ELK-1/JNK/c-Fos對(duì)左歸降糖解郁方(ZGJTJYF)體外培養(yǎng)的模擬糖尿病并發(fā)抑郁癥(DD)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡中的作用*

柳 卓， 劉 檢， 凌 佳， 楊 琴， 楊 蕙， 孟 盼， 杜 青， 趙洪慶， 王宇紅，△

(1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)， 湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地， 長(zhǎng)沙 410208； 2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 長(zhǎng)沙 410007； 3. 湖南省中醫(yī)藥研究院， 長(zhǎng)沙 412000)

糖尿病是代謝性疾病，其最基本特征為高血糖。有研究表明，大約三分之一的糖尿病患者存在抑郁反應(yīng)[1, 2]。糖尿病并發(fā)抑郁癥(diabetes mellitus with depression，DD)的復(fù)發(fā)和死亡率均顯著高于單純的糖尿病患者[3]。故全面研究DD的發(fā)病機(jī)制及在機(jī)制基礎(chǔ)上防治具有重要意義。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)可以介導(dǎo)凋亡的絲氨酸蛋白激酶，轉(zhuǎn)錄激活因子ETS樣蛋白1(ETS-like 1 transcription factor,ELK-1)可被其激活從而影響c-Fos的表達(dá)，導(dǎo)致凋亡的發(fā)生[4, 5]。左歸降糖解郁方有化瘀解郁，滋陰益氣的功效。本課題組前期研究證實(shí)，DD大鼠的海馬存在神經(jīng)元病理?yè)p傷[6-8]。神經(jīng)元損傷主要是由神經(jīng)元凋亡導(dǎo)致，而凋亡的主要機(jī)制體外模型尚未研究。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)擬從體外角度檢測(cè)ZJJF對(duì)海馬 JNK、ELK-1、c-Fos蛋白和基因表達(dá)的影響，更深一步探討左歸降糖解郁方對(duì)海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 試劑

L-多聚賴(lài)氨酸、皮質(zhì)酮、多聚甲醛、DMSO，胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶(美國(guó) Amresco)，D-葡萄糖、DMEM/F12、Neurobassal神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基、B27 添加劑、胎牛血清(美國(guó) Hyclone)、Glutamax(美國(guó)Gibco)，兔抗烯醇化酶多克隆抗體(NSE，中國(guó) Bioworld)，Hoechst 33258(中國(guó) Beyotime)，兔抗鼠 p-JNK( Thr183) 、Elk-1、c-fos 多克隆抗體( Abcam 公司)，

1.2 儀器

三氣細(xì)胞培養(yǎng)箱(NEW BRUNSWICK GALAXY，CO48R-230 型)，高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)(PerkinElmer，OPERETTA 型)，體視顯微鏡(LEICA，S8PAO 型)，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀( Roche 公司，Lightcycler 480Ⅱ)。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠(400～460 g雌性3只和180～220 g雄性9只)，其中雌性受孕18 d，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(動(dòng)物許可證號(hào) SCXK(湘)2013-0004)提供。

1.4 藥物

左歸降糖解郁方(菟絲子、牛膝、熟地黃、丹參、山萸肉、姜黃、牡丹皮、黃芪、枸杞子、貫葉連翹、杜仲)，湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院購(gòu)買(mǎi)并由該院制劑科水煎濃縮制成口服液(每ml含生藥1.14 g)；鹽酸二甲雙胍片(湖南湘雅制藥有限公司)，鹽酸氟西汀(法國(guó) Patheon)。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

將SD雌鼠麻醉后，取出胎鼠大腦，將殘留的其它組織血液脫干凈，在顯微鏡下夾取海馬，剪碎后加入相同體積的Ⅰ型膠原酶和胰蛋白酶，充分消化后加入終止液，反復(fù)吹打細(xì)胞使其成懸浮液后收集上清液，重懸后加入接種液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為3.0×105cells·ml-1。接種于預(yù)先包被的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，用維持液(96%Neurobassal 神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基，1%Glutamax，2%B27 添加劑，1%雙抗)替代培養(yǎng)液。3 d后換1/2維持液。第5日，用4%多聚甲醛30 min固定， PBS洗后加入0.25%Triton X-100 溶液，15 min后用預(yù)冷PBS洗，用5%BSA封閉30 min，清洗后滴加兔抗大鼠神經(jīng)元特異烯醇化酶(neuron-specific enolase, NSE)和小鼠抗大鼠 β-tublin 相關(guān)抗體(1∶ 100)。4℃過(guò)夜后PBS洗，滴加R-PE標(biāo)記和FITC 標(biāo)記的二抗( 1∶ 200)，37℃孵育1 h，清洗后DAPI 染核20 min，清洗，每孔加50 μl PBS，用高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)拍照并分析。

