依帕司他對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)纖維化的干預(yù)作用及其機(jī)制*

高云星， 湯 娟， 張 倩， 蔣莉莉， 李先偉△

(1． 皖南醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)微生物與免疫學(xué)教研室 241002； 2． 皖南醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室， 安徽省多糖藥物工程技術(shù)研究中心， 安徽 蕪湖 241002)

腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis, RIF)是慢性腎臟疾病發(fā)展的最終結(jié)果，是導(dǎo)致終末期腎病的重要病因[1]。其典型的病理變化為大量成纖維細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞的增生，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)如膠原纖維和纖粘連蛋白的大量沉積，近而導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化[2]。目前大量的研究表明轉(zhuǎn)化生成因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)被認(rèn)為是RIF過(guò)程中導(dǎo)致ECM大量沉積的主要原因[3]。

醛糖還原酶(aldose reductase, AR)為醛-酮還原酶超家族成員，是多元醇通路的限速酶，在糖尿病并發(fā)癥中起著關(guān)鍵作用[4]。但近年來(lái)研究還發(fā)現(xiàn)，AR在非糖尿病誘因引起的腎臟疾病中同樣起著一定的作用。研究表明，AR在腎小球硬化癥發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起一定的調(diào)節(jié)作用[5]，同樣AR在腎小球腎炎病變過(guò)程中也起一定的參與作用[6]。而本實(shí)驗(yàn)室前期工作表明，AR參與TGF-β1誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞的增殖及ECM的產(chǎn)生[7]。因此我們推測(cè)，TGF-β1/AR介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞EMT在腎間質(zhì)纖維化中起著重要作用。依帕司他(epalrestat, EPS)為AR抑制劑，對(duì)糖尿病神經(jīng)病變和糖尿病腎病具有明顯的干預(yù)作用[8, 9]。而本實(shí)驗(yàn)室前期工作表明，EPS可通過(guò)抑制AR的表達(dá)而減輕博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化[7]。但目前關(guān)于依帕司他對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎臟纖維化的保護(hù)作用未見(jiàn)報(bào)道?；谝陨系难芯勘尘埃狙芯拷柚鷨蝹?cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction, UUO)模型，研究依帕司他是否通過(guò)抑制AR的表達(dá)，從而減輕TGF-β1介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞EMT，進(jìn)而改善腎間質(zhì)纖維化，從而為臨床防治梗阻性腎間質(zhì)纖維化提供新的治療靶點(diǎn)以及制定新的治療策略提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)8周齡雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重(200±20) g，購(gòu)于南京青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)，許可證號(hào)：SCXK(浙)2017-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境為自然光照，室溫(25±5)℃，相對(duì)濕度55%～65%，自由進(jìn)食和飲水。

1.2 藥物及試劑

依帕司他(50 mg/片，揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)南京海陵藥業(yè)有限公司)、Masson膠原染色試劑(北京索萊寶科技有限公司)、TRIzol(美國(guó) Invitrogen公司)、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和real-time PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司)、PCR引物設(shè)計(jì)合成(上海生工)、小鼠抗大鼠GAPDH、轉(zhuǎn)化生成因子-β1(TGF-β1)及醛糖還原酶(AR)抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)、小鼠抗大鼠E鈣粘蛋白(E-cadherin)抗體及兔抗大鼠成纖維細(xì)胞特異蛋白-1(fibroblast-specific protein 1, FSP-1)、纖連蛋白(fibronectin, FN)及α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha-smooth muscle actin, α-SMA)抗體(美國(guó)Abcam公司)、PVDF膜和LunimataTMCrescendo發(fā)光液(美國(guó)Millipore公司)。

