西蘭花副產(chǎn)物中蘿卜硫素提取、純化及鑒定

張錦華，郭 楠,2，楊 妍，李慶鵬,*，郭 芹,*，段玉權(quán)，哈益明

西蘭花為十字花科蕓薹屬蔬菜，因其含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)且配比合理被稱為“蔬菜皇冠”[1]。多項(xiàng)流行病學(xué)研究表明，食用十字花科蔬菜與降低癌癥風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。進(jìn)一步研究證實(shí)十字花科蔬菜中的異硫氰酸鹽是其抗癌作用的主要成分，而蘿卜硫素更是其中的佼佼者[2-3]。蘿卜硫素化學(xué)名稱為1-異硫氰酸-4-甲磺?；⊥椋谥参镏幸云淝绑w物質(zhì)蘿卜硫苷的形式存在，在特定條件下經(jīng)黑芥子酶水解得到[4]。目前人們已經(jīng)通過化學(xué)合成[5]、半合成[6]和酶法提取獲得蘿卜硫素，但利用化學(xué)合成與半合成法合成蘿卜硫素需使用大量有毒試劑，且反應(yīng)過程難以控制，因而并未得到廣泛應(yīng)用；而酶法與溶劑提取法相結(jié)合從植物中提取天然蘿卜硫素，具有操作簡(jiǎn)單、成本低廉、產(chǎn)物天然等優(yōu)點(diǎn)，近年來被廣泛應(yīng)用[7]。

對(duì)于蘿卜硫素的提取，研究者多以西蘭花種子為原料[8-10]，還有少數(shù)從西蘭花芽苗中獲取[11]，但較少人利用西蘭花采收后副產(chǎn)物（丟棄的根莖葉）為原料提取，究其原因是蘿卜硫素在種子中含量最高，在種子發(fā)芽至成熟的過程中分化至各植物組織，含量大小依次為花蕾＞子葉＞莖[12]。而實(shí)際上，西蘭花采收后產(chǎn)生大量副產(chǎn)物，其中大多數(shù)被直接丟棄，綜合利用率極低，且副產(chǎn)物腐爛后嚴(yán)重影響環(huán)境衛(wèi)生，因此利用西蘭花副產(chǎn)物提取蘿卜硫素具有重要的理論和實(shí)踐意義。

從植物中提取蘿卜硫素有酶解和提取2 個(gè)過程。蘿卜硫苷在黑芥子酶作用下的水解產(chǎn)物復(fù)雜，除蘿卜硫素外還有其他異硫氰酸鹽、硫氰酸鹽、腈類、惡唑烷酮類和氰化物等，且產(chǎn)物的組成和含量與水解條件、蛋白質(zhì)輔助因子、Fe2+等有關(guān)[13]。因此，本實(shí)驗(yàn)擬以西蘭花副產(chǎn)物為原料提取蘿卜硫素，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化酶解浸提工藝，并在最佳工藝的基礎(chǔ)上利用半制備高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）純化和富集蘿卜硫素，最后通過超高效液相色譜-質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS）聯(lián)用技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定。本研究旨在提供一種原料來源廣、方便、快速、高效的蘿卜硫素提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丟棄的西蘭花副產(chǎn)物（主要為莖、葉），新鮮無病害，來自于北京市豐臺(tái)區(qū)新發(fā)地農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)地；芥菜籽香港蔡興利國(guó)際有限公司。

蘿卜硫素（純度≥95%，色譜純） 上海源葉生物科技有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸、丙酮（均為分析純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈、甲酸（均為色譜純） 賽默飛世爾有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AE-240型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；UV-1800紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；1200 HPLC儀、Varian Prostar 218半制備HPLC儀、1290-QE-Focus UPLC-MS儀 美國(guó)安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 蘿卜硫素提取

綜合參考文獻(xiàn)[8-11]的提取方法并加以改進(jìn)，蘿卜硫素提取過程如下：

樣品→加磷酸緩沖液→加外源酶溶液→超聲酶解→冷凍干燥→丙酮提取→抽濾→蘿卜硫素粗提取液→旋蒸濃縮→50%乙腈溶液復(fù)溶→過0.45 μm濾膜→HPLC分析

樣品前處理：西蘭花副產(chǎn)物洗凈，于鼓風(fēng)干燥箱中70 ℃烘干至恒質(zhì)量，粉碎后過60 目篩，裝袋置干燥器保存?zhèn)溆谩?/p>

外源黑芥子酶制備：參考胡翠珍等[14]的方法，取新收獲芥菜籽，粉碎，過60 目篩，稱取5 g至三角瓶中，加入250 mL蒸餾水，超聲波振蕩20 min，過濾除雜得粗酶液。使用前現(xiàn)配或儲(chǔ)存于-20 ℃。