1.6 含藥學(xué)清的制備

取 SD 雄鼠，隨機(jī)分成陽(yáng)性藥組，中藥藥物血清組，空白血清組,每組3只，每組灌予相應(yīng)藥物。其中中藥藥物血清組參照前期文獻(xiàn)給予臨床有效3倍量左歸降糖解郁方 ( 32.82 g·kg-1)，陽(yáng)性給藥量為二甲雙胍( 0.18 g·kg-1) +氟西汀( 1.8 mg·kg-1)，空白血清組給予相同量的蒸餾水，每天2次連續(xù) 3 d。末次給藥，1 h后無(wú)菌條件取腹主動(dòng)脈血，2 h后15 min離心(3 000 r·min-1)，收集上清液，30 min 56℃ 水浴，濾膜(0.22 μm)過(guò)濾，分裝，放置-80℃冰箱保存[9]。

1.7 分組、造模及給藥

原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，將培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞隨機(jī)分為5組,每組兩個(gè)復(fù)孔：空白血清組、正常組、左歸降糖解郁方含藥血清組、陽(yáng)性藥(二甲雙胍+氟西汀)含藥血清組和模型組。培養(yǎng)5～7 d的海馬神經(jīng)元，采用高糖(150 mmol/L)+皮質(zhì)酮(200 μmol/L)構(gòu)建DD體外細(xì)胞模型[10]。模型組和正常組給予等量培養(yǎng)液，空白血清組加入相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)10 %空白血清，中藥組和陽(yáng)性藥組分別加入相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)10 %的含藥血清，均干預(yù)18 h。

1.8 Hoechst熒光染色檢測(cè)海馬神經(jīng)元凋亡

海馬神經(jīng)元干預(yù)并固定后，每孔加100 μl 0.25%TritonX-100 ，作用15 min后，PBS清洗5 min×3次，滴加Hoechst 33258 避光作用20 min。PBS清洗5 min×3次。DAPI避光作用20 min，最終每孔加PBS觀察。

1.9 高內(nèi)涵分析技術(shù)檢測(cè)海馬神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白ELK-1、p-JNK、c-Fos 表達(dá)

神經(jīng)元經(jīng)干預(yù)并固定后，0.25 %Triton-100作用15 min，BSA 封閉30 min。滴加一抗p-JNK(1∶100)、ELK-1(1∶100)、c-Fos(1∶100)稀釋液作用1 h。滴加FITC標(biāo)記和R-pe 標(biāo)記二抗孵育30 min，20 min DAPI染色。最終每孔加PBS觀察，高內(nèi)涵分析儀檢測(cè)。

1.10 各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞ELK-1、p-JNK、c-Fos的mRNA表達(dá)比較

取出細(xì)胞，把細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管中， 1 000 r/min，離心5 min，小心倒掉上清，加入1 ml Trizol，吹打均勻至液體澄清且無(wú)細(xì)胞團(tuán)塊后，室溫靜止5 min，然后把所有液體轉(zhuǎn)移到1.5 ml EP管中。Trizol加入氯仿0.2 ml/1 ml，劇烈搖晃10 s后靜止2 min。離心，取上清加入等體積異丙醇，離心后吸出上層液；按比例加入乙醇，離心棄上清液。干燥5 min后加入10～25μl RNasinfree H2O得總RNA。反轉(zhuǎn)錄RNA 成cDNA，在50 μl cDNA 反應(yīng)液內(nèi)分別加入2 μl 引物，RT-PCR 反應(yīng)循環(huán)為95℃、30 s，95℃、5 s，持續(xù)40 個(gè)循環(huán)和60℃、30 s。RNA引物由深圳華大基因公司合成，分別有內(nèi)參引物β-actin引物(上5’-CATCCTGCGTCTGGACCTGG-3’;下5’-TAATGTCACGCACGATTTCC-3’，反應(yīng)條件：2 min 95℃變性；60℃退火20 s 45個(gè)循環(huán))。

c-fos引物(上5’-CAACACACAGGACTTTTGCG-3’;下5’-GAGATAGCTGCTCTACTTTGCCC-3’)；p-JNK引物(上5’-AGGAATAGTGTGTGCAGCTTATG-3’;下5’-CTTCTAGGGATTTCTGTGGTGTG-3’); ELK-1引物(上5’-TGCTCCACTGAAGACTGCC-3’;下5’-GAGCATGGATGGATGGACTC-3’);

