賀瑩瑩, 王文榮
(1. 北京體育大學(xué)中國運(yùn)動(dòng)與健康研究院, 北京 100084, 2. 山東師范大學(xué), 濟(jì)南 250014)
血脂異常是指血漿中脂質(zhì)成分升高或降低,產(chǎn)生異常后引發(fā)的一系列并發(fā)癥,血中總膽固醇(total cholesterol,TC)和甘油三酯(triglyceride,TG)水平過高,血中高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平過低是血脂異常的表現(xiàn)。流行病學(xué)的研究表明,血脂異常是心血管疾病的危險(xiǎn)因素,血脂異常增加冠心病和缺血性腦卒中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[1]。
載脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)是一種多態(tài)性蛋白,參與脂蛋白的轉(zhuǎn)化與代謝過程。ApoE的基因多態(tài)性是導(dǎo)致個(gè)體間血脂水平存在差異的遺傳因素。人類血漿有3種主要的異構(gòu)體E2、E3和E4,ε2、ε3、ε4是3種常見的等位基因,能夠編碼形成6種基因型:ε2/2、ε3/3、ε4/4、ε2/3、ε2/4、ε3/4,通常將ε2/2、ε3/2作為ApoE2組,將ε3/4、ε4/4作為ApoE4組,將ε2/4、ε3/3作為ApoE3組。一項(xiàng)薈萃分析顯示,與ε3/3基因型攜帶者相比,ε4基因型攜帶者患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)增加了42%,而ε2基因型攜帶者沒有顯示出與冠心病的相關(guān)性[2]。
運(yùn)動(dòng)防治血脂異常如果實(shí)施得當(dāng)既安全又無副作用,因此越來越受到相關(guān)領(lǐng)域?qū)<覍W(xué)者的關(guān)注。有氧耐力性運(yùn)動(dòng)被公認(rèn)為是防治血脂異常的有效手段,中低強(qiáng)度的有氧耐力性運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練有助于引起血脂的有益性改變[3],但高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練(high intensity interval training, HIIT)作為有氧訓(xùn)練的形式之一,對(duì)血脂的改善作用還需要進(jìn)一步研究。研究發(fā)現(xiàn),運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度是降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立相關(guān)因素,運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度與心血管健康之間具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系[4]。
因此,本研究以血脂異常人群為研究對(duì)象,對(duì)其實(shí)施12周的HIIT干預(yù),觀察ApoE基因多態(tài)性對(duì)運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)血脂異常的影響。
在北京市海淀區(qū)的居民小區(qū)中通過發(fā)放問卷,調(diào)查45歲以上居民的健康狀況和體力活動(dòng)情況。實(shí)驗(yàn)共初篩受試者268人,對(duì)通過初篩的居民進(jìn)行空腹血壓、血脂、血糖、心率和心電圖測(cè)試,根據(jù)2007年制定的《中國成人血脂異常防治指南》[5],篩選空腹TC>5.2 mmol/L,TG>1.7 mmol/L;無心臟病和骨、關(guān)節(jié)疾?。粺o其他代謝性疾??;至少近6個(gè)月內(nèi)無服用過降血脂藥物和其他影響脂代謝的藥物;無規(guī)律運(yùn)動(dòng)習(xí)慣;低體力活動(dòng)水平;自愿參加本實(shí)驗(yàn),并簽訂實(shí)驗(yàn)知情同意書的147人作為研究對(duì)象。在運(yùn)動(dòng)干預(yù)過程中,研究對(duì)象因病退出3人,因外出無法持續(xù)完成干預(yù)而退出12人,因運(yùn)動(dòng)干預(yù)后膝關(guān)節(jié)不適退出6人,因其他原因不愿繼續(xù)參加實(shí)驗(yàn)退出38人,最后實(shí)際完成實(shí)驗(yàn)人數(shù)為88人,其中男性23人,女性65人。
