miR-130b與碘難治性分化型甲狀腺癌的關(guān)系研究

李德宇，李 娜，李文亮，李東麗，楊 輝，王麗君

0 引言

甲狀腺癌(Thyroid carcinoma，TC)是臨床上最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤之一，近年來，隨著對甲狀腺良性病變及甲狀腺癌篩查力度的加大，我國甲狀腺癌的確診率逐年上升[1]。90%以上的TC患者都屬于分化型甲狀腺癌(Differentiate thyroid carcinoma，DTC)，雖然DTC患者的預(yù)后良好，生存率較高，但是部分腫瘤細胞仍存在浸潤性行為[2]。131I照射是目前臨床上的主要治療手段之一，可用于術(shù)后清甲或清除復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移病灶[3]。但是臨床上仍有部分DTC患者治療無效或治療一段時間后逐漸無效[4]，因此，在131I照射前尋找新的特異性指標對于預(yù)后評估以及個體化治療具有重要的臨床意義。近年研究發(fā)現(xiàn)，越來越多的miRNAs與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[5]，研究者開始關(guān)注miRNAs作為多種腫瘤診斷和治療標志物的潛力。以往大多數(shù)的研究集中在診斷TC與良性結(jié)節(jié)的差異上，關(guān)于miRNAs與131I攝取的關(guān)系探討尚少。筆者基于前期調(diào)查和研究，篩選了與DIC密切相關(guān)的miR-130b作為候選標志物，通過實驗室方法檢測miRNAs在碘難治性DTC(Radioiodian refractory differentiate thyroid carcinoma，RR-DTC)患者腫瘤組織中的表達情況，探討其診斷價值及其與預(yù)后的關(guān)系?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年1月至2015年12月在我院就診并行甲狀腺全切除后聯(lián)合131I照射治療的遠處轉(zhuǎn)移DTC患者104例，男65例，女39例，年齡28～76歲，平均年齡為(55.67±10.25)歲。收集患者新鮮組織標本，立即置于液氮中暫時保存，待送到實驗室后保存至-80 ℃，用于提取組織RNA。所有患者均符合2015年由美國甲狀腺學(xué)會發(fā)表的“The American Thyroid Association Guidelines Task Force on Thyroid Nodules and Differentiated Thyroid Cancer”[6]中關(guān)于DTC的診斷標準。其中甲狀腺乳頭狀癌(Papillary thyroid carcinoma，PTC)93例，甲狀腺濾泡狀癌(Follicular thyroid carcinoma，F(xiàn)TC)11例。本項研究獲得我院倫理委員會的批準。

1.2 入選和排除標準

1.2.1 入選標準 ①行甲狀腺全切除患者。②至少接受2個療程131I照射治療。③經(jīng)病理活組織檢查確診為DTC。④所有患者均符合遠處轉(zhuǎn)移DTC的診斷標準：經(jīng)骨穿刺或術(shù)后病理證實為遠處轉(zhuǎn)移；131I全身顯像提示發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，甲狀腺球蛋白(Thyroglobulin，Tg)水平升高，X線、CT或MRI等影像學(xué)檢查中至少1種提示陽性；符合上述任意1條，可判斷發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。⑤臨床資料完整。⑥患者簽署知情同意書。

1.2.2 排除標準 ①不符合上述納入標準的患者；②合并其他腫瘤者；③合并嚴重高血壓、心律失常、冠心病及心功能不全者；④合并肝腎功能嚴重損傷，不能耐受131I照射治療者；⑤合并凝血功能異常或有嚴重出血傾向者；⑥中途自愿退出者。

