ERK/CT-1通路對(duì)氧化應(yīng)激致H9C2細(xì)胞凋亡的影響

杜娜，戴紅良，賈桂枝

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心血管內(nèi)科二病區(qū)，遼寧 錦州 121001；2.錦州醫(yī)科大學(xué) 護(hù)理學(xué)院，遼寧 錦州 121001；3.錦州醫(yī)科大學(xué) 生理學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001）

心肌營(yíng)養(yǎng)因子-1（cardiotrophin-1,CT-1）屬白細(xì)胞介素6 家族成員，最初從小鼠心臟胚胎干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，在體外具有促進(jìn)心肌細(xì)胞肥厚的生物活性[1]。研究顯示心肌細(xì)胞在缺氧條件可誘導(dǎo)CT-1的過表達(dá)[2]。但目前對(duì)于CT-1 的功能及其表達(dá)上調(diào)的病理生理機(jī)制尚不明確。鑒于氧化應(yīng)激在各種心血管疾病中所起的重要作用，本研究擬探討在氧化應(yīng)激情況下心肌細(xì)胞CT-1 的表達(dá)情況及其對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響，以及氧化應(yīng)激誘導(dǎo)CT-1 表達(dá)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

H9C2 心肌細(xì)胞（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫），胰蛋白酶、DMEM 培養(yǎng)基、過氧化氫、PD98059（美國Sigma 公司），胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）（美國 Gibco 公司），CT-1 抗體（美國Abcam 公司），Cleaved-Caspase-3、ERK、pERK 抗 體（美 國Cell Signaling 公 司），Annexin V-PI 凋亡試劑盒（北京寶賽生物有 限公司），CT-1 siRNA 干擾序列5'-CCAAUUGCUGGAGG AAUAUTT-3'（蘇州吉瑪基因股份有限公司）。二氧化碳培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司），倒置熒光顯微鏡（德國LEICA），流式細(xì)胞儀（美國BD公司），電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad 公司）。

1.2 檢測(cè)方法與指標(biāo)

1.2.1 Western blotting 檢測(cè) 根據(jù)研究目的，將細(xì)胞分為不同組別：為檢測(cè)過氧化氫對(duì)H9C2 細(xì)胞CT-1表達(dá)及ERK 活化的影響，將細(xì)胞分為對(duì)照組及不同濃度（50、100、200 μmol/L）過氧化氫組；為檢測(cè)抗氧化劑對(duì)H9C2 細(xì)胞CT-1 表達(dá)及Caspase-3 活化的影響，將細(xì)胞分為對(duì)照組、200 μmol/L 過氧化氫組、N- 乙酰半胱氨酸組、N-乙酰半胱氨酸+過氧化氫組；為檢測(cè)CT-1 對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)Caspase-3 活化的影響，將細(xì)胞分為對(duì)照組、200 μmol/L 過氧化氫組、CT-1 siRNA+過氧化氫組；為檢測(cè)ERK 活化對(duì)CT-1 表達(dá)的影響，將細(xì)胞分為對(duì)照組、200 μmol/L 過氧化氫組、PD98059 組、PD98059+過氧化氫組。用細(xì)胞裂解液收集刺激完成細(xì)胞的總蛋白，離心收集上清后測(cè)定蛋白濃度，總蛋白行10%～12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。待電泳完成后電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。用1% BSA 封閉1 h，接著加入待檢測(cè)蛋白的一抗4℃孵育過夜。TBST 充分洗膜后，以辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h。TBST 洗膜后，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（enhanced chemiluminescence,ECL）顯色，以GAPDH 做為內(nèi)參。