要求受試者在取血前一天不進(jìn)行劇烈活動(dòng),晚餐清淡,無宵夜,空腹12 h后,于次日晨安靜狀態(tài)下采集靜脈血2 ml,3 000 r/min離心15 min,取血清,采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清總膽固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol, HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol, LDL-C)水平。
采用一次性口腔采樣棉簽采集受試者口腔粘膜,采用ARMS-PCR的方法進(jìn)行測(cè)定。
DNA提?。翰杉谇徽衬ぜ?xì)胞進(jìn)行DNA測(cè)定。用剪刀剪下蘸滿口腔黏膜的拭子,加入700 μl SDS裂解液和5 μl蛋白酶K,劇烈渦旋震蕩使樣品充分分散。56℃水浴2 h以上,期間混勻幾次;加入等體積的酚氯仿(1∶1)抽提,顛倒混勻,室溫下,12 000 g,離心5 min; 轉(zhuǎn)移上清至新的離心管中。加入等體積的氯仿抽提,室溫下,12 000 g,離心5 min;加等體積的異丙醇,2 μl糖原,-20℃沉降2 h以上;4℃,12 000 g,離心10 min;加入75%乙醇(冷凍保存)漂洗,12 000 g,離心2 min;重復(fù)上述步驟一次;將柱子轉(zhuǎn)移至新的1.5 ml離心管中,加入50~100 μl預(yù)熱到65℃ ddH2O至柱子的膜中央。室溫靜置3 min,10 000 g離心2 min;DNA于-20℃保存,取2 μl用Nas-99測(cè)定DNA濃度。
引物設(shè)計(jì)見表1。
Tab.1The primer sequences for apolipoprotein E genotype identification
Primer nameSequence(5' to 3')Length/(bp)RS429358-WGGCGCGGACATGGAGGACGTGT22RS429358-MGCTGGGCGCGGACATGGAGGACGTGC26RS7412-WGATGCCGATGACCTGCAGAAGC22RS7412-MCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGT26RS429358-RS7412-RCGGCCAGGGAGCCCACAGTGG21
PCR反應(yīng)體系及循環(huán)參數(shù):總體系17.2 μl,包括ddH2O 10 μl、2.5×buffer 4 μl、Taq酶0.2 μl、引物1 μl、模板2 μl。94℃預(yù)變性5 min, 94℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s, 共35 個(gè)循環(huán), 72℃延伸10 min,延伸循環(huán)完畢,取出PCR 管,置于4℃冰箱待測(cè)。
3730xl上機(jī)檢測(cè):96孔板中每孔加入分子量內(nèi)標(biāo)和甲酰胺混合液(0.5∶8.5)9 μl,PCR產(chǎn)物1.0 μl;95℃變性3 min,上機(jī)檢測(cè); 將檢測(cè)得到的原始數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入到GeneMapper 3.2軟件中進(jìn)行分析。Rs7412/rs429358位點(diǎn)分型為TT/TT,說明受試者基因型為E2/2型;Rs7412/rs429358位點(diǎn)分型為TT/CT,說明受試者基因型為E2/3型;Rs7412/rs429358位點(diǎn)分型為CT/CT,說明受試者基因型為E2/4型;Rs7412/rs429358位點(diǎn)分型為TT/CC,說明受試者基因型為E3/3型;Rs7412/rs429358位點(diǎn)分型為CT/CC,說明受試者基因型為E3/4型。
運(yùn)動(dòng)干預(yù)采用功率自行車運(yùn)動(dòng),受試者在適應(yīng)一周后開始正式干預(yù)實(shí)驗(yàn)。干預(yù)方案為受試者在功率自行車上完成60組起始負(fù)荷為0.5 kg,盡最大能力沖刺6 s,之后間歇9 s的短時(shí)間大強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng),其中間歇過程無負(fù)荷,空蹬功率自行車。受試者佩戴心率表,控制心率在80%~90%HRmax,最大心率以(220-年齡)作為參考,并通過詢問受試著的自感疲勞程度(rate of perceive effort, RPE介于16~19)作為運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和運(yùn)動(dòng)安全性的監(jiān)控指標(biāo)。當(dāng)受試者心率和RPE在當(dāng)前負(fù)荷中有所降低時(shí),需要增加 0.5 kg負(fù)荷,直至運(yùn)動(dòng)干預(yù)結(jié)束。干預(yù)過程中受試者通過提示音進(jìn)行運(yùn)動(dòng)。干預(yù)共進(jìn)行12周,每周3 d,每天1次。受試者在運(yùn)動(dòng)干預(yù)期間保持與干預(yù)前相同的飲食和體力活動(dòng)習(xí)慣。
