基于生物信息分析技術(shù)的精準(zhǔn)醫(yī)療

猶龍江

(貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院 貴陽 550025)

1 引言

2015年1月20日美國總統(tǒng)奧巴馬宣布啟動精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)計劃并決定一期投入約2億美元。2015年12月11日在上海成立“中國個體化用藥-精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)科學(xué)產(chǎn)業(yè)聯(lián)盟”，標(biāo)志我國正式開始精準(zhǔn)醫(yī)療的探索。同年召開首次精準(zhǔn)醫(yī)療戰(zhàn)略專家會議，最終決定在2030年前對精準(zhǔn)醫(yī)療領(lǐng)域投入600億元。精準(zhǔn)醫(yī)療根據(jù)患者基因、生活環(huán)境和方式的個體特異性推測疾病的發(fā)生，從而采取有效、精準(zhǔn)的疾病預(yù)防與治療手段。精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展是建立在目前科學(xué)技術(shù)快速發(fā)展基礎(chǔ)上的，如人類全基因組測序、生物信息分析技術(shù)、大數(shù)據(jù)分析工具等。當(dāng)前精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)用于人類癌癥治療靶向藥物的創(chuàng)新臨床實驗、綜合性用藥選擇以及克服個體耐藥性。

人類基因組計劃(Human Genome Project,HGC)的目標(biāo)是解碼生命，了解生命起源、成長與衰退；認(rèn)識個體之間的差異性原因，對人類疾病的發(fā)生機(jī)制、致病機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)，同時極大促進(jìn)相關(guān)行業(yè)的發(fā)展。如基因測序技術(shù)、功能基因組學(xué)、比較基因組學(xué)、生物信息學(xué)、計算生物學(xué)等。其中生物信息學(xué)和計算生物學(xué)是對物種個體基因的基礎(chǔ)且關(guān)鍵的分析技術(shù)，分析人員掌握技術(shù)的熟練程度與分析結(jié)果有密切聯(lián)系。

2 生物信息學(xué)概述

2.1 基本技能

生物信息學(xué)與計算生物學(xué)之間界限比較模糊，生物信息學(xué)側(cè)重對數(shù)據(jù)的提取、挖掘，而計算生物學(xué)側(cè)重對數(shù)據(jù)的處理、運用。目前生物信息學(xué)和計算生物學(xué)在處理對象和方法上已無顯著差別，分析方法大同小異、流程相似。生物信息學(xué)需掌握的技能是運用開源數(shù)據(jù)分析工具挖掘海量的基因測序數(shù)據(jù)，而對數(shù)據(jù)分析的能力決定對復(fù)雜生命認(rèn)識與理解。在進(jìn)行生物信息學(xué)分析之前應(yīng)掌握以下幾點：(1)可利用Shell、R、Python等計算語言編寫腳本將機(jī)械性的文件處理操作轉(zhuǎn)化為簡單的指令運行。(2)使用強(qiáng)大的Linux(Unix)系統(tǒng)運行開源數(shù)據(jù)處理程序。(3)掌握R語言的探索性數(shù)據(jù)分析方法。(4)了解基因組數(shù)據(jù)文件格式。如FASTA、FASTQ、SAM、BAM等。(5)具有一定的分子生物學(xué)知識背景。2001年后至今被稱為后基因組時代，完成人類基因組測序、各種模式生物基因組測序，基因組學(xué)的研究重心也轉(zhuǎn)向功能基因組學(xué)。

2.2 研究方向與應(yīng)用

經(jīng)過十幾年的發(fā)展現(xiàn)已形成多個研究方向，根據(jù)分析數(shù)據(jù)來源不同，主要分為全外顯子測序分析、轉(zhuǎn)錄組測序分析、染色質(zhì)免疫共沉淀測序。以往生物信息學(xué)研究領(lǐng)域重點在于基因表達(dá)譜、個體物質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)、基因芯片設(shè)計和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)分析。進(jìn)入后基因組時代其研究領(lǐng)域有了重大發(fā)展——擴(kuò)展至結(jié)構(gòu)基因組學(xué)、功能基因組學(xué)、比較基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、藥物基因組學(xué)、腫瘤基因組學(xué)、分子流行病學(xué)和環(huán)境基因組學(xué)。