1.3 動(dòng)物模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為假手術(shù)(Sham)組、UUO組、UUO+EPS (50 mg/kg) 及UUO+EPS (100 mg/kg) 劑量組，每組8只。采用左側(cè)輸尿管結(jié)扎建立UUO大鼠模型，具體方法如下：用3%戊巴比妥鈉按30 mg/kg麻醉大鼠，在腹部左側(cè)1 cm處做一3 cm左右縱行切口，分離皮膚及皮下組織，暴露腎下極，游離輸尿管，UUO組及UUO+EPS組大鼠沿腎下極將左側(cè)輸尿管結(jié)扎，縫合皮下組織及皮膚。Sham組手術(shù)步驟同上，輸尿管不進(jìn)行結(jié)扎。造模后第2日開(kāi)始給藥，依帕司他用0.5%羧甲基纖維素鈉混勻，不同劑量的依帕司他按1 ml/100 g的體積每日灌胃給藥1次，Sham組和UUO組灌胃給予等體積羧甲基纖維素鈉(1 ml/100 g)，連續(xù)給藥3周。

1.4 標(biāo)本收集

于末次給藥24 h后用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠。分離左腎，沿左腎長(zhǎng)軸方向縱切，一半腎組織置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于形態(tài)學(xué)及免疫組化觀察；另一半腎組織用于相應(yīng)基因mRNA和蛋白表達(dá)的檢測(cè)。

1.5 形態(tài)學(xué)檢測(cè)

腎組織脫水、石蠟包埋后，切片后進(jìn)行HE及Masson染色，分別觀察大鼠腎組織病理變化及膠原沉積等情況。HE及Masson染色方法詳見(jiàn)我們前期研究成果[10]。

1.6 免疫組化檢測(cè)腎組織AR

免疫組化方法參照我們前期的研究方法[7]。AR抗體濃度(1∶500)，二抗?jié)舛?1∶1 000)。結(jié)果判斷：AR陽(yáng)性表達(dá)呈黃至棕黃色顆粒，主要定位于細(xì)胞漿。

1.7 Real-time PCR檢測(cè)腎組織collagen I、collagen III、α-SMA、FSP-1、FN、E-cadherin、TGF-β1及AR mRNA的表達(dá)

腎組織用液氮研磨后，分別依次用Trizol、氯仿、異丙醇等試劑提取總RNA，RNA定量后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以2 μl cDNA為模板，以GAPDH為內(nèi)參，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件參照我們前期的研究結(jié)果[10]。用StepOnePlus System SDS Software 軟件分析數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)各組ΔΔCt 值，計(jì)算相應(yīng)RQ值，比較各組mRNA的表達(dá)水平。引物列表如下(表1)。

Tab.1 Sequences of primers for real-time PCR

1.8 Western blot檢測(cè)腎組織collagen I、collagen III、α-SMA、FSP-1、FN、E-cadherin、TGF-β1及AR蛋白表達(dá)

組織用液氮研磨后，用RIPA裂解液(含0.1% PMSF)冰上裂解30 min。蛋白樣品定量變性后，用12%SDS-PAGE凝膠電泳分離樣品，然后蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別滴加GAPDH(1∶2 000)、collagen I (1∶500)、collagen III(1∶500)、α-SMA(1∶1 000)、FSP-1(1∶1 000)、E-cadherin(1∶500)、FN(1∶500)、TGF-β1(1∶ 1 000)和AR(1∶1 000)抗體在4 °C 條件下孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次10 min，相應(yīng)二抗(1∶ 2 000)室溫孵育1 h。TBST洗膜后將高靈敏的LunimataTMCrescendo發(fā)光劑加到膜的正面，采用Bio-Rad ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照用，Image J 1.43(National Institutes of Health)軟件進(jìn)行灰度值分析測(cè)量，將相應(yīng)目的蛋白與內(nèi)參蛋白(GAPDH)灰度值比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 依帕司他對(duì)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)病理學(xué)改變的影響

HE染色結(jié)果顯示，Sham組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)完整，腎小管周?chē)g質(zhì)未增寬；而UUO組大鼠腎小管上皮細(xì)胞萎縮、空泡樣變性，單核及巨噬細(xì)胞彌漫浸潤(rùn)，成纖維化明顯增生，腎小管周?chē)黠@出現(xiàn)間質(zhì)纖維化改變。當(dāng)給予不同劑量的依帕司他3周后，上述病理變化均不同程度緩解，提示依帕司他對(duì)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)病理變化具有一定的改善作用(圖1)。