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 左歸降糖解郁方對(duì)海馬神經(jīng)元凋亡的影響

空白血清組、正常組、模型組、中藥藥物血清組，陽(yáng)性藥藥物血清組，HCA結(jié)果隨機(jī)選取10個(gè)視野，凋亡細(xì)胞比例分別是：14.9%、13.1%、53.5%、 40.8%和34.9%。正常組細(xì)胞熒光均勻完整，其無(wú)明顯凋亡特征。模型組分散，細(xì)胞熒光不均勻，局部出現(xiàn)濃染表明出現(xiàn)大量凋亡；陽(yáng)性藥及中藥血清作用，模型組熒光分布更均勻完整(圖1)。

Fig.1The apoptotic morphology of hippocampal neurons in each group(Hoechst ×400)

C: Control group; Q: Blank serum group; M: Model group; Y: Positive drug group; Z: ZGJTJYF group

2.2 左歸降糖方對(duì)模型大鼠海馬神經(jīng)元ELK-1、p-JNK、c-Fos 蛋白表達(dá)的影響

經(jīng)過(guò)HCA檢測(cè)結(jié)果分析后顯示，細(xì)胞骨架呈橙黃色。綠色(FITC)為細(xì)胞目標(biāo)ELK-1、p-JNK、c-Fos，藍(lán)色(DAPI)為細(xì)胞核。與空白組比較，模型組海馬神經(jīng)元中ELK-1、JNK和c-Fos相對(duì)熒光強(qiáng)度明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，中藥血清組神經(jīng)元ELK-1、JNK和c-Fos相對(duì)熒光強(qiáng)度明顯降低(P<0.05)。中藥組和陽(yáng)性藥組神經(jīng)及樹(shù)突連接方面看到明顯改善。該結(jié)果表明左歸降糖解郁方可以逆轉(zhuǎn)DD環(huán)境下海馬神經(jīng)元中ELK-1、JNK、c-Fos信號(hào)的表達(dá)而起到抗凋亡的效果(表1, 圖2，3，4)。

GroupELK-1JNKc-FosC457.1±32.5427.1±30.11198.0±14.6Q451.9±21.6466.2±25.21205.0±15.8M704.1±30.2*662.3±26.7*1474.0±21.6*Y504.6±26.4#456.2±21.8#1280.0±15.8#Z505.2±24.5452.8±23.5#1260.0±20.3#

C: Control group； Q: Blank serum group； M: Model group； Y: Positive drug group; Z: ZGJTJYF group; ELK: ETS-like 1 transcription factor; JNK: C-Jun N-terminal kinase

*P<0.05,**P<0.01vscontrol；#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

2.3 各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞ELK-1、p-JNK、c-Fos基因表達(dá)結(jié)果

RT-PCR結(jié)果顯示，與空白組比較模型組海馬神經(jīng)元中ELK-1、JNK和c-Fos的mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，陽(yáng)性藥血清組和中藥血清組神經(jīng)元ELK-1、JNK和c-Fos的mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.01或P<0.05)。該結(jié)果表明左歸降糖解郁方可以逆轉(zhuǎn)DD環(huán)境下海馬神經(jīng)元中ELK-1、JNK、c-Fos的mRNA表達(dá)(表2)。

GroupELK-1JNKc-FosC1.00±0.021.00±0.021.00±0.02Q0.93±0.010.92±0.011.02±0.03M1.24±0.12**1.69±0.06**1.67±0.03**Y1.06±0.02##1.13±0.14#1.16±0.08#Z1.06±0.05##1.11±0.05##1.00±0.04##

C: Control group； Q: Blank serum group； M: Model group； Y: Positive drug group; Z: ZGJTJYF group