3 生物信息學(xué)分析流程

3.1 全外顯子測序分析技術(shù)

通過捕獲全基因組的外顯子區(qū)域、富集后進(jìn)行高通量測序，能夠直接發(fā)現(xiàn)與蛋白質(zhì)功能變異相關(guān)的遺傳變異。人類基因組中外顯子僅占約1%[1]，但作為編碼蛋白質(zhì)的序列區(qū)域，且超過85%的孟德爾遺傳病都與基因組外顯子變異有密切聯(lián)系，更適用于臨床發(fā)現(xiàn)、確診部分孕期疾病[2]。目前產(chǎn)前診斷常用方法是B超影像學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)胎兒異常后采用核型分析或染色體微陣列芯片等技術(shù)，綜合診斷率約14～16%[1-2]，更高效、精確的診斷技術(shù)迫切需要。WES的臨床推廣運用可能將孟德爾遺傳病診斷率提高到20～80%。全外顯子測序分析具體流程，見圖1。外顯子測序后獲得原始數(shù)據(jù)，過濾除去高通量測序時插入的接頭引物，然后與從公共數(shù)據(jù)庫(如NCBI、Ensemble等)獲取的參考基因組進(jìn)行比對，找出突變編碼區(qū)，篩選出與遺傳疾病相關(guān)的基因變異，成為候選基因并進(jìn)行討論和分析，總結(jié)實驗結(jié)果。通過全基因組外顯子測序分析技術(shù)不僅能有效、準(zhǔn)確地定位致病基因位點，還能發(fā)現(xiàn)新的突變位點的致病基因，對闡明相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)理、機(jī)制、遺傳診斷具有重要的研究和推廣價值。此外不依靠昂貴、精確的大型設(shè)備儀器，而是多依據(jù)計算機(jī)對測序數(shù)據(jù)的處理及分析人員對公共數(shù)據(jù)庫的理解和運用。該技術(shù)在臨床疾病研究中具有推廣與應(yīng)用價值。

圖1 全外顯子測序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析流程

3.2 轉(zhuǎn)錄組測序分析技術(shù)

指特定組織或細(xì)胞發(fā)生在某一階段或功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來的核糖核酸(Ribonucleic Acid，RNA)總和，主要包括mRNA和非編碼RNA(ncRNA)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)是對基因結(jié)構(gòu)、功能新的研究出發(fā)點，是對研究對象在特定發(fā)育階段下的分析。相比全基因組分析，轉(zhuǎn)錄組分析具有更高的靈敏度，可以精確識別可變剪切位點、基因的表達(dá)水平；對任意物種的全基因組分析甚至可能發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本、檢測融合基因[3]。組學(xué)分析將可能為中醫(yī)理論中的陰陽學(xué)說進(jìn)行科學(xué)分析與數(shù)據(jù)結(jié)果實踐證明。通過分析陽類和陰類急性缺血性中風(fēng)，可以使用部分差異lncRNA和miRNA作為潛在疾病診斷的標(biāo)記物，是十分具有潛力的研究方法。

4 基于生物信息分析技術(shù)的精準(zhǔn)醫(yī)療

4.1 精神疾病藥物使用指導(dǎo)

4.1.1 第2類精神藥物依賴 近年修改《麻醉藥品和精神藥品管理條例》有關(guān)規(guī)定，國家食品藥品監(jiān)管總局、公安部、原國家衛(wèi)生計生委決定將含可待因的復(fù)方口服液體制劑(包括口服溶液劑、糖漿劑)列入第2類精神藥品管理[4]。其原因在于對敏感藥物基因的臨床實驗發(fā)現(xiàn)CYP2D6超快代謝哺乳期婦女，分泌到乳汁中可待因可能出現(xiàn)藥物過量，導(dǎo)致乳兒可能出現(xiàn)致死性不良反應(yīng)[5]。隨著研究人員對藥物代謝相關(guān)基因的研究，對部分藥品的使用說明書進(jìn)行修改，體現(xiàn)出現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對精準(zhǔn)用藥的要求。隨著測序技術(shù)以及相關(guān)行業(yè)的發(fā)展，目前進(jìn)行指定藥物相關(guān)基因的檢測費用約3 000元/次，周期為3～4天，檢測結(jié)果終身有效。