1.3 研究方法

1.3.1 實驗分組 隨訪36個月，中位隨訪時間為28.5個月。根據(jù)影像學(xué)檢查結(jié)果，原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶消失或縮小即為治療有效，將患者分為RR-DTC組和碘治療有效組(R-DTC組)。碘治療有效的判斷標準包括治愈和好轉(zhuǎn)。治愈：131I照射5～7 d，全身顯像及輔助影像學(xué)檢查顯示原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶消失，Tg水平維持在2 ng/ml以下；好轉(zhuǎn)：原發(fā)灶縮小，轉(zhuǎn)移灶大小和數(shù)量也減少，Tg水平下降。RR-DTC診斷標準：根據(jù)2015年ATA指南，出現(xiàn)以下任何一項則可判斷為RR-DTC：①腫瘤組織或轉(zhuǎn)移灶不攝碘；②曾經(jīng)攝碘的病灶在碘治療后喪失攝碘能力；③碘治療后僅部分病灶攝碘；④雖然病灶可攝碘，但是碘治療后仍然出現(xiàn)疾病進展。

1.3.2 熒光定量實時PCR(Quantitative real-time-PCR，qRT-PCR) 提取總RNA：①取腫瘤組織樣本約100 mg，置于EP管中；②加入1 ml預(yù)冷的Trizol，充分混合均勻，靜置5～10 min；③加入200 μl 氯仿，震蕩30 s，靜置5～10 min；④12 000 r/min離心，取上清；⑤加入500 μl異丙醇，震蕩30 s，靜置5～10 min；⑥12 000 r/min離心，棄上清；⑦加入1 ml 75%乙醇，震蕩30 s，12 000 r/min離心，棄上清；⑧將EP管倒置于濾紙上，將RNA充分干燥；⑨加入20 μl DEPC水溶解沉淀，分裝，置于-80 ℃ 保存?zhèn)溆?。采用miRNA isolation kit試劑盒提取miRNA。采用凝膠電泳檢測RNA分子量；采用分光光度計檢測RNA濃度。

RNA反轉(zhuǎn)錄：根據(jù)試劑盒說明書操作進行。將cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實時定量PCR：將20 μl反應(yīng)體系置于37 ℃恒溫水浴60 min，85 ℃ 5 s，加入去離子水至100 μl，各反應(yīng)孔取2 μl進行PCR。冰浴中配制20 μl PCR反應(yīng)體系，95 ℃ 30 s預(yù)變性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)45次。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫獲得的資料設(shè)計引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成并提供。采用mirVanaTM qRT-PCR miRNA detection kit試劑盒進行定量測定。引物序列如下：miR-130b F：5′-TACCACGATAAGCAGGAAGTGA-3′，R：5′-CTCCTCTCCTGGCTTTTCTACC-3′。

結(jié)果判定：根據(jù)使用說明調(diào)整基線，將閾值設(shè)定在熒光值對數(shù)圖的線性部分，從軟件中讀取Ct值。ΔCt=樣品Ct均值-內(nèi)參Ct均值，ΔΔCt=ΔCt-(隨機陰性對照樣品Ct均值-內(nèi)參Ct均值)，以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA相對表達量。小干擾RNA引物由上海生工生物工程有限公司合成并提供；DNeasy組織試劑盒、cDNA合成試劑盒、熒光定量PCR試劑盒、miRNA isolation kit試劑盒購自德國Qiagen公司。

1.3.3 血清學(xué)檢測 所有患者131I照射治療前后分別采集血液樣本，采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測Tg水平，計算Tg同比下降率。Tg同比下降率=(Tgbaseline-Tg)/ Tgbaseline。