1.2.2 RNA 干擾 H9C2 細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前一天以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。預(yù)先將小干擾RNA（siRNA）與Opti-MEMI 按1 ∶16 混合；陽離子脂質(zhì)體與Opti-MEMI 按照4 ∶11 混合。最后將上述2 個(gè)混合體系合并后與4 倍量的DMEM 一起加入到細(xì)胞中，在二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)8 h。最后，調(diào)整培養(yǎng)體系血清濃度為10%后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，用于后續(xù)研究。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡細(xì)胞 為檢測(cè)活性氧類（reactive oxygen species,ROS）及CT-1 對(duì) 過 氧 化氫誘導(dǎo)H9C2 細(xì)胞凋亡的影響，將細(xì)胞分為對(duì)照組、200 μmol/L 過氧化氫組、N-乙酰半胱氨酸+過氧化氫組及CT-1 siRNA+過氧化氫組。過氧化氫刺激24 h 后，各組細(xì)胞用0.25%胰酶消化2 ～3 min 后，以1 000 r/min 離心5 min 收集細(xì)胞，用預(yù)冷PBS 洗2 次，加入Annexin V-FITC 和碘化丙啶各5 μl，避光室溫反應(yīng)15 min，于1 h 內(nèi)利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 過氧化氫對(duì)H9C2 細(xì)胞CT-1 表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，不同濃度過氧化氫刺激H9C2 細(xì)胞24 h 后，Western blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示CT-1 的表達(dá)隨著過氧化氫濃度的增加而增加（見表1和圖1），說明氧化應(yīng)激刺激可增加H9C2 細(xì)胞CT-1 的表達(dá)。

表1 各組H9C2 細(xì)胞CT-1 表達(dá)水平比較 （±s）

表1 各組H9C2 細(xì)胞CT-1 表達(dá)水平比較 （±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P ＜0.05；2）與50 μmol/L 過氧化氫組比較，P ＜0.05；3）與100 μmol/L 過氧化氫組比較，P ＜0.05

組別 CT-1 相對(duì)表達(dá)水平對(duì)照組 1.000±0.000 50 μmol/L 過氧化氫組 1.230±0.087 100 μmol/L 過氧化氫組 1.603±0.1811）2）200 μmol/L 過氧化氫組 2.104±0.2261）2）3）F 值 30.655 P 值 0.000

圖1 各組H9C2 細(xì)胞CT-1 的表達(dá)

2.2 N-乙酰半胱氨酸對(duì)H9C2 細(xì)胞CT-1 表達(dá)的影響

經(jīng)200 μmol/L 過氧化氫刺激后，H9C2 細(xì)胞CT-1的表達(dá)明顯增強(qiáng)，而抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸預(yù)處理可顯著抑制過氧化氫誘導(dǎo)的CT-1 的表達(dá)（見表2和圖2），表明過氧化氫誘導(dǎo)CT-1 的過表達(dá)是通過ROS 介導(dǎo)的。

表2 各組N-乙酰半胱氨酸對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的 CT-1 表達(dá)影響 （n =3，±s）

表2 各組N-乙酰半胱氨酸對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的 CT-1 表達(dá)影響 （n =3，±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P ＜0.05；2）與200 μmol/L 過氧化氫組比較，P ＜0.05

組別 CT-1 相對(duì)表達(dá)水平對(duì)照組 1.000±0.000 200 μmol/L 過氧化氫組 2.155±0.2531）N-乙酰半胱氨酸組 1.033±0.125 N-乙酰半胱氨酸+過氧化氫組 1.117±0.1822）F 值 32.656 P 值 0.000

圖2 N-乙酰半胱氨酸抑制過氧化氫誘導(dǎo)CT-1 的表達(dá)

2.3 N-乙酰半胱氨酸及CT-1 干擾對(duì)H9C2 細(xì)胞凋亡的影響

經(jīng)200 μmol/L 過氧化氫刺激后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示H9C2 細(xì)胞的凋亡明顯增加，而N-乙酰半胱氨酸預(yù)處理則明顯抑制過氧化氫引起的細(xì)胞凋亡；相反，CT-1 敲低后H9C2 細(xì)胞的凋亡更加嚴(yán)重。見表3和圖3。