88例血脂異常者中檢測(cè)出E2/2、E2/3、E2/4、E3/3和E3/4共5種基因型,未檢測(cè)到E4/4基因型,等位基因分別為ε2、ε3和ε4。表2顯示出,血脂異?;颊咧?,ApoE基因型的分布比例為ApoE3/3>ApoE3/4 >ApoE2/3>ApoE2/2>ApoE2/4,等位基因ε3>ε2=ε4。
Tab.2ApoE genotypes and allele frequency distribution in dyslipidemia(n=88)
NGenotype frequency(%)Allele frequency(%)88E2/2E2/3E2/4E3/3E3/4ε2ε3ε44(5)6(7)2(2)68(77)8(9)8(9.1)72(81.8)8(9.1)
將血脂異常者ApoE等位基因型分為3類,分別是ε2:E2/2+ E2/3、ε3:E3/3+ E2/4、ε4:E3/4,各等位基因型對(duì)應(yīng)的血脂水平見表3??梢钥闯?,HIIT干預(yù)前ε4等位基因組的TC水平顯著高于ε2和ε3等位基因組(P<0.01),ε4等位基因組的LDL-C顯著高于ε2等位基因組(P<0.05),其余指標(biāo)在各組間無顯著性差異(P>0.05)。
如表3所示,12周HIIT干預(yù)顯著降低ε3等位基因組的血清TC、TG、LDL-C水平(P<0.05),顯著升高HDL-C水平(P<0.05)。ε4等位基因組血清TC、LDL-C水平顯著下降(P<0.05),TG和HDL-C水平無顯著變化(P>0.05)??傮w樣本和ε2等位基因組的血清脂質(zhì)水平在運(yùn)動(dòng)干預(yù)后均出現(xiàn)有益性改變,但無顯著性(P>0.05)。ε3等位基因組的空腹血糖和收縮壓也出現(xiàn)顯著性下降(P<0.05)??傮w樣本的BMI和腰臀比在干預(yù)后出現(xiàn)顯著性下降(P<0.05)。
Tab. 3 Changes of indicators before and after 12 weeks HIIT among different ApoE n=88)
BW: Body weight; BMI: Body Mass Index; WHR: Waist-hip ratio; SBP: Systolic blood pressure; DBP: Diastolic blood pressure; HR: Heart rate; GLU: Fasting blood glucose; TC: Total cholesterol; TG: Triglyceride; LDL-C: Low density lipoprotein cholesterol; HDL-C: High-density lipoprotein cholesterol
*P<0.05,**P<0.01 beforevsafter intervention in each genotype group;#P<0.05,##P<0.01vsε2;△△P<0.01vsε3
ApoE基因全長3.7 kb,包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子,存在于第19號(hào)染色體長臂3區(qū)。ApoE2、ApoE3、ApoE4是ApoE的3種異構(gòu)體,通過對(duì)人的3種ApoE異構(gòu)體的氨基酸組成分析,發(fā)現(xiàn)第112位和第158位上氨基酸的不同是ApoE基因多態(tài)性的分析基礎(chǔ)。ApoE3在第112位和第158位這兩個(gè)位置上的氨基酸分別為半胱氨酸和精氨酸,而ApoE4在這兩個(gè)位置上的氨基酸均為精氨酸,ApoE2在這兩個(gè)位置上的氨基酸均為半胱氨酸。ApoE2、ApoE3和ApoE4這3種異構(gòu)體是同一基因位點(diǎn)上的ε2、ε3、ε4三種等位基因的表達(dá)產(chǎn)物,ε2、ε3、ε4三種等位基因編碼形成ApoE2/2、ApoE3/3、ApoE4/4三種純合子和ApoE2/3、ApoE2/4和ApoE3/4三種雜合子表型。本研究對(duì)血脂異常人群ApoE基因型與等位基因頻率的分析結(jié)果表明,血脂異常人群ApoE基因型以E3/3(為77%)占優(yōu)勢(shì),檢測(cè)到的5種基因型比例為ApoE3/3>ApoE3/4 >ApoE2/3 ApoE2/2>ApoE2/4,等位基因也以ε3(為81.8%)為主,其比例為ε3>ε2=ε4。黎旭等[6]對(duì)北京地區(qū)自然人群的研究發(fā)現(xiàn),ApoE存在6種基因表型,其中ApoE3/3占比最大,約為65.6%,其次為ApoE2/3和ApoE3/4,ApoE2/2和ApoE4/4最少。等位基因在人群中的分布頻率為ε2占9.1%,ε3占81.2%,ε4占9.7%,ApoE基因型及等位基因無明顯的性別差異,對(duì)世界各地人群ApoE基因表型和基因頻率的研究發(fā)現(xiàn)了相同的結(jié)果。以上結(jié)果說明,ApoE基因型和等位基因的頻率分布在血脂異常人群和正常人群中相似。