Fig.1Effects of epalrestat on pathological changes of kidneys in UUO model rats (HE ×200)

UUO: Unilateral ureter obstruction; EPS: Epalrestat

2.2 依帕司他對(duì)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)膠原表達(dá)的影響

Masson染色結(jié)果顯示，Sham組大鼠腎間質(zhì)藍(lán)色染色較淡，膠原分布稀疏。而UUO組大鼠腎間質(zhì)藍(lán)色染色較深，膠原沉積明顯增加。與UUO組比較，不同劑量依帕司他組腎間質(zhì)藍(lán)色染色逐漸減輕，膠原沉積逐漸減少。蛋白及mRNA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與Sham組相比，UUO組大鼠腎組織Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)；與UUO組相比，EPS各劑量組Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA及蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05或P<0.01)；與EPS (50 mg/kg)組相比，EPS (100 mg/kg)劑量組Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA及蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低(P<0.05或P<0.01)。這些結(jié)果提示依帕司他對(duì)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)膠原沉積具有一定的改善作用(圖2，圖3，表2)。

Fig.2Effects of epalrestat on collagen accumulation of kidneys in UUO model rats (Masson ×200)

UUO: Unilateral ureter obstruction; EPS: Epalrestat

Fig.3Effects of epalrestat on collagen I and collagen III protein expressions of kidneys in UUO model rats by Western blot analysis

UUO: Unilateral ureter obstruction; EPS: Epalrestat

2.3 依帕司他對(duì)輸尿管梗阻大鼠腎組織α-SMA、FSP-1、FN 及 E-cadherin表達(dá)的影響

與Sham組比較，UUO組大鼠腎組織α-SMA 、FSP-1、FN mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高(P< 0.01)，而E-cadherin mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)。與UUO組相比，EPS (50、100 mg·kg-1)處理3周后α-SMA 、FSP-1、FN的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)，而E-cadherin mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)；與EPS (50 mg/kg)組相比，EPS (100 mg/kg)劑量組α-SMA 、FSP-1、FN的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯進(jìn)一步降低(P<0.05或P<0.01)，而E-cadherinm RNA及蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步升高(P<0.05或P<0.01)。這些結(jié)果提示依帕司他對(duì)輸尿管梗阻大鼠腎組織上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化具有一定的抑制作用(表3，表4，圖4)。

Group collagen I mRNA level(relative unit, RQ value)collagen III mRNA level(relative unit, RQ value)collagen I protein level (collagen I /GAPDH)collagen III protein level(collagen III /GAPDH)Sham1.04±0.091.07±0.100.28±0.030.42±0.03UUO5.38±0.57**4.73±0.49**0.85±0.08**1.08±0.11**+ EPS (50 mg/kg)3.65±0.44#3.58±0.39#0.59±0.06#0.82±0.09#+ EPS (100 mg/kg)3.03±0.29##△2.87±0.31##△△0.46±0.05##△△0.65±0.07##△△

UUO: Unilateral ureter obstruction; EPS: Epalrestat

**P<0.01vssham;#P<0.05,##P<0.01vsUUO;△P<0.05,△△P<0.01vsEPS (50 mg/kg)

Group α-SMA mRNA level(relative unit, RQ value)FSP-1 mRNA level(relative unit, RQ value)FN mRNA level(relative unit, RQ value)E-cadherin mRNA level(relative unit, RQ val-ue)Sham1.09±0.170.99±0.141.07±0.191.04±0.13UUO4.83±0.65**3.68±0.47**4.51±0.55**0.38±0.09**+ EPS (50 mg/kg)3.58±0.46#2.89±0.43#3.67±0.46#0.64±0.16#+ EPS (100 mg/kg)3.17±0.37##△2.56±0.38##△2.83±0.35##△△0.72±0.18##△△

