腎功能對(duì)慢性腎臟病血清游離輕鏈的影響

李旭涵 陳 欣 諶達(dá)程 劉 豐 王荔枝 陳朝紅 程 震

背 景

單克隆免疫球蛋白病(monoclonal gammopathy，MG)是以克隆性增殖的漿細(xì)胞或B淋巴細(xì)胞為基礎(chǔ)所導(dǎo)致的全身多系統(tǒng)受累的一類疾病，其診斷需通過(guò)檢測(cè)循環(huán)中單克隆免疫球蛋白(MIg)或輕鏈成分，最常用的檢測(cè)方法有血清蛋白電泳、尿本-周蛋白檢測(cè)、免疫固定電泳等。近年來(lái)，游離輕鏈(free light chian,FLC)檢測(cè)作為一種更敏感的篩查方法，漸被應(yīng)用到MG的篩查、診斷和療效評(píng)判，異常的游離輕鏈比值常提示MG相關(guān)疾病[1-3]。

FLC在腎臟清除，在近端腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣形成受體-配體復(fù)合物，經(jīng)胞吞作用至囊泡中，最終在成熟的溶酶體內(nèi)被水解為肽和氨基酸[4]。FLC有κ和λ兩種類型，在腎功能正常的情況下，κ/λ比值在0.26～1.65范圍[3,5]。中國(guó)健康人群κ/λ的參考范圍在0.32 ～1.52[6]。腎功能不全時(shí)，腎臟對(duì)FLC的清除減慢，網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞成為FLC的主要的清除途徑，血清中FLC的半衰期變長(zhǎng)，血清κFLC、λFLC水平逐漸升高，κ/λ超出上述范圍達(dá)到0.37～3.1[7-8]。選擇何種范圍作為血清游離輕鏈比值的正常參考范圍仍存在爭(zhēng)議[9-13]。但在慢性腎臟病(CKD)人群中，血清FLC及比值的參考范圍仍不明確，本研究通過(guò)對(duì)不同腎功能分期的患者的FLC水平及其他臨床資料進(jìn)行單中心回顧性研究，探究腎功能對(duì)FLC水平、比值的影響，初步確定參考范圍，并探索其在MG診斷上的應(yīng)用。

對(duì)象和方法

研究對(duì)象納入病例符合：(1) 東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院腎臟病國(guó)家級(jí)臨床研究中心住院，病歷數(shù)據(jù)完整；(2) 2016年10月至2017年12月行血清FLC、腎功能及尿液檢測(cè)。(3)檢測(cè)前1月內(nèi)未進(jìn)行化療、自體干細(xì)胞移植或大劑量免疫抑制治療。納入患者共2 711例，其中MG患者278例，非MG患者2 433例。重復(fù)住院患者僅提取第一次住院資料。

實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)血清FLC使用Freelite法檢測(cè)。腎功能指標(biāo)包括血清肌酐、胱抑素C及估算的腎小球?yàn)V過(guò)率(eGFR)(CKD-EPI公式)。尿液指標(biāo)包括24h尿蛋白定量、尿沉渣紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)。

腎功能分組標(biāo)準(zhǔn):正常腎功能組(n=778):eGFR 90～125 ml/(min·1.73 m2); eGFR升高組(n=329):eGFR>125 ml/(min·1.73 m2); 輕度腎功能不全組(n=511):eGFR 60～90 ml/(min·1.73 m2); 中度腎功能不全組(n=423):eGFR 30～60 ml/(min·1.73 m2);重度腎功能不全組(n=198):eGFR 15～30 ml/(min·1.73 m2); 極重度腎功能不全組(n=125):eGFR≤15 ml/(min·1.73 m2)。另有69例患者檢測(cè)時(shí)已接受血液透析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用RStudio(1.1.456)和SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及圖表制作。組間差異使用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，各腎功能分組的組間差異使用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。相關(guān)性由Spearman秩相關(guān)分析評(píng)估。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。參考范圍制定方法部分參考實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)參考范圍制定指南第三版(C28-A3)[14]。敏感性、特異性、ROC曲線、曲線下面積(AUC)評(píng)估診斷效率。

結(jié) 果

研究人群男性1 646例，女性1 065例，平均年齡44.95±14.82歲。部分患者合并病毒性肝炎、感染(P<0.05)及合并自身免疫疾病者(P<0.01)FLC有較明顯差異，這些病例(n=320)在確定參考范圍時(shí)被排除(圖1)。

圖1 研究人群分組流程圖eGFR:估算的腎小球?yàn)V過(guò)率

血清FLC參考范圍與腎功能以腎功能正常并除外自身免疫疾病、肝炎病毒感染患者作為腎功能正常組患者(n=690)，得到95%置信區(qū)間：κFLC范圍10.75～68.22 mg/L，λFLC范圍12.16～50.29 mg/L，κ/λFLC范圍0.49～1.93。