表3 N-乙酰半胱氨酸及CT-1 siRNA 對(duì)過氧化氫誘導(dǎo) H9C2 細(xì)胞凋亡的影響 （±s）

表3 N-乙酰半胱氨酸及CT-1 siRNA 對(duì)過氧化氫誘導(dǎo) H9C2 細(xì)胞凋亡的影響 （±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P ＜0.05；2）與200 μmol/L 過氧化氫組 比較，P ＜0.05

組別 凋亡率/%對(duì)照組 5.841±1.145 200 μmol/L 過氧化氫組 22.174±3.1721）N-乙酰半胱氨酸+過氧化氫組 10.351±1.3392）CT-1 siRNA+過氧化氫組 27.297±2.1442）F 值 67.600 P 值 0.000

圖3 N-乙酰半胱氨酸及CT-1 siRNA 對(duì)過氧化氫 誘導(dǎo)H9C2 細(xì)胞凋亡的影響

2.4 N-乙酰半胱氨酸對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)Caspase-3活化的影響

Active Caspase-3 的表達(dá)表明過氧化氫可通過對(duì)CT-1 的過表達(dá)負(fù)反饋性地抑制H9C2 細(xì)胞的凋亡。見表4、圖4和表5、圖5。

2.5 PD98059 對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的CT-1 表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，過氧化氫可濃度依賴性地促進(jìn)H9C2 細(xì)胞ERK 的活化（見表6和圖6），而絲裂原活化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（MEK/ERK）特異性抑制劑PD98059 可顯著抑制過氧化氫誘導(dǎo)的CT-1 表達(dá)上調(diào)（見表7和圖7）。

表4 N-乙酰半胱氨酸對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)Caspase-3 活化的影響 （±s）

表4 N-乙酰半胱氨酸對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)Caspase-3 活化的影響 （±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P ＜0.05；2）與200 μmol/L 過氧化氫組 比較，P ＜0.05

組別 Active Caspase-3 相對(duì)表達(dá)水平對(duì)照組 1.000±0.000 200 μmol/L 過氧化氫組 2.154±0.1941）N-乙酰半胱氨酸組 0.964±0.148 N-乙酰半胱氨酸+過氧化氫組 0.952±0.2082）F 值 40.721 P 值 0.000

圖4 N-乙酰半胱氨酸對(duì)過氧化氫誘導(dǎo) Caspase-3 活化的影響

表5 CT-1 siRNA 對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)Caspase-3 活化的影響 （±s）

表5 CT-1 siRNA 對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)Caspase-3 活化的影響 （±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P ＜0.05；2）與200 μmol/L 過氧化氫組比較，P ＜0.05

組別 Active Caspase-3 相對(duì)表達(dá)水平對(duì)照組 1.000 ± 0.000 200 μmol/L 過氧化氫組 1.846 ± 0.1571）CT-1 siRNA+過氧化氫組 2.591 ± 0.2432）F 值 68.059 P 值 0.000

圖5 CT-1 siRNA 對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)Caspase-3 活化的影響

3 討論

成年心肌細(xì)胞屬終端分化細(xì)胞，不具有再生增殖的能力。因此，心肌細(xì)胞的存活在維持心臟的功能和發(fā)育中起著極為關(guān)鍵的作用。當(dāng)遇到各種傷害性刺激時(shí)，心肌細(xì)胞會(huì)通過自分泌或旁分泌等形式釋放細(xì)胞保護(hù)因子，作為負(fù)反饋機(jī)制對(duì)抗各種損傷。

表6 過氧化氫對(duì)ERK 活化的影響 （±s）

表6 過氧化氫對(duì)ERK 活化的影響 （±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P ＜0.05；2）與50 μmol/L 過氧化氫組 比較，P ＜0.05

組別 pERK/ERK 相對(duì)水平對(duì)照組 1.000±0.000過氧化氫 50 μmol/L 組 1.646±0.2141）過氧化氫 100 μmol/L 組 1.982±0.2291）2）過氧化氫 200 μmol/L 組 1.818±0.1361）F 值 19.001 P 值 0.001