4.1.2 指導(dǎo)精神藥物使用 武漢市優(yōu)撫醫(yī)院通過精神疾病患者的臨床癥狀、基因檢測分析結(jié)果為其制定精準(zhǔn)治療方案[6]。取患者口腔上皮細(xì)胞進(jìn)行藥物基因檢測，結(jié)合臨床用藥結(jié)果分析，該患者應(yīng)選用CYP2D6基因型廣泛代謝型藥物，典型藥物有奮乃靜、氟哌啶醇等。

4.2 敏感性藥物基因篩查

4.2.1 通過敏感性藥物基因檢測實現(xiàn)個體化用藥 根據(jù)用藥患者個體差異引起的藥物吸收、轉(zhuǎn)運、代謝等不同而實現(xiàn)有效的聯(lián)合用藥、精準(zhǔn)治療，降低患者對藥物的耐受性和用藥成本。藥物基因檢測常用方法有3種：實時熒光定量PCR(qPCR)、熒光原位雜交(FISH)、基因測序技術(shù)。qPCR技術(shù)常用于對藥物干擾基因mRNA的表達(dá)水平的檢測，判斷使用相關(guān)藥物的療效。FISH是使用熒光探針技術(shù)對藥物或疾病相關(guān)基因的檢測。而測序技術(shù)通過對個體全基因組測序后進(jìn)行生物學(xué)分析，篩選出潛在的遺傳疾病和相關(guān)治療藥物蛋白基因多態(tài)性。如細(xì)胞色素P450為自身氧化的亞鐵血紅蛋白家族，又稱多功能氧化酶，多參與內(nèi)源性物質(zhì)的代謝。CYP2D6基因型為CYP450酶系中重要的一種并且是唯一一種不能被誘導(dǎo)的酶。研究表明CYP2D6參與臨床常用藥物的體內(nèi)代謝[7]，如奮乃靜、氟哌啶醇等抗精神疾病藥物，氯丙嗪、美沙酮等鎮(zhèn)靜類藥物，吉非替尼片、他莫昔芬等抗腫瘤藥物。

4.2.2 腫瘤領(lǐng)域個體化用藥案例 香港中文大學(xué)莫樹錦教授的臨床實驗說明藥物基因檢測的潛在價值。該試驗?zāi)康氖翘骄恳兹鹕呈欠裉岣邅喼薹伟┗颊叩纳嫫谕?，首次引入基因檢測因素，將服用藥物的患者進(jìn)行表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Recepter，EGFR)基因檢測。實驗結(jié)果證實易瑞沙對敏感EGFR突變患者具有良好的治療效果，也提示非敏感患者應(yīng)接受常規(guī)治療方案。該實驗是腫瘤治療領(lǐng)域率先引入的個體化用藥案例之一。

4.3 個體疾病潛在的精確診斷方式

4.3.1 診斷疾病的分子標(biāo)記物 隨著測序、序列分析技術(shù)的不斷發(fā)展，許多常見和罕見的系統(tǒng)疾病分子標(biāo)記物被確定，如阿爾茨海默癥(Alzheimer′s Disease,AD)、帕金森癥(Parkinson′s Disease,PD)、多發(fā)性硬化癥(Multiple Sclerosis,MS)等。盡管疾病的發(fā)生存在多因素與異質(zhì)性的影響，但是分子標(biāo)記物的確定能作為疾病精確診斷的方式。就AD而言，目前已證實遺傳因素在其病理機(jī)制中扮演重要角色[8]。2011年的文獻(xiàn)證實基因APP、RSEN1和PSEN2的遺傳突變直接導(dǎo)致早發(fā)性阿爾茨海默癥(Early Onset Alzheimer′s Disease，EOAD)，但是之后在出現(xiàn)EOAD的臨床患者中并沒有檢測到這3個基因的突變。隨著研究深入目前已發(fā)現(xiàn)3個機(jī)制不明的小家系EOAD的遺傳因素。第1個為NOTCH3基因的錯義突變[9]；第2個在SORL1的錯義和無意義的突變[10]；第3個為在腦小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的免疫吞噬受體TREM2外顯子2變異與AD的早發(fā)性和遲發(fā)性具有密切聯(lián)系[11]。通過不斷的研究發(fā)現(xiàn)疾病的致病因子很多，機(jī)制也很復(fù)雜。