UUO: Unilateral ureter obstruction; EPS: Epalrestat

**P<0.01vssham;#P<0.05,##P<0.01vsUUO;△P<0.05,△△P<0.01vsEPS (50 mg/kg)

Group α-SMA protein level(α-SMA /GAPDH)FSP-1 protein level(FSP-1/GAPDH)FN protein level(FN /GAPDH)E-cadherin protein level(E-cadherin /GAPDH)Sham0.34±0.040.16±0.050.11±0.030.93±0.07UUO1.24±0.15**1.07±0.10**1.03±0.14**0.27±0.04**+ EPS (50 mg/kg)0.99±0.12#0.78±0.09#0.71±0.09#0.42±0.08#+ EPS (100 mg/kg)0.77±0.09##△△0.65±0.07##△△0.55±0.08##△△0.58±0.06##△△

UUO: Unilateral ureter obstruction; EPS: Epalrestat

**P<0.01vssham;#P<0.05,##P<0.01vsUUO;△P<0.05,△△P<0.01vsEPS (50 mg/kg)

Fig.4Effects of epalrestat on α-SMA, FSP-1, FN and E-cadherin protein expressions of kidneys in UUO model rats by Western blot analysis

2.4 依帕司他對(duì)輸尿管梗阻大鼠腎組織TGF-β1表達(dá)的影響

與Sham組比較，UUO組大鼠腎組TGF-β1 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。與UUO組相比，EPS (50、100 mg·kg-1)處理3周后TGF-β1 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05或P< 0.01)；與EPS (50 mg/kg-1)組相比，EPS (100 mg/kg-1)劑量組TGF-β1 mRNA及蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步降低(P<0.05或P<0.01，圖5，表5)。

Tab.5 Effects of epalrestat on TGF-β1 and AR mRNA and protein expressions of kidneys in UUO model rats n=8)

TGF-β1: Transforming growth factor-β1; AR: Aldose reductase; UUO: Unilateral ureter obstruction; EPS: Epalrestat

**P<0.01vssham;#P<0.05,##P<0.01vsUUO;△P<0.05,△△P<0.01vsEPS (50 mg/kg)

Fig.5Effects of epalrestat on TGF-β1 protein expression of kidneys in UUO model rats by Western blot analysis

2.5 依帕司他對(duì)輸尿管梗阻大鼠腎組織AR表達(dá)的影響

經(jīng)real-time PCR、Western blot及免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與Sham組比較，UUO組大鼠腎組AR mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。與UUO組相比，不同劑量依帕司他組給藥3周后AR mRNA及蛋白表達(dá)水平均不同程度降低(P<0.05或P< 0.01)；與EPS (50 mg/kg)組相比，EPS (100 mg/kg)劑量組AR mRNA及蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步降低(P<0.05或P<0.01)(表5，圖6，圖7)。

Fig.6Effects of epalrestat on AR protein expression of kidneys in UUO model rats by Western blot analysis

Fig.7Effects of epalrestat on AR protein expression of kidneys in UUO model rats by immunohistochemisty stain (arrows indicated AR positive staining ×200)

UUO: Unilateral ureter obstruction; EPS: Epalrestat

3 討論

腎間質(zhì)纖維化(RIF)是各種慢性腎臟疾病進(jìn)展并導(dǎo)致腎功能衰竭的共同途徑和主要的病理基礎(chǔ)，其主要的病理變化是腎小管明顯擴(kuò)張，上皮細(xì)胞萎縮、空泡樣變性，間質(zhì)成纖維細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞、ECM過(guò)度沉積，并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[11]。單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)模型被認(rèn)為是研究RIF的經(jīng)典模型。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)實(shí)施UUO手術(shù)，建立大鼠RIF模型，結(jié)果顯示：UUO模型大鼠結(jié)扎側(cè)腎臟明顯增大，呈囊性改變，可見(jiàn)腎積水和腎間質(zhì)水腫，HE及masson染色可見(jiàn)間質(zhì)成纖維細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞大量增殖，膠原大量沉積，腎小管上皮細(xì)胞萎縮、空泡變性，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]。

