EGR1基因在牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化不同時期的表達(dá)及定位*

張偉偉， 邵淑麗△， 潘 陽， 李珊珊

(1. 齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院, 2. 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖分化對肌肉生長發(fā)育及損傷后的再生修復(fù)至關(guān)重要。骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化是一個復(fù)雜且協(xié)調(diào)的過程，該過程包括成肌細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期的退出、細(xì)胞融合及多核肌纖維的形成[1]。研究表明Myf5、MyoD、MyoG和MEF2等基因[2-5]在調(diào)控骨骼肌衛(wèi)星生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用，但仍然還有很多未知的調(diào)控機(jī)制，尋找和研究調(diào)控骨骼肌衛(wèi)星增殖分化的重要功能基因是動物育種研究和肌性疾病治療的重要目標(biāo)之一。

EGR1基因廣泛存在于哺乳動物和人類細(xì)胞中，屬于即刻早期基因家族，在受到一系列外界刺激后能迅速且短暫激活，作為轉(zhuǎn)錄因子，通過與靶基因啟動子上特異的位點(diǎn)結(jié)合，調(diào)控諸多靶基因的表達(dá)[6-8]，發(fā)揮各種生物學(xué)功能。但EGR1在骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化中的作用及入核機(jī)制仍不清楚。本文初步研究了EGR1基因在牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化過程中的表達(dá)、定位及入核機(jī)制，為探索EGR1調(diào)控牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(muscle-derived satellite cells，MDSCs)由本實(shí)驗(yàn)室制備并鑒定[9]。高糖DMEM購自Gibco公司，胎牛血清和馬血清購自BI公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購自北京全式金生物有限公司，蛋白質(zhì)提取試劑盒購自北京碧云天生物公司，無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分化

在生長培養(yǎng)基(高糖DMEM+20%胎牛血清+10%馬血清+5%青/鏈霉素) ，37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)牛MDSCs細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時，消化細(xì)胞以105個/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入生長培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合達(dá)85%后，更換為2%分化培養(yǎng)基(DMEM高糖培養(yǎng)液+2%馬血清)，在分化時間分別為0 h (MDSC-P)、1 d (MDSC-D1)、3 d (MDSC-D3)和5 d (MDSC-D5)時觀察細(xì)胞形態(tài)變化，每個時間點(diǎn)設(shè)置3個重復(fù)。同時收集細(xì)胞，用于后續(xù)的qRT-PCR和Western blot方法檢測。

1.3 qRT-PCR檢測EGR1基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)

根據(jù)牛EGR1和β-actin基因的序列采用Prime 5 軟件設(shè)計(jì)PCR引物。引物序列如下：EGR1-F:CAGGGGGAGGCAAGCGAGCAG，EGR1-R: ACTAGAACCTTCTCGTTATTC；β-actin-F:GACCTCTACGCCAACACG，β-actin-R:GCAGCTAACAGTCCGCCTA。將1.2中收集的各組細(xì)胞用Invitrogen Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，并按照TransScriptROne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，然后，以其為模板，β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行qRT-PCR。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，每個重復(fù)點(diǎn)樣時點(diǎn)3個孔，采用2-△△Ct方法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

1.4 Western blot檢測EGR1蛋白表達(dá)

利用1.2中收集的各組細(xì)胞，按照蛋白質(zhì)提取試劑盒(碧云天蛋白質(zhì)提取試劑盒)的說明提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)。將提取到的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白質(zhì)濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上，使用Odyssey封閉液室溫封閉2 h，一抗EGR1 (ab191441, abcam)和 GAPDH (ab22555, abcam) 按照1∶500稀釋，4℃孵育過夜，次日PBST洗膜；二抗室溫孵育1 h，在Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)中進(jìn)行掃描檢測。

1.5 免疫熒光檢測EGR1基因表達(dá)及其蛋白定位

MDSCs在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)匯合度達(dá)到80%時，消化后接種到6孔板，進(jìn)行細(xì)胞爬片。當(dāng)細(xì)胞匯合達(dá)85%后，更換為2%分化培養(yǎng)基，在分化時間分別為0 h (MDSC-P)、1 d (MDSC-D1)、3 d (MDSC-D3)和5 d (MDSC-D5)時用PBS洗3次，4%多聚甲醛固定30 min。PBS洗3次，每次5 min，加入PBST(透膜液) 室溫靜置30 min，PBS洗3次，每次5 min。1% BSA封閉1 h，加入封閉液稀釋的一抗(1∶50)，37℃孵育1 h，PBS洗3次，每次5 min，加入封閉液稀釋的二抗(1∶50)，37℃避光溫箱孵育1 h，PBS洗3次，每次5 min。DAPI避光溫箱孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min，加入DABCO(抗熒光淬滅劑)封片。分別使用熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.6 EGR1蛋白的氨基酸序列進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測