時(shí)寶慶等[7]研究發(fā)現(xiàn)血脂水平受ApoE基因多態(tài)性影響,ApoE基因多態(tài)性是造成個(gè)體間血脂水平差異的獨(dú)立遺傳因素,并且ε4等位基因具有升高TC和LDL-C水平的作用。本研究顯示ε4等位基因攜帶者的血清TC顯著高于ε2和ε3等位基因攜帶者,ε4等位基因攜帶者的血清LDL-C水平顯著高于ε2等位基因攜帶者,TG和HDL-C水平在各基因型之間沒有顯著性差異,提示ApoE基因型多態(tài)性與血脂異常的發(fā)生存在一定的關(guān)聯(lián),ε4等位基因攜帶者存在血脂異常的基因易感性。在健康人群中,ApoE各個(gè)基因型血漿TC水平由低到高依次為E2/2 規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)血脂有積極的調(diào)節(jié)作用[13],但個(gè)體對(duì)運(yùn)動(dòng)的應(yīng)答存在差異,考慮可能是特異的基因型調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)對(duì)脂質(zhì)的干預(yù)作用。2008年美國體力活動(dòng)指南指出,較大運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度僅需中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)一半的時(shí)間,就能獲得同樣的健康益處[14],而運(yùn)動(dòng)時(shí)間是影響運(yùn)動(dòng)參與性和持續(xù)性的重要因素,因此,本研究采用HIIT的運(yùn)動(dòng)干預(yù)方式。HIIT是指短時(shí)間高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)(70%VO2max-100% VO2max或70%~100% HRmax(220-年齡))[15-18]和短時(shí)間間歇期(低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)或安靜休息)交替進(jìn)行,不斷重復(fù)多組的運(yùn)動(dòng)[19],根據(jù)受試者的具體情況,可以選擇不同的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、恢復(fù)形式和運(yùn)動(dòng)時(shí)長。Abbie E[20]等人觀察持續(xù)3周的兩種大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖女性血糖和血脂的干預(yù)效果,發(fā)現(xiàn)血脂和血糖指標(biāo)均未發(fā)生顯著性變化。Vatani D[21]等人的研究中讓受試者進(jìn)行6周的中等強(qiáng)度和高強(qiáng)度抗阻訓(xùn)練,發(fā)現(xiàn)載脂蛋白A、載脂蛋白B、TG未發(fā)生顯著變化,與中等強(qiáng)度干預(yù)組相比,高強(qiáng)度干預(yù)組HDL-C水平顯著升高。也有研究發(fā)現(xiàn)[22],運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度與HDL-C的濃度呈正相關(guān),與TC、TG、LDL-C的濃度呈負(fù)相關(guān)。由此可見,運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度是改善血脂等代謝狀況的重要因素之一。 一項(xiàng)關(guān)于運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì)餐后血脂影響與ApoE基因型關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn),中等強(qiáng)度和大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)ε2、ε3等位基因攜帶者餐后血脂的降低都有效果,但是ε2等位基因攜帶人群在中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后降脂效果更明顯,而ε3等位基因攜帶人群在高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后降脂效果更明顯[23]。ε4等位基因組運(yùn)動(dòng)干預(yù)后血脂的變化不盡相同,Lanny C[24]等通過28 d運(yùn)動(dòng)和飲食控制對(duì)肥胖青少年血脂異常的干預(yù)研究發(fā)現(xiàn),ε4等位基因人群TC和LDL-C出現(xiàn)顯著下降,TG和HDL-C未明顯改善,而Paul D[25]等人觀察不同基因型人群進(jìn)行60%~85%VO2max遞增強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)6個(gè)月,TG出現(xiàn)明顯下降,TC、LDL-C和HDL-C變化不明顯。