相關(guān)分析示：κFLC與血清肌酐、胱抑素C呈明顯正相關(guān)，與eGFR呈明顯負(fù)相關(guān)，其中與胱抑素C相關(guān)性最強(qiáng)(相關(guān)系數(shù)0.72)；λFLC與κFLC相同，亦與胱抑素C呈較強(qiáng)的正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)0.69)，與尿紅細(xì)胞、尿蛋白定量等指標(biāo)相關(guān)關(guān)系較弱。κ/λ有相同的相關(guān)傾向，但與eGFR相關(guān)性較強(qiáng)(相關(guān)系數(shù)-0.34)(圖2)(P<0.01)。

圖3 腎功能與FLC級(jí)比值的小提琴圖、散點(diǎn)圖FLC：游離輕鏈；血清FLC在不同腎功能分組存在差異，當(dāng)腎功能下降時(shí)，血清FLC呈升高趨勢(shì)；Normal：正常腎功能組；Mild：輕度腎功能不全；Moderate：中度腎功能不全；Severe：重度腎功能不全；Extreme：極重度腎功能不全；HD：血液透析；A：κFLC與腎功能分組小提琴圖，組間差異 χ2=1101.3，df=5，P<2.2e-16；B：λFLC與腎功能分組小提琴圖，組間差異 χ2=957.2，df=5,P<2.2e-16；C：κ/λ比值與腎功能分組小提琴圖，組間差異 χ2=273.62,df=5,P<2.2e-16；D：κ/λ比值與eGFR散點(diǎn)圖，呈負(fù)相關(guān)，紅色為線性擬合(截距1.540889，斜率-0.003986，P<0.001 )，橙色為平滑曲線擬合

κFLC、λFLC隨腎功能惡化逐級(jí)升高，腎功能不全組的κ/λ較正常腎功能組亦明顯升高(P<0.000 1)(圖3A～C)。但κ/λ不呈逐級(jí)升高趨勢(shì)，在正常至中度腎功能不全組呈逐級(jí)升高，在重度腎功能不全與極重度腎功能不全組κ/λ呈逐級(jí)下降(P<0.05)，血液透析組κ/λ與腎功能正常組差異顯著(P<0.001)，與其余腎功能不全組均無(wú)明顯差異(圖3C～D)。

CKD患者血清FLC及κ/λ比值的范圍較正常腎功能組明顯增寬，κFLC范圍為11.10～152.89 mg/L，λFLC范圍為12.20～118.52 mg/L，κ/λ范圍為0.52～2.36。各腎功能組κ/λ參考范圍如下：輕度腎功能不全0.55～2.44，中度腎功能不全 0.68～2.43，重度腎功能不全0.59～2.65，極重度腎功能不全0.71～2.37。

圖2 FLC與年齡、腎功能指標(biāo)、尿蛋白、尿紅細(xì)胞、腎小管損傷指標(biāo)等的相關(guān)性矩陣藍(lán)色為正相關(guān)，紅色為負(fù)相關(guān)，相關(guān)性越強(qiáng)顏色越深，右側(cè)餅圖代表相關(guān)系數(shù)。age：年齡；FLC：血清游離輕鏈；SCr:血清肌酐；eGFR：估算的腎小球?yàn)V過(guò)率；CysC：血清胱抑素C；uRBC：尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)；UP：24h尿蛋白定量；uRBP，尿視黃醇結(jié)合蛋白；uNAG:尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶

血清κ/λ比值的診斷效率為更有效地診斷MG患者，我們選取非MG患者及血免疫固定電泳陽(yáng)性的MG患者共2 610例，對(duì)κ/λ的診斷效率進(jìn)行評(píng)估。前文得到的κ/λ參考范圍0.49～1.93在不同腎功能分組的敏感性、特異性、AUC見(jiàn)表1。

表1 κ/λ參考范圍0.49～1.93在不同腎功能分組診斷MG*

*:295例估算的腎小球?yàn)V過(guò)率>125 ml/(min·1.73m2) 及69例血液透析患者未列出

使用前文的κ/λ正常參考范圍0.49～1.93，腎功能不全時(shí)的擴(kuò)大范圍0.52～2.36，以及既往文獻(xiàn)中的診斷范圍，計(jì)算敏感度、特異度、AUC。其中擴(kuò)大的范圍0.52～2.36診斷效率較高。按照腎功能分層使用不同診斷范圍[eGFR≥90 mL/(min·1.73 m2)時(shí)使用0.49～1.93作為診斷范圍，eGFR 60～90 mL/(min·1.73 m2)時(shí)使用0.55～2.44；eGFR 30～60 mL/(min·1.73 m2)時(shí)使用0.68～2.43；eGFR 15～30 mL/(min·1.73 m2)時(shí)使用0.59～2.65；eGFR≤15 mL/(min·1.73 m2)時(shí)使用0.71～2.37]可提高診斷敏感性，且曲線下面積最大(AUC=0.865)(圖4，表2)。MG組患者使用上述按照腎功能分層的方法，在不同類型的MG患者κ/λ的敏感度不同(表3)。