1.3.4131I全身顯像半定量分析 利用SPECT Region-of-interest軟件對所有患者131I照射治療后進行131I攝取半定量分析。轉(zhuǎn)移灶131I攝取(Tumor/Backgroud，T/B)=腫瘤病灶攝取量/本底攝取量(以正面額骨的攝取量為準)，比值越大，說明131I攝取越好。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者基線資料分析 影像學(xué)檢查結(jié)果顯示，接受131I照射治療后，41例患者為RR-DTC，63例患者為R-DTC。兩組患者年齡、性別、病理類型、累積I放射量等一般臨床資料基本一致，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。但是RR-DTC組患者發(fā)生遠處多發(fā)轉(zhuǎn)移的比例高于R-DTC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2 兩組患者組織miR-130b、血清學(xué)指標、影像學(xué)指標比較 見表2、圖1。131I照射治療前，R-DTC組和RR-DTC 組患者腫瘤組織miR-130b水平分別為0.79±0.10和0.43±0.07，RR-DTC組患者miR-130b水平明顯低于R-DTC組患者，而血清Tg水平高于R-DTC組患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。治療后，R-DTC組患者血清Tg水平為(25.94±17.48)μg/L，較治療前明顯降低，同時也低于RR-DTC組患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。RR-DTC組患者Tg同比下降率和T/B分別為10.13%±9.87%和4.29%±1.64%，明顯低于R-DTC組患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 兩組患者基本資料比較(例)

表2 兩組患者組織miR-130b表達、Tg及T/B水平比較

2.3 miR-130b與Tg同比下降率、T/B的相關(guān)性 經(jīng)Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，組織miR-130b與血清Tg同比下降率和T/B呈正相關(guān)性(rs=0.928、0.896，P<0.05)。見圖2。

圖1 qRT-PCR法檢測miR-130b在R-DTC、RR-DTC患者腫瘤組織中的表達水平

2.4 miR-130b診斷ROC曲線分析 ROC曲線分析結(jié)果顯示，miR-130b診斷RR-DTC的截斷值為0.485，曲線下面積(Area under curve，AUC)為0.662。根據(jù)miR-130b的截斷值，將41例RR-DTC患者分為<0.485亞組(23例)和≥0.485亞組(18例)。見圖3。

圖2 miR-130b與Tg同比下降率、T/B的相關(guān)性分析

2.5 RR-DTC生存曲線分析 隨訪截至2018年6月，中位隨訪時間為28.5個月。RR-DTC組有24例患者死亡，其中<0.485亞組有15例患者死亡，3年生存率為34.78%；≥0.485亞組有9例患者死亡，3年生存率為50.0%。采用Kanlan-Meier法對RR-DTC亞組患者進行生存分析，經(jīng)Log-rank檢驗，<0.485亞組和≥0.485亞組患者3年生存率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

圖3 miR-130b診斷RR-DTC的ROC曲線分析

圖4 Kanlan-Meier生存曲線分析

3 討論

甲狀腺癌是常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤之一，多為分化型甲狀腺癌，包括PTC和FTC兩種病理類型[7]。相對于未分化性甲狀腺癌或甲狀腺髓樣癌，DTC的總體預(yù)后良好，10年生存率可達85%以上[8-9]。目前，臨床上關(guān)于DTC治療的標準方案為甲狀腺切除術(shù)+131I內(nèi)照射+激素替代治療[10]。但是有部分患者對131I內(nèi)照射無效，或者初始治療有效，經(jīng)治療一段時間后無效，對于這部分患者治療方法的研究一直是內(nèi)分泌腫瘤領(lǐng)域亟待攻克的難點。由于RR-DTC患者多伴有多發(fā)性轉(zhuǎn)移灶，不宜采取手術(shù)治療，且攝碘能力較弱或完全喪失，同時這類腫瘤細胞的侵襲性明顯升高，給治療和預(yù)后帶來了極大挑戰(zhàn)[11]。推測其可能的原因包括：①部分腫瘤細胞本身缺乏攝碘能力或者攝碘能力較弱；②在進行131I內(nèi)照射前，腫瘤細胞攝碘能力存在較大的差異性，經(jīng)內(nèi)照射后，攝碘能力強的細胞被殺死，而剩余攝碘能力較弱的腫瘤細胞繼續(xù)增殖、侵襲等；③經(jīng)內(nèi)照射后，部分腫瘤細胞代謝活性可能發(fā)生變化，從而失去碘攝取能力[12]。一旦患者被確診為DTC，則無法繼續(xù)接受131I內(nèi)照射靶向治療，需考慮其他治療方案，包括放療、射頻消融、動脈栓塞和靶向治療等[13]。近年來，隨著對甲狀腺癌發(fā)病機制研究的深入，越來越多的分子靶向藥物用于臨床，為RR-DTC患者帶來了希望。