圖6 過氧化氫對(duì)ERK 活化的影響

表7 PD98059 對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)CT-1 表達(dá)的影響 （±s）

表7 PD98059 對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)CT-1 表達(dá)的影響 （±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P ＜0.05；2）與200 μmol/L 過氧化氫組比較，P ＜0.05

組別 CT-1 相對(duì)表達(dá)水平對(duì)照組 1.000±0.000 200 μmol/L 過氧化氫組 2.042±0.1771）PD98059 組 1.067±0.125 PD98059+過氧化氫組 1.205±0.1652）F 值 37.923 P 值 0.000

圖7 PD98059 對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)CT-1 表達(dá)的影響

CT-1 在血清剝奪[3]、熱休克[4]、缺血再灌注損傷等[5]損傷中呈現(xiàn)心肌保護(hù)的特性。體外研究顯示[5]，在低氧狀態(tài)下，心肌細(xì)胞CT-1 表達(dá)增加；體內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)在不穩(wěn)定性心絞痛[6]、急性心肌梗死[7]、高血壓性心臟病等[8]病理狀態(tài)下，外周循環(huán)中的CT-1 水平是增加的。但對(duì)于CT-1 在上述病理?xiàng)l件下如何升高，及其在疾病過程中發(fā)揮何種作用，目前尚不完全明確。

在缺血缺氧狀態(tài)下，心肌組織會(huì)產(chǎn)生過量的ROS。這些ROS 攻擊細(xì)胞的脂質(zhì)、DNA 及蛋白質(zhì)等生物大分子，并誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡[9-10]。本研究也發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸可顯著抑制過氧化氫誘導(dǎo)的H9C2 心肌細(xì)胞活化Caspase-3 的表達(dá)及凋亡。既然缺血缺氧可以誘導(dǎo)CT-1 的過表達(dá)，就有理由推測(cè)ROS 增加有可能是誘導(dǎo)CT-1 過表達(dá)的的重要機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，過氧化氫可劑量依賴性地誘導(dǎo)CT-1 的過表達(dá)。而且，利用特異性siRNA 敲低CT-1 后，無論是活化Caspase-3 的表達(dá)還是細(xì)胞的凋亡率均較過氧化氫組顯著增加，表明上述病理狀態(tài)下由ROS 激發(fā)的CT-1 過表達(dá)起到一種負(fù)反饋性保護(hù)機(jī)制，起到對(duì)抗氧化性損傷本身所帶來的細(xì)胞損傷的作用。這與DONG 等[11]報(bào)道的CT-1 處理能促進(jìn)心肌細(xì)胞活力的結(jié)論相一致。

本研究進(jìn)一步對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)CT-1 表達(dá)的機(jī)制進(jìn)行初步探討。有研究顯示，過氧化氫預(yù)處理能通過激活ERK 保護(hù)心肌細(xì)胞對(duì)抗氧化應(yīng)激引起的損傷和凋亡[12]。筆者推測(cè)過氧化氫誘導(dǎo)的CT-1 過表達(dá)有可能與ERK 的活化有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，MEK/ERK 特異性抑制劑PD98059 能顯著抑制過氧化氫誘導(dǎo)的CT-1過表達(dá)。由此可見，ERK 不光可以作為下游分子介導(dǎo)CT-1 的各種生物學(xué)活性[13]，本研究也是首次發(fā)現(xiàn)ERK 可以作為上游分子介導(dǎo)CT-1 的過表達(dá)。對(duì)ERK如何能促進(jìn)CT-1 的表達(dá)有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究證實(shí)氧化應(yīng)激在誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡性損傷的同時(shí)，可通過激活ERK 反饋性地誘導(dǎo)CT-1 的過表達(dá)，從而限制由氧化應(yīng)激本身帶來的心肌細(xì)胞損害。本研究不僅有助于進(jìn)一步理解心血管疾病的病理生理機(jī)制，也可為疾病的防治提供新的線索。