查詢NCBI Genbank中牛EGR1蛋白的氨基酸序列，利用http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/和http://kinasephos.mbc.nctu.edu.tw/ 網(wǎng)站對EGR1蛋白的氨基酸序列進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測。

1.7 EGR1基因載體構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

根據(jù)預(yù)測靶位點(diǎn)網(wǎng)站(http://zifit.partners.org/ZiFiT/CSquare9Nuclease.aspx)對EGR1基因啟動子區(qū)(-354---+263)進(jìn)行靶位點(diǎn)預(yù)測，確定2個CRISPRi干擾位點(diǎn)(表1)，每個干擾片段的5＇加上Bbs I酶切位點(diǎn)，序列合成后退火構(gòu)建到pSPgRNA載體上，重組載體送上海生工生物工程有限公司測序鑒定，序列正確的載體命名為pSg-EGR1-1和pSg-EGR1-2。

Tab.1Two sgRNAs targeting different sites of EGR1 promoter

No.PositionSequenceE1-354--- -335CACCGGCCATGTACGTCACGACGGE2-104--- -88CACCGCGCCCCGCATGTGACC

根據(jù)NCBI公布的牛EGR1基因(Gene ID: 407125)mRNA序列，設(shè)計(jì)特異性引物(F:CCGGAATTCGCCACCATGGCGGCAGCCAAGGC，R:AAGGAAAAAAGCGGC CGCTTAGCA AATTTCAATTGTCCTGGGAG)。以牛MDSCs的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收克隆入pcDNA3.1(+)載體上。經(jīng)測序鑒定后，以序列正確的重組載體為模板，進(jìn)行位點(diǎn)突變載體構(gòu)建，引物如下：mu-F:CGGAATTCGCCACCATGGCGGCAGC CAAGGC, mu-R: AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTAGCAAATTTCAATTGTCCTGGGGGC AAAGGTGGTTGT，測序鑒定后命名為S533A-p3.1-EGR1。

序列正確的載體轉(zhuǎn)化后，搖菌，使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，采用PEI法轉(zhuǎn)染牛MDSCs細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，qRT-PCR和Western blot方法檢測EGR1基因的表達(dá)，免疫熒光方法檢測EGR1蛋白的定位。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，數(shù)據(jù)通過SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分化處理， 利用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果

2.1 EGR1基因在牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化不同時期表達(dá)

牛MDSCs分化1 d(MDSC-D1)、3 d(MDSC-D3)和5 d(MDSC-D5)的EGR1 基因的表達(dá)見圖1A，由圖可知，隨著分化進(jìn)行，和未分化的細(xì)胞(MDSC-P)相比，EGR1 基因的mRNA表達(dá)水平顯著升高，分化第3日時表達(dá)量最高，隨后呈下降趨勢。EGR1基因的蛋白表達(dá)趨勢和mRNA的趨勢一致(圖1B)。

Fig.1Expressions of EGR1 during the differentiation of MDSCs

A: Relative mRNA expressions of EGR1 gene detected by qRT-PCR; B: The protein expressions of EGR1 gene detected by Western blot

*P<0.05,**P<0.01vsMDSC-P of EGR1

免疫熒光檢測結(jié)果表明，EGR1蛋白主要在分化的MDSC中表達(dá)，并且隨著肌管數(shù)量的增多而表達(dá)量增加(圖2，見彩圖頁Ⅲ)。

2.2 EGR1基因在牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化不同時期表達(dá)定位

EGR1蛋白在細(xì)胞中的分布見圖3，未分化細(xì)胞中EGR1主要分布在胞質(zhì)中(圖3 MDSC-P)，隨著細(xì)胞分化EGR1部分轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核(圖3， MDSC-D1，MDSC-D5，白色箭頭所指，見彩圖頁Ⅲ)。

2.3 EGR1蛋白入核機(jī)制初探

EGR1蛋白的氨基酸序列磷酸化位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果見圖4，由圖可知，EGR1蛋白C末端第533位氨基酸是絲氨酸，是潛在的可被磷酸激酶磷酸化的位點(diǎn)(圖4)，因此我們推測EGR1入核可能需要磷酸化。

Fig.4Sequence analysis of EGR1 amino acid

通過CRISPRi法干擾內(nèi)源EGR1的表達(dá)，結(jié)果表明pSg-EGR1-2可有效干擾EGR1基因的表達(dá)，降低EGR1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平(圖 5)。

Fig.5Expression of EGR1 gene after transfected with pSg-EGR1

A: Relative mRNA expression of EGR1 gene detected by qRT-PCR; B: The protein expression of EGR1 gene detected by Western blot; CK： MDSCs transfected with pSPgRNA, pSg-EGR1-1: MDSCs transfected with pSg-EGR1-1, MDSCs transfected with pSg-EGR1-2.