4.3.2 腫瘤篩查領(lǐng)域 在腫瘤疾病研究領(lǐng)域中基因變異檢測是精準(zhǔn)醫(yī)療中重要的組成部分[12]。臨床腫瘤患者多用組織活檢技術(shù)，結(jié)果不完全準(zhǔn)確，存在65%的假陽性[13]。但基因檢測技術(shù)可以將癌癥的診斷提前到細(xì)胞癌變階段，為腫瘤的預(yù)防提供基因水平上的指導(dǎo)。

5 討論

5.1 生物醫(yī)學(xué)大數(shù)據(jù)應(yīng)用

5.1.1 價值與意義 目前正處于由基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、影像學(xué)、臨床診斷數(shù)據(jù)等構(gòu)成的生物醫(yī)學(xué)大數(shù)據(jù)時代。對生物醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)信息的理解、運用將擴(kuò)展為現(xiàn)階段對患者從診斷到預(yù)防再到個性化治療的疾病管理新模式。如果使用得當(dāng)大數(shù)據(jù)將成為具有重要價值的資源，用于改善當(dāng)前的醫(yī)療服務(wù)和降低醫(yī)療成本。到2022年美國醫(yī)療保健占GDP的比例預(yù)計達(dá)到19.9%[14]。中國是人口大國的新興經(jīng)濟(jì)體，尤其是新的高通量測序平臺、實時成像系統(tǒng)、亞洲基因數(shù)據(jù)庫建立將極大促進(jìn)中國未來生命科學(xué)發(fā)展。

5.1.2 構(gòu)建相關(guān)數(shù)據(jù)庫 生物信息學(xué)發(fā)展從個體基因組測序擴(kuò)展到測量表觀基因組數(shù)據(jù)，研究基因的表達(dá)過程不僅僅局限于DNA序列的修飾，如DNA甲基化修飾、His-tone修飾[15]。生物信息的獲取除基因組學(xué)外還包括轉(zhuǎn)錄組組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等。而組學(xué)就是強(qiáng)調(diào)對生物體結(jié)構(gòu)、功能和生物分子動力學(xué)進(jìn)行集體的量化。大數(shù)據(jù)可以提高臨床研究實用性，有助于有效精確地對患者進(jìn)行分類，這是定制個性化醫(yī)療方案和充分利用醫(yī)療資源的關(guān)鍵點。從人口學(xué)角度出發(fā)，研究某人疾病的發(fā)生過程可以用來預(yù)測和預(yù)防同樣疾病的發(fā)生，構(gòu)建中國生物醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)庫具有重要的戰(zhàn)略意義。

5.2 現(xiàn)階段精準(zhǔn)醫(yī)療爭論

5.2.1 基因檢測商業(yè)化 基因檢測技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢查、疾病診斷、精準(zhǔn)用藥等方面發(fā)揮巨大作用。這項檢測使一些重大慢性疾病治愈率大幅提高，基因檢測逐步被接受，用于商業(yè)化使用[16]?；驕y序是精準(zhǔn)醫(yī)療的基礎(chǔ)，藥物基因的篩選雖然提高治療藥物的準(zhǔn)確性，但是也限制治療藥物的使用。血液腫瘤學(xué)家維奈·普拉薩德(Vinay Prasad)于2016年在《自然》發(fā)表相關(guān)文章，指出絕大多數(shù)的腫瘤患者并沒有通過個體化的精準(zhǔn)醫(yī)療方案提高生存幾率、生活質(zhì)量，相反帶來的是額外的昂貴醫(yī)療費用[17]。但筆者認(rèn)為目前個體化治療方案的失敗更多的可能是目前方法學(xué)理論的失敗[18]。根據(jù)2018年5月在北京召開的中國消費級基因檢測行業(yè)峰會，如果參照美國基因檢測近5年的滲透率變化，2020年中國的滲透率達(dá)到3.5%。