圖4 不同κ/λ參考范圍及分層方法診斷單克隆免疫球蛋白病的ROC曲線

表2 不同參考范圍在測(cè)試集上的敏感度、特異度、曲線下面積

*:估算的腎小球?yàn)V過(guò)率(eGFR)≥90 ml/(min·1.73m2)時(shí)使用0.49～1.93作為診斷范圍， eGFR 60～90 ml/(min·1.73m2)時(shí)使用0.55～2.44；eGFR 30～60 ml/(min·1.73m2)時(shí)使用0.68～2.43；eGFR 15～30 ml/(min·1.73m2)時(shí)使用0.59～2.65；eGFR≤15 ml/(min·1.73m2)時(shí)使用0.71～2.37作為診斷范圍

表3 κ/λ診斷不同單克隆免疫球蛋白病疾病的診斷敏感性**

**:表中其他診斷患者(n=48)例因樣本量較小未列出，包括輕重鏈沉積病、POEMS綜合征、單克隆相關(guān)C3腎炎、伴單克隆免疫球蛋白沉積的腎小球膜性病變等

討 論

近年來(lái)，游離輕鏈檢測(cè)作為一種更敏感的方法，逐漸應(yīng)用在MG的篩查、診斷和療效評(píng)判中。2002年，Katzmann等[2]首次報(bào)告了127例健康樣本的血清FLC檢測(cè)結(jié)果， κ/λ的參考范圍為0.26～1.65。2008年，Hutchison等[8]報(bào)道688例慢性腎功能不全患者血清κFLC、λFLC水平隨腎功能惡化逐漸升高，κ/λ范圍也隨之?dāng)U大至0.37～3.1(以上均100%置信區(qū)間)。在腎功能不全患者中，κ/λ的正常參考值范圍仍存在爭(zhēng)議。2015年，Yadav等[15]建議在晚期腎功能不全患者κ/λ應(yīng)使用擴(kuò)大范圍0.37～3.1作為診斷范圍。2015年Schmidt-Hieltjes等[12]則報(bào)道不同腎功能的患者κ/λ范圍為0.56～1.86(95%置信區(qū)間)，隨腎功能下降無(wú)顯著變化。

本研究首次在CKD患者中探討了血清FLC及比值與腎功能的關(guān)系，并給出相應(yīng)的參考值范圍。隨腎功能惡化，CKD患者血清κFLC、λFLC水平逐漸升高，κ/λ范圍相應(yīng)擴(kuò)大：本研究中腎功能正常時(shí)的κ/λ參考值范圍0.49～1.93，腎功能不全時(shí)參考值范圍0.52～2.36。正常情況下κFLC產(chǎn)生更多，和λFLC的產(chǎn)生量之比約為2∶ 1[2]。κFLC多呈單體，λFLC多呈二聚體，使得λFLC的清除速率較慢，所以腎功能正常時(shí)血清κ/λ<2[16]。腎功能不全時(shí)，F(xiàn)LC清除減慢，使血清濃度升高，且網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞逐漸取代近端小管上皮細(xì)胞成為主要清除途徑，此途徑較少受分子量影響，κFLC與λFLC清除趨近同步，使得血清κ/λ較腎功能正常時(shí)升高。與κFLC、λFLC不同的是，κ/λ并非隨腎功能不全加重而逐級(jí)升高，在較嚴(yán)重的腎功能不全時(shí)，κ/λ比值上升的趨勢(shì)有所改變。2015年Schmidt-Hieltjes等[12]發(fā)現(xiàn)，κ/λ僅在eGFR 60～90 mL/(min·1.73 m2)與eGFR30～60 mL/(min·1.73 m2)兩組，以及eGFR 60～90 mL/(min·1.73 m2)與eGFR 15～30 mL/(min·1.73 m2)兩組間存在差異(P< 0.05)，其他組間無(wú)顯著差異。2015年Erdem等[13]的研究也觀察到κ/λ在CKD5期時(shí)降低(P<0.05)。但為何出現(xiàn)這種變化有待進(jìn)一步研究，可能與營(yíng)養(yǎng)狀況、免疫狀態(tài)異常等因素有關(guān)。