依帕司他(epalrestat, EPS)是一種醛糖還原酶抑制劑，臨床上主要用于治療糖尿病神經(jīng)病變[8]。EPS除了對(duì)糖尿病神經(jīng)、腎臟和血管并發(fā)癥具有明顯的干預(yù)作用外，還具有降壓、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和血管重構(gòu)等作用[13]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，EPS對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化具有一定的改善作用[7]。本研究結(jié)果顯示，EPS連續(xù)給藥3周后，結(jié)扎側(cè)腎臟明顯縮小，腎積水和腎間質(zhì)水腫減輕，腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞明顯減少，腎小管上皮細(xì)胞空泡性變性明顯減輕，膠原沉積及Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)明顯降低。說(shuō)明EPS對(duì)腎間質(zhì)纖維化有明顯的改善作用。

腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚未完全闡明。而腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)一直被認(rèn)為是肌成纖維細(xì)胞的一個(gè)重要來(lái)源，在腎臟損傷修復(fù)中會(huì)有經(jīng)EMT生成肌成纖維細(xì)胞的參與，當(dāng)損傷和炎癥持續(xù)時(shí)，成纖維細(xì)胞逐漸累積致纖維化，最終引發(fā)腎臟功能以及結(jié)構(gòu)的破壞是RIF發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵[3]。腎小管EMT主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞固有極性的消失、失去上皮細(xì)胞表型標(biāo)志E-cadherin，獲得間質(zhì)表型標(biāo)志蛋白如α-SMA、FSP-1、FN及膠原蛋白，進(jìn)而導(dǎo)致上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，產(chǎn)生膠原導(dǎo)致腎臟纖維化，最終引發(fā)腎臟功能以及結(jié)構(gòu)的破壞[14]。本研究結(jié)果顯示，UUO模型大鼠腎組織E-cadherin的表達(dá)明顯降低而α-SMA、FSP-1、FN及Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)明顯升高，與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。雖然研究已證實(shí)TGF-β1通過(guò)Smad信號(hào)通路能夠促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞EMT的發(fā)生，進(jìn)而導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化[15]。但也有文獻(xiàn)報(bào)道，外源性TGF-β1可劑量和濃度依賴(lài)性地上調(diào)大鼠系膜細(xì)胞中AR的表達(dá)，AR的改變可以影響某些ECM成分，同時(shí)大鼠系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染AR后，可高表達(dá)FN和collagen I，應(yīng)用AR特異性抑制劑可以抑制系膜細(xì)胞的FN和collagen I蛋白表達(dá)[16, 17]。而我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，外源性TGF-β1可上調(diào)大鼠肺成纖維細(xì)胞AR的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)肺組織ECM合成和沉積，而用EPS抑制TGF-β1誘導(dǎo)的AR的表達(dá)后，肺組織纖維化癥狀明顯改善[7]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UUO模型大鼠腎臟TGF-β1及AR的表達(dá)明顯升高。而給予EPS后，腎臟TGF-β1及AR的表達(dá)明顯降低，同時(shí)E-cadherin蛋白表達(dá)水平增加，而α-SMA, FSP-1和FN蛋白表達(dá)水平降低，提示EPS通過(guò)下調(diào)TGF-β1及AR的表達(dá)，從而抑制腎纖維化中大鼠腎小管上皮細(xì)胞EMT的轉(zhuǎn)化，抑制膠原合成與沉積，發(fā)揮抗纖維化的作用。

綜上所述，依帕司他對(duì)腎間質(zhì)纖維化具有一定的改善作用，其機(jī)制可能與其抑制TGF-β1介導(dǎo)的AR的表達(dá)、進(jìn)而抑制大鼠腎小管上皮細(xì)胞EMT有關(guān)。本研究為臨床防治梗阻性腎間質(zhì)纖維化提供新的治療靶點(diǎn)并為依帕司他的臨床應(yīng)用奠定一定的試驗(yàn)基礎(chǔ)。