織細(xì)胞的功能,甚至產(chǎn)生組織破壞，從而促進(jìn)DN進(jìn)展[11]。有研究發(fā)現(xiàn)AGEs通過氧化應(yīng)激反應(yīng)可引起胰島β細(xì)胞合成及釋放胰島素功能障礙，誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡，還可抑制胰島β細(xì)胞發(fā)生自噬作用從而促進(jìn)胰島β細(xì)胞凋亡[12]。

血流動(dòng)力學(xué)改變DN早期即可出現(xiàn)血流動(dòng)力學(xué)異常，高血糖、AGE及高血壓等機(jī)械應(yīng)力都會(huì)使血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)水平增加。AngⅡ通過改變足細(xì)胞蛋白表達(dá)及分布對(duì)足細(xì)胞造成直接損傷。此外,AngⅡ還促使細(xì)胞增生、增加細(xì)胞凋亡[13]。Ang Ⅱ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可激活足細(xì)胞中處于潛伏期的轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF-β)活性增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致GBM增厚和足細(xì)胞損傷等。TGF-β也可能導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡和啟動(dòng)時(shí)，與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)一起脫離GBM造成腎小球的硬化。腎小球毛細(xì)血管張力及壓力增高使AngⅡ、生長因子等合成和釋放增多，從而促進(jìn)DN的發(fā)展[14]。研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及其受體在DN時(shí)上調(diào)，與腎小球高濾過、蛋白尿、腎小球肥大有關(guān)[15]。DN時(shí)足細(xì)胞和血清中的VEGF水平增強(qiáng)，表明VEGF可能有助于DN的發(fā)病。有研究報(bào)道增強(qiáng)自噬可以抑制VEGF的表達(dá)，對(duì)足細(xì)胞功能的維持十分重要[16]。

炎性細(xì)胞因子炎性細(xì)胞因子如巨噬細(xì)胞集落刺激因子、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素6 (IL-6) 、IL-1β、核因子κB (NF-κB) 等均參與了DN的發(fā)生發(fā)展[17]。研究中，可以發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠的腎臟與血清中TGF-β和IL-10的增加，糖尿病中AGE介導(dǎo)的ROS引起促進(jìn)TGF-β和結(jié)締組織等硬化炎性因子的產(chǎn)生。一些研究證實(shí)了NF-κB介導(dǎo)的炎癥通路誘發(fā)了糖尿病動(dòng)物ECM積聚和足細(xì)胞產(chǎn)生損傷[18]。另外，蛋白S是炎癥反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)因子,和TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)是DN發(fā)病機(jī)制的驅(qū)動(dòng)因素。培養(yǎng)的足細(xì)胞中的PS過表達(dá)抑制了高葡萄糖和TNF-α誘導(dǎo)的促炎反應(yīng)[19]。上述炎癥因子與氧化應(yīng)激、糖代謝紊亂等相互作用從而引發(fā)一系列的損傷。

胰島素抵抗胰島素抵抗(IR)是指靶細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性降低或胰島素介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)障礙。研究表明足細(xì)胞為胰島素敏感細(xì)胞[20]，炎性因子與脂代謝紊亂等因素均參與了胰島素抵抗。Reidy 等[21]研究顯示糖尿病早期足細(xì)胞就已經(jīng)出現(xiàn)了特異性的胰島素抵抗，再次說明了破壞足細(xì)胞上正常的胰島素信號(hào)傳導(dǎo)是DN的發(fā)生發(fā)展的病理分子機(jī)制。

足細(xì)胞相關(guān)蛋白與DN的相關(guān)性

足細(xì)胞相關(guān)蛋白按其功能區(qū)域可分為基膜區(qū)蛋白、頂膜區(qū)蛋白、裂孔隔膜(SD)蛋白及細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白,足細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)異常,參與或?qū)е铝薉N的進(jìn)程。