本研究中，腎功能相對(duì)正常的CKD患者中，F(xiàn)LC的正常參考值范圍均較既往文獻(xiàn)健康人群的范圍更寬且偏高。原因可能與腎臟疾病、年齡、置信區(qū)間的選擇、機(jī)體免疫狀態(tài)以及住院患者用藥有關(guān)。盡管我們選擇參考范圍時(shí)，已將存在某些合并癥(肝炎、自身免疫疾病等)的患者排除在外，但CKD如IgA腎病、微小病變腎病、糖尿病腎病中多伴隨免疫功能紊亂和微炎癥狀態(tài)，這可能是其血清FLC水平高于健康人群的原因。

血清FLC濃度受多種因素影響，隨腎功能下降、年齡增長(zhǎng)，及感染、免疫紊亂、肝臟疾病時(shí)，血清FLC濃度升高；化療后，血清FLC濃度可減低[8,19-20]。多克隆疾病也影響血清FLC水平，如糖尿病腎病、狼瘡性腎炎及間質(zhì)性腎損傷患者血清FLC水平明顯升高，但κ/λ比值仍在正常范圍內(nèi)；自身免疫性疾病患者血清FLC濃度升高，且可與活動(dòng)性相關(guān)[17-18]。另有研究報(bào)道慢性阻塞性肺疾病、過(guò)敏性疾病等慢性炎癥性疾病患者血清FLC升高[19-20]?？赡艿臋C(jī)制為漿細(xì)胞參與了炎癥細(xì)胞的激活，此過(guò)程中產(chǎn)生過(guò)量的FLC。而MG不僅影響血清FLC水平，也影響κ/λ范圍。

不同類型的MG疾病影響κ/λ比值的診斷效能。在多發(fā)性骨髓瘤(MM)、輕鏈沉積病(LCDD)、系統(tǒng)性淀粉樣變性等腫瘤負(fù)荷較高的MG疾病，κ/λ診斷敏感性較高，而在腫瘤負(fù)荷較低的疾病如伴單克隆免疫球蛋白G沉積的增生性腎小球腎炎中敏感度較差[21-23,25]。不同疾病亞型也影響其診斷，如κ/λ在輕鏈型MM有著較高的敏感度，完整免疫球蛋白型MM次之，不分泌型MM敏感性較差[24-25]。 所以在使用血清FLC協(xié)助臨床診斷時(shí)，需注意到不同疾病種類及其腫瘤負(fù)荷會(huì)影響診斷MG的敏感度。

我們將得到的κ/λ范圍在本研究的樣本中進(jìn)行檢測(cè)，按照腎功能不全程度分層使用相應(yīng)診斷范圍時(shí)曲線下面積最大，診斷MG的敏感性為78.0%，較既往文獻(xiàn)報(bào)道更敏感[21]。此方法在我們的樣本中，相較既往文獻(xiàn)中發(fā)表的診斷范圍，可明顯提高診斷效率。但此方法較為繁瑣，臨床上可以使用相對(duì)更簡(jiǎn)潔的分層方法，即在eGFR≥90 ml/(min·1.73 m2)時(shí)使用0.49～1.93作為診斷范圍，eGFR<90 ml/(min·1.73 m2)時(shí)使用擴(kuò)大的范圍0.52～2.36。此方法在我們的樣本中診斷敏感性亦達(dá)73.45%，曲線下面積為0.835。

κ/λ診斷MG存在一定的假陽(yáng)性。有研究報(bào)道在非MG的患者中，有30.1%患者的血清κ/λ超出0.37～3.1范圍，在炎癥/肝病等情況下，球蛋白總體水平升高，游離輕鏈產(chǎn)生更多，可導(dǎo)致比值超過(guò)正常范圍[26]。我們建議使用血清FLC篩查MG時(shí)，需要考慮患者腎功能及免疫狀況，聯(lián)合免疫固定電泳、血清蛋白電泳及尿液檢測(cè)，提示異?；蚺R床高度懷疑MG可能時(shí)，應(yīng)進(jìn)一步行骨髓檢查或組織活檢[21,27]。MG所產(chǎn)生的單克隆FLC是否具有特殊構(gòu)型或抗原表位，是否可以通過(guò)更特異的方法對(duì)單克隆FLC進(jìn)行檢測(cè)，亟待進(jìn)一步研究。

本研究首次在CKD患者群評(píng)估血清游離輕鏈并給出參考范圍，樣本量較大，具有臨床實(shí)用價(jià)值。但作為單中心回顧性研究，未能在其他人群中驗(yàn)證，且缺乏健康人群作為對(duì)照，有一定的局限性，需進(jìn)一步多中心前瞻性研究。