*P<0.05,**P<0.01vscontrol；#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

Fig.2Expression of ELK-1 protein in neurons of hippocampus in each group(×400)

Fig.3JNK protein expression in neurons of hippocampus in each group(×400)

Fig.4c-Fos protein expression in neurons of hippocampus in each group(×400)

3 討論

糖尿病很多因素導(dǎo)致的胰島素障礙的疾病。糖尿病也可以引發(fā)很多并發(fā)癥，其中極易并發(fā)抑郁癥[11]。糖尿病并發(fā)抑郁癥患者自殺率高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于抑郁癥患者[12, 13]。而海馬是DD發(fā)生的關(guān)鍵靶器官。DD的中醫(yī)病機(jī)可以總結(jié)為“虛、瘀、郁”，表現(xiàn)為氣陰兩虛、血瘀瘀阻等[14]。

左歸降糖解郁方源自于《景岳全書(shū)》左歸丸，在原方滋補(bǔ)腎陰的基礎(chǔ)上加以活血散瘀之丹參、丹皮，健脾益氣之黃芪，化瘀行氣、疏肝解郁之姜黃和貫葉連翹，使之能滋陰益氣，化瘀行氣解郁，符合DD中醫(yī)病機(jī)“虛、瘀、郁”的特點(diǎn)，明顯改善DD大鼠海馬損傷及糖代謝紊亂，并可緩解神經(jīng)元損傷[5]。本實(shí)驗(yàn)從體外的角度進(jìn)一步觀察到DD神經(jīng)元有明顯的凋亡，中藥組和陽(yáng)性藥組凋亡細(xì)胞明顯減少，由此表明左歸降糖解郁方有改善神經(jīng)元凋亡的作用。

ELK-1是一種轉(zhuǎn)錄激活因子,影響細(xì)胞增殖、凋亡、分化,并能通過(guò)調(diào)節(jié)其靶基因c-Fos的表達(dá),誘導(dǎo)神經(jīng)元的凋亡，屬于JNK的核內(nèi)底物[15]。JNK激活在疾病狀態(tài)下對(duì)神經(jīng)元凋亡發(fā)揮重要作用。目前認(rèn)為其機(jī)制主要是調(diào)節(jié)下游凋亡相關(guān)靶基因和凋亡蛋白的表達(dá)，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。已有研究證明JNK信號(hào)能在糖尿病并發(fā)抑郁癥引起的海馬損傷中表達(dá)異常，其可能與其能控制凋亡的相關(guān)蛋白有關(guān)[16]。c-Fos是神經(jīng)功能活動(dòng)的代謝性標(biāo)志物，在神經(jīng)細(xì)胞收到信號(hào)后, 增加c-Fos的表達(dá),造成凋亡的發(fā)生[17, 18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白組比較，模型組海馬神經(jīng)元中ELK-1、JNK和c-Fos相對(duì)熒光強(qiáng)度明顯升高；與模型組比較，中藥血清組神經(jīng)元ELK-1、JNK和c-Fos相對(duì)熒光強(qiáng)度明顯降低。中藥組和陽(yáng)性藥組樹(shù)突連接及神經(jīng)形態(tài)情況得到明顯改善。該結(jié)果表明左歸降糖解郁方可以調(diào)節(jié)DD環(huán)境下海馬神經(jīng)元中ELK-1、JNK、c-Fos信號(hào)的表達(dá)而起到抗凋亡的效果。在基因表達(dá)上，中藥血清組和陽(yáng)性藥血清組神經(jīng)元ELK-1、JNK和c-Fos基因表達(dá)明顯降低。該結(jié)果表明左歸降糖解郁方可以逆轉(zhuǎn)DD環(huán)境下海馬神經(jīng)元中ELK-1、JNK、c-Fos基因的表達(dá)。

綜上可知，左歸降糖解郁方可改善糖尿病并發(fā)抑郁的體外模型的神經(jīng)元凋亡作用并可以抑制JNK通路。本研究表明左歸降糖解郁方對(duì)神經(jīng)元相關(guān)凋亡蛋白有調(diào)節(jié)作用，為中藥復(fù)方治療糖尿病并發(fā)抑郁癥提供有力依據(jù)。但有待更深入的研究其他的分子機(jī)制。