基膜區(qū)蛋白的異常足細(xì)胞基膜區(qū)表達(dá)一系列的細(xì)胞-基質(zhì)黏附受體，整合素α3β1是一種重要的受體，可以將足細(xì)胞與GBM緊密連接,還參與細(xì)胞骨架的形成[22]。然而，在病理?xiàng)l件下，整合素α3β1會(huì)使足細(xì)胞的遷移或脫落增加,并且在DN的早期階段就可以觀察到整合素水平的變化[23]，高血糖可以下調(diào)人和大鼠整合素α3β1的表達(dá)，并觸發(fā)整合素連接激酶(ILK)的激活。 ILK是足細(xì)胞生物學(xué)必不可少的。 ILK的異常影響足細(xì)胞的黏附能力從而誘導(dǎo)足細(xì)胞與GBM分離。有研究表明AGEs可直接抑制足細(xì)胞的黏附能力，上調(diào)ILK表達(dá)和激活局部RAS[24]。此外，高血糖誘導(dǎo)的ROS也會(huì)降低α3β1整合素表達(dá)并最終導(dǎo)致足細(xì)胞脫離GBM。最近的研究表明細(xì)胞內(nèi)整合素β1和整合素β3表達(dá)增加，足細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)。這可能是其在HG條件下對(duì)足細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用的潛在機(jī)制之一[25]。

頂膜區(qū)蛋白的異常足細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白podocalyxin(PCX)是足突頂膜區(qū)主要的帶負(fù)電荷的唾液蛋白，對(duì)保持腎小球?yàn)V過功能的完整性有著重要作用。事實(shí)上，SD相關(guān)蛋白的損傷和mRNA的表達(dá)與其PCX尿、蛋白尿程度有關(guān)，尿PXC水平越高則腎小球的損害越嚴(yán)重，進(jìn)而可以作為預(yù)測DN進(jìn)程的生物標(biāo)志物[26]。另外，Economou等[27]在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型中發(fā)現(xiàn),PCX的表達(dá)較正常對(duì)照組下降45%,以高糖刺激體外培養(yǎng)足細(xì)胞后PCX的表達(dá)幾乎全部被抑制,故認(rèn)為DN時(shí)podocalyxin表達(dá)量下降,腎小球?yàn)V過電荷屏障減弱,促進(jìn)蛋白尿的發(fā)生,加速DN的進(jìn)展。

SD蛋白的異常裂孔膜蛋白分子包括nephrin、podocin、CD2AP、NEPH1、densin、P-cadherin、ZO-1、FAT等，其中較關(guān)鍵的SD分子有nephrin、podocin、CD2AP、TRPC6，它們參與穩(wěn)定SD的完整性。Nephrin作為SD的核心，也是足細(xì)胞中的信號(hào)傳導(dǎo)中樞，調(diào)節(jié)細(xì)胞極性、黏附，維持細(xì)胞骨架，參與足細(xì)胞生存等。nephrin在SD中的表達(dá)對(duì)于屏障維持至關(guān)重要，其通過podocin和CD2AP與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架相連,其中任何一種蛋白質(zhì)的突變都可能導(dǎo)致足細(xì)胞損傷和大量蛋白尿。已有研究發(fā)現(xiàn),Nephrin基因的啟動(dòng)子區(qū)存在DNA甲基化和組蛋白修飾調(diào)控,并且其表遺傳修飾水平受到轉(zhuǎn)錄因子Kruppel樣因子4 (kruppel-like factor4,KLF4) 的調(diào)節(jié)。KLF4 是一種具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，在腎臟發(fā)育及分化時(shí)期發(fā)揮重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，與足細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)密切相關(guān)[28]。podocin 是繼 nephrin 后發(fā)現(xiàn)的另一種特異性表達(dá)于SD的相關(guān)蛋白。研究發(fā)現(xiàn) DN 患者足細(xì)胞 podocin 蛋白表達(dá)降低，且其表達(dá)減少與尿蛋白增加相關(guān)[29]。nephrin、podocin 和neph1組成 nephrin-podocin-neph1 受體復(fù)合物，編碼這些蛋白的基因缺失及突變，將導(dǎo)致腎小球?yàn)V過功能障礙，該復(fù)合物以及其他細(xì)胞間連接蛋白與細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白相互作用，從而調(diào)節(jié)足突細(xì)胞骨架的形態(tài)學(xué)和動(dòng)力。CD2AP 是維持 SD 復(fù)合體結(jié)構(gòu)及功能的另一種重要蛋白，除直接與 podocin 等多種 SD 蛋白發(fā)生作用外，同時(shí)還可作為橋接蛋白與細(xì)胞骨架蛋白[α輔機(jī)動(dòng)蛋白4(α-actinin-4)] 發(fā)生聯(lián)系以保持足突處于正常狀態(tài)[30]。CD2AP 與 podocin 在足細(xì)胞內(nèi) SD 處發(fā)生連接，正常情況下它們?cè)谧阃缓蚐D的形成中發(fā)揮著協(xié)同作用，CD2AP 蛋白表達(dá)的減少，可同時(shí)伴 podocin蛋白表達(dá)降低，它們的減少導(dǎo)致了足細(xì)胞發(fā)育停滯，與蛋白尿的發(fā)生與發(fā)展、腎小球的病變有著密切關(guān)系。TRPC6與nephrin在足細(xì)胞存在共定位分布,并且二者之間存在直接聯(lián)系。TRPC6高表達(dá)能減少足細(xì)胞nephrin的表達(dá),但對(duì)其分布無明顯影響,這可能是TRPC6參與足細(xì)胞損傷、加重蛋白尿的機(jī)制之一[31]。研究表明Ang Ⅱ可通過刺激炎癥介質(zhì)分泌而激活足細(xì)胞中的TRPC6通道加重白蛋白尿[32](圖2)。