其他研究也表明,長期堅(jiān)持運(yùn)動(dòng)鍛煉才能引起TG的顯著降低[26]。本研究中12周的HIIT干預(yù)后,發(fā)現(xiàn)ε3等位基因組的血清脂質(zhì)水平改善最明顯,ε4等位基因組干預(yù)后TC和LDL-C顯著下降,而TG和HDL-C則無顯著變化,ε2等位基因組的血清脂質(zhì)無明顯改變,提示對(duì)于HIIT的干預(yù)方式,ε3、ε4等位基因攜帶人群敏感,ε2等位基因攜帶人群不敏感。關(guān)于ApoE基因多態(tài)性對(duì)運(yùn)動(dòng)調(diào)脂效果的差別影響同樣在耐力性有氧運(yùn)動(dòng)中得到證實(shí)。Hagberg等[27]對(duì)45~80歲參加耐力訓(xùn)練的男性的研究發(fā)現(xiàn),血漿TC的下降和HDL-C的升高在ApoE2和ApoE3個(gè)體中顯著大于ApoE4。Taimela等[11]對(duì)9~18歲規(guī)律參加閑暇體育活動(dòng)的兒童青少年的研究發(fā)現(xiàn),E2/3、E3/3和E3/4男子,體力活動(dòng)水平與血漿TC和LDL-C改變呈負(fù)相關(guān),與HDL-C呈正相關(guān)。Blanca[28]等發(fā)現(xiàn)在飲食控制結(jié)合耐力性訓(xùn)練、力量性訓(xùn)練或力量耐力綜合訓(xùn)練后,血脂的有益性改變?cè)讦?等位基因組中最為顯著,ε4等位基因組變化最小。 本研究中12周的運(yùn)動(dòng)鍛煉產(chǎn)生的效果屬于近期鍛煉產(chǎn)生的急性效應(yīng),不是長期運(yùn)動(dòng)鍛煉產(chǎn)生的代謝變化,可能還不足以引起ε4等位基因攜帶人群TG的降低。運(yùn)動(dòng)對(duì)HDL-C的影響可能通過HDL在TG代謝中的作用來介導(dǎo)[29]。游離脂肪酸是長時(shí)間身體運(yùn)動(dòng)的主要能量來源,游離脂肪酸分別通過激素敏感和脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase, LPL)的作用來源于肌內(nèi)和循環(huán)TG。乳糜微粒和極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein, VLDL)的脫脂產(chǎn)生過量的表面膽固醇,并轉(zhuǎn)移至HDL顆粒上[30, 31]。富含TG的脂蛋白的血管內(nèi)水解可以替代運(yùn)動(dòng)過程中使用的肌內(nèi)脂肪,同時(shí)降低TG和增加HDL-C,這是運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練升高HDL-C的假設(shè)機(jī)制之一。ApoE促進(jìn)VLDL與LPL的相互作用[32],大約40%的血漿ApoE與HDL組分有關(guān)[33]。ApoE4個(gè)體的ApoE水平較低[34],可能是因?yàn)锳poE4和HDL顆粒的親和力降低,使脂蛋白和ApoE更快地轉(zhuǎn)移到LDL以及更快速的肝清除率[35]。降低的ApoE水平可以減少VLDL與LPL的相互作用,從而降低脂肪分解過程中膽固醇向高密度脂蛋白的輸送,這將減輕HDL-C隨運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的增加程度,這可能是本研究中ε4等位基因血脂異常者HDL-C變化不明顯的原因。 綜上,運(yùn)動(dòng)干預(yù)和基因型的特異性相互作用影響了血清脂質(zhì)水平,雖然具體機(jī)制目前還不清楚,但直接支持了遺傳變異性影響運(yùn)動(dòng)生理反應(yīng)的概念。12周HIIT的運(yùn)動(dòng)干預(yù)方式能夠有效改善ε3等位基因血脂異常人群血清TC、TG、HDL-C和LDL-C的水平;對(duì)于攜帶冠心病遺傳易患因子ε4等位基因的血脂異常者,HIIT的干預(yù)也能夠顯著降低其血清TC和LDL-C水平,這在其他耐力性運(yùn)動(dòng)干預(yù)方式中未發(fā)現(xiàn),對(duì)于預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病有積極意義;ε2等位基因攜帶者在12周HIIT干預(yù)后血清脂質(zhì)水平未出現(xiàn)顯著變化,提示ApoE等位基因?qū)\(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)血脂異常的影響可能存在運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度特異性,這為血脂異常者制定個(gè)性化運(yùn)動(dòng)處方提供參考依據(jù)。