Tg是甲狀腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的特異性標志物，主要由甲狀腺濾泡上皮細胞合成并分泌，在正常生理情況下，或者經(jīng)甲狀腺手術(shù)全切除和“清甲”治療后，血液中Tg的含量極微；若出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，則血清中Tg含量明顯升高[14-15]。因此，臨床上一般通過檢測Tg水平預(yù)測手術(shù)后或“清甲”術(shù)后患者疾病進展。但是對于RR-DTC患者，由于“清甲”治療無效，甲狀腺病灶組織一直存在，因此，很多研究認為，血清Tg水平可作為131I治療成功的預(yù)測指標。但是，由于血清Tg受外界因素和內(nèi)在因素的影響，尤其是受甲狀腺球蛋白抗體(Thyroglobulin antibody，TgAb)的影響較大，且評估作用尚不明確，在2015年更新的ATA指南中，并沒有明確推薦血清Tg用于指導(dǎo)臨床治療[6]。131I全身顯像一直是臨床上用于探查不攝碘病灶最有效的手段，但是131I全身顯像也會出現(xiàn)假陰性結(jié)果，這可能由于部分腫瘤細胞去分化，Na/I轉(zhuǎn)運能力失衡，從而影響131I的攝取[16]。因此，尋找RR-DTC更為敏感的分子標志物，對于個體化治療具有重要的臨床價值。

miRNA屬于非編碼基因序列，與真核生物體多數(shù)基因的表達調(diào)控均密切相關(guān)，包括癌基因和抑癌基因等。近年來，多項研究結(jié)果顯示，miRNA與分化型甲狀腺癌細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，并可作為潛在的分子診斷工具及預(yù)后評估指標[17]。目前，國內(nèi)外臨床研究基本都是將miRNAs作為良、惡性甲狀腺病變的診斷指標，包括miR-146b、miR-222等[18]，但是關(guān)于miRNAs與碘攝取相關(guān)性的研究尚少。最近有研究顯示，一些miRNAs可能與131I攝取率有關(guān)，例如，Lakshmanan等[19]認為，miR-339-5p過表達可以抑制HEK293細胞131I攝取量，從而抑制NIS的表達。筆者在前期研究中，通過基因芯片技術(shù)篩選了碘難治性分化型甲狀腺癌與碘治療有效的DTC患者miRNAs表達的差異性，其中miR-130b、miR-486-5p、miR-7表達均明顯下調(diào)，尤其是miR-130b下調(diào)最為明顯，兩組DTC患者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[P<0.05，log2(fold-change)=-1.253]。因此，筆者基于前期研究結(jié)果，通過qRT-PCRT技術(shù)分析腫瘤組織中miR-130b表達水平與RR-DTC發(fā)生的相關(guān)性。結(jié)果顯示，RR-DTC患者miR-130b水平明顯低于碘治療有效組患者，但Kanlan-Meier生存曲線分析顯示，miR-130b表達水平與RR-DTC患者3年生存期之間未見明顯相關(guān)性，可能與本身DTC在我國的發(fā)病率較低，從而影響研究納入的患者樣本量有關(guān)。

綜上所述，碘難治性分化型甲狀腺癌患者腫瘤組織中miR-130b表達水平明顯低于碘治療有效的分化型甲狀腺癌患者，雖然本項研究未得出關(guān)于miR-130b與碘難治性分化型甲狀腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性，但是miR-130b仍然有望成為診斷分化型甲狀腺癌攝碘能力的輔助指標之一，從而為探索碘難治性分化型甲狀腺癌的篩查和診斷提供了新的思路。