圖2 糖尿病腎病中足細(xì)胞相關(guān)蛋白異常表達(dá)高血糖、TGF-β/Smad等多種途徑、通路影響足細(xì)胞正常形態(tài)從而使足細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)異常進(jìn)而加重糖尿病腎病的發(fā)展；EMT:上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化；TRPC6：瞬時(shí)受體電位陽離子通道6；P-cad：鈣黏蛋白；ZO-1：緊密連接蛋白;TGF-β:；轉(zhuǎn)化生長因子β;CD2AP:CD2相關(guān)蛋白;Densin:密度蛋白;NEPH1:腎病樣蛋白1抗體

最近發(fā)現(xiàn)在人和小鼠足細(xì)胞中特異性表達(dá)的srGAP2a蛋白,其與足細(xì)胞標(biāo)志蛋白synaptopodin共定位,DN患者和db/db小鼠腎小球中表達(dá)顯著下降。srGAP2a蛋白與DN臨床表型蛋白尿和eGFR密切相關(guān),對(duì)維持足細(xì)胞細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性起著重要作用,其主要是通過抑制RhoA和Cdc42的過度活化來穩(wěn)定F-actin。在DN狀態(tài)下,srGAP2a表達(dá)顯著下調(diào),可能促使RhoA和Cdc42活性增加,從而出現(xiàn)足細(xì)胞遷移增加,骨架重排,進(jìn)而足細(xì)胞從基底膜上脫落。外源性給予srGAP2a可緩解DN的足細(xì)胞損傷和蛋白尿的產(chǎn)生[33]。

細(xì)胞骨架蛋白的異常細(xì)胞骨架是維持足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的核心因素，對(duì)于足細(xì)胞細(xì)胞骨架的持續(xù)性調(diào)節(jié)是維持腎小球?yàn)V過屏障的至關(guān)重要的因素[34]。目前已發(fā)現(xiàn)的足細(xì)胞骨架蛋白有α-actinin-4、synaptopodin、波形蛋白、結(jié)蛋白(desmin)和巢蛋白(Nestin)等。細(xì)胞骨架蛋白最主要的分子組成是F-actin,其相關(guān)蛋白α-actinin-4、synaptopodin等將F-actin交聯(lián)在一起，起橋梁作用，分別連接基膜的整合素和裂孔膜蛋白，對(duì)維持足細(xì)胞正常形態(tài)功能起重要作用。

小結(jié)：DN時(shí),足細(xì)胞損傷機(jī)制及相關(guān)蛋白表達(dá)的改變,將導(dǎo)致腎小球?yàn)V過屏障結(jié)構(gòu)和功能的異常,從而促使尿蛋白形成和或腎小球硬化。因此,如果能有效地改變 DN 時(shí)足細(xì)胞結(jié)構(gòu)或功能或改變其相關(guān)分子的表達(dá)狀況,有望在 DN 的防治上取得突破性進(jìn)展。