*P<0.05,**P<0.01vsCK

將pSg-EGR1-2干擾載體和S533A-p3.1-EGR1過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染MDSCs細(xì)胞后，共聚焦結(jié)果表明與對照組細(xì)胞相比，CRISPRi干擾組細(xì)胞核內(nèi)未見EGR1表達(dá)(圖6 pSg-EGR1-2轉(zhuǎn)染組白色箭頭所指)，之后轉(zhuǎn)入突變過表達(dá)載體后，細(xì)胞質(zhì)中EGR1表達(dá)增高(圖6紅色箭頭所指)，但細(xì)胞核中仍未見EGR1表達(dá)(圖6共轉(zhuǎn)染組白色箭頭所指，見彩圖頁Ⅳ)。

3 討論

EGR1是一個Cys2-His2型鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，大量細(xì)胞外信號刺激可激活EGR1表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、分化和凋亡[8]。骨骼肌發(fā)育是肉牛生長發(fā)育的重要組成部分，直接影響肉牛的產(chǎn)肉量和質(zhì)量，研究者們也發(fā)現(xiàn)腺苷酸活化蛋白激酶α2(AMPKα2)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)和腓腸肌自噬相關(guān)基因(atg)atg7、atg10、atg12、atg16L1 等基因在鼠骨骼肌發(fā)育及損傷后修復(fù)中表達(dá)變化顯著[11,12]，但是目前尚未見EGR1在牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(MDSCs)發(fā)育中的報(bào)道。

為了明確EGR1基因在牛MDSCs分化中的作用，本研究檢測了牛MDSCs分化不同時期EGR1 基因的表達(dá)變化。結(jié)果表明分化的MDSCs細(xì)胞中EGR1基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)都顯著比未分化的細(xì)胞高，并且其表達(dá)量和分化的時間有關(guān)系，在分化的第3日達(dá)到最高量，隨后開始下降(圖1, 圖2)。Abdulkadir等人的研究表明，干擾掉小鼠的EGR1基因后，其前列腺腫瘤細(xì)胞的發(fā)生過程受到損傷[12]，這就意味著EGR1基因在小鼠前列腺腫瘤細(xì)胞發(fā)育中的作用是抑制了增殖；Baron等人的研究也顯示，EGR1基因是多種腫瘤細(xì)胞增殖的抑制因子[13]；Figliola R等人在小鼠C2C12細(xì)胞中隨著成肌細(xì)胞分化EGR1表達(dá)增高[14]。這些結(jié)果也說明在我們的研究中EGR1基因的表達(dá)可能和MDSCs的分化存在著正相關(guān)，即促進(jìn)MDSCs的分化。

作為核轉(zhuǎn)錄因子EGR1主要通過與靶基因啟動子區(qū)域的GC框[15, 16]和Egr反應(yīng)元件[17]相結(jié)合，上調(diào)或下調(diào)基因的轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化、增殖和凋亡[18, 19]。在我們的研究中，在分化的MDSCs細(xì)胞核中觀察到EGR1蛋白(圖3)，說明EGR1蛋白進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用。已有文獻(xiàn)報(bào)道EGR1入核由其C末端序列決定[20]。為了研究EGR1蛋白入核的機(jī)制，我們將EGR1蛋白C端第533位絲氨酸突變?yōu)楸彼?，在干擾內(nèi)源EGR1基因表達(dá)的基礎(chǔ)上，在MDSCs細(xì)胞核中未檢測到突變后的EGR1蛋白(圖6)，表明533位絲氨酸發(fā)生磷酸化是EGR1入核所必需，這個結(jié)果和Ponti等人的研究結(jié)果是一致的[20]。

綜上所述，EGR1基因在牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化中表達(dá)顯著升高，并且能夠通過EGR1蛋白C末端533位絲氨酸磷酸化進(jìn)入細(xì)胞核，暗示著EGR1可能通過調(diào)控某些基因的表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞的分化。