5.2.2 藥物精準(zhǔn)使用 對患者進(jìn)行藥物敏感性基因篩查，除篩查結(jié)果終身可參考使用外還能為醫(yī)生臨床治療用藥提供指導(dǎo)，減少不敏感藥物的使用，降低患者多次使用不同藥物產(chǎn)生的藥物耐受性，減少治療負(fù)擔(dān)。實現(xiàn)有效用藥從而避免患者多次重復(fù)就診和藥物使用，充分有效利用醫(yī)院和藥品資源。

5.3 生物信息學(xué)人才培養(yǎng)

5.3.1 引導(dǎo)學(xué)生興趣 基因組學(xué)研究基因突變或差異產(chǎn)生的個體差異性，轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究某種外因?qū)€體產(chǎn)生的影響，而代謝組學(xué)則是在研究個體目前的差異性變化。基因在細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄出信使RNA，然后翻譯為功能性蛋白質(zhì)，參與復(fù)雜的生命活動行為。利用開源軟件分析數(shù)據(jù)，掌握一門匯編語言，具有一定的分子生物學(xué)知識背景，是生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)要求。學(xué)生開始學(xué)習(xí)時應(yīng)多了解最新研究開發(fā)出的開源數(shù)據(jù)挖掘軟件、分析算法、流程、數(shù)據(jù)庫、大量的高質(zhì)量文獻(xiàn)和具有重復(fù)性的代碼參考。然后根據(jù)興趣選擇研究方向，包括計算生物學(xué)、基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等。

5.3.2 完善培養(yǎng)方案 相關(guān)文獻(xiàn)每年發(fā)表總量增長說明生物信息技術(shù)廣泛用于生命科學(xué)研究。在臨床應(yīng)用中醫(yī)學(xué)信息學(xué)利用患者疾病現(xiàn)階段的全外顯子測序或轉(zhuǎn)錄組測序，篩選出致病突變基因，選擇靶向用藥，實現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療[6]。在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)用于人類腫瘤治療靶向藥物的創(chuàng)新臨床實驗、使用選擇以及克服個體耐藥方面，生物信息技術(shù)是最關(guān)鍵、最基礎(chǔ)的分析技術(shù)[12]。生物信息學(xué)在科學(xué)領(lǐng)域的研究和臨床實踐的實用價值以及專業(yè)人才分類說明研究行業(yè)對該專業(yè)人才的需求。高校應(yīng)注重該專業(yè)人才培養(yǎng)，提出相適宜的人才培養(yǎng)方案體系。

6 結(jié)語

目前的疾病診斷和治療主要依賴于患者的主觀感受、病史資料、醫(yī)生的主觀辨別和大量昂貴設(shè)備輔助診斷結(jié)果，在臨床治療過程中不斷進(jìn)行驗證和修改治療方案。在未來的疾病診斷方面，尤其是惡性疾病的早期診斷，疾病相關(guān)基因分子標(biāo)記物的篩查具有重要意義。隨著基因組學(xué)研究、疾病機(jī)制和相關(guān)基因分子標(biāo)記物不斷發(fā)現(xiàn)和證實，疾病基因分子標(biāo)記確定精確性不斷提高，未來有望實現(xiàn)血液中分子標(biāo)記物的PCR定性檢測和qPCR的定量檢測，大大提高疾病正確診斷率。個體化的精準(zhǔn)醫(yī)療方案雖然因個體基因的多態(tài)性而缺乏特異性的靶向治療藥物，但筆者認(rèn)為這項技術(shù)為患者提供更適合的醫(yī)療方案，又避免不敏感靶向治療藥物的使用，同時也為新型靶向藥物的研究提供方向。隨著測序技術(shù)不斷升級，分析方案不斷優(yōu)化，檢測成本不斷下降以及靶向治療藥物的開發(fā)，未來有望將基因檢測納入醫(yī)保政策。