蘿卜硫素提取：準(zhǔn)確稱取西蘭花粉2 g于100 mL三角瓶中，加10 mL pH 5.0磷酸緩沖液，15 mL外源酶溶液，于100 Hz超聲波中酶解60 min，結(jié)束后置于-20 ℃冰箱預(yù)凍，后真空冷凍干燥18 h。干燥樣品用30 mL丙酮溶解，超聲提取90 min，抽濾，得蘿卜硫素粗提取液，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用3 mL 50%乙腈溶液復(fù)溶，過0.45 μm有機(jī)濾膜，澄清液進(jìn)HPLC分析檢測(cè)。

1.3.2 蘿卜硫素定量測(cè)定

1.3.2.1 HPLC檢測(cè)

參考Liang Hao等[15]的方法并加以改進(jìn)。采用Innoval C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)201 nm，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量20 μL，流速1.0 mL/min。流動(dòng)相為乙腈和水，梯度洗脫：初始流動(dòng)相為10%乙腈溶液，10 min內(nèi)線性變化到60%乙腈溶液，然后在5 min內(nèi)線性變化到100%乙腈，維持2 min。

1.3.2.2 蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

準(zhǔn)確稱取5 mg蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)品于5 mL 50%乙腈溶液中，配成質(zhì)量濃度為1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻后逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度分別為1、5、10、15、20 μg/mL和50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.1節(jié)方法分別進(jìn)行檢測(cè)，得到蘿卜硫素保留時(shí)間與對(duì)應(yīng)的峰面積。以蘿卜硫素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制蘿卜硫素質(zhì)量濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。

1.3.2.3 蘿卜硫素定量計(jì)算

在1.3.1節(jié)條件下，分別測(cè)定蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)品與蘿卜硫素粗提取液，根據(jù)回歸方程計(jì)算粗提取液中蘿卜硫素質(zhì)量濃度，蘿卜硫素提取量按式（1）計(jì)算：

式中：C為蘿卜硫素粗提取液質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為復(fù)溶溶液體積/mL；m為西蘭花副產(chǎn)物粉的質(zhì)量/g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

按照1.3.1節(jié)方法，控制其他條件不變，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。分別設(shè)置蘿卜硫素提取條件為西蘭花副產(chǎn)物干燥溫度（40、50、60、70 ℃和80 ℃）、酶液添加量（5、10、15、20 mL和25 mL）、酶解pH（3.0、4.0、5.0、6.0和7.0）、酶解溫度（25、35、45、55 ℃和65 ℃）、酶解時(shí)間（15、30、45、60、75 min和90 min）、超聲時(shí)間（30、60、90、120 min和150 min）。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化酶解浸提工藝

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取其中對(duì)蘿卜硫素提取量影響較大的3 個(gè)因素pH值、酶解溫度、酶解時(shí)間進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)，以蘿卜硫素提取量為響應(yīng)值。因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表 1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factor and level by Box-Behnken

1.3.5 半制備HPLC純化蘿卜硫素

在最佳提取工藝的條件下，對(duì)蘿卜硫素提取實(shí)驗(yàn)進(jìn)行100 倍放大，收集所有蘿卜硫素粗提取液，過濾后用半制備HPLC分離純化，收集相應(yīng)的蘿卜硫素組分。色譜柱為Innoval C18（21.2 mm×250 mm，10 μm），檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)201 nm，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量1 mL，流速10.0 mL/min，流動(dòng)相為乙腈和水，梯度洗脫：初始流動(dòng)相為5%乙腈，40 min內(nèi)線性變化至65%乙腈，維持5 min，后以5%乙腈維持10 min，對(duì)照蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間對(duì)應(yīng)收集蘿卜硫素洗脫液。以此為單元，富集蘿卜硫素，洗脫液旋蒸至干后得到蘿卜硫素純品。取少量純化物按1.3.2節(jié)方法進(jìn)行檢測(cè)，以1.3.2節(jié)方法定量，按式（2）計(jì)算回收率，以面積歸一化法計(jì)算純化后蘿卜硫素純度。

1.3.6 UPLC-MS鑒定蘿卜硫素

取少量蘿卜硫素純化物用乙腈（含0.1%甲酸）溶解，用UPLC-MS方法對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

UPLC條件：色譜柱：ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流動(dòng)相：A：0.1%甲酸溶液，B：乙腈；流速：0.20 mL/min；洗脫方式：梯度洗脫，0～30 min內(nèi)由5% B線性變化至90% B，維持5 min，然后在10 min內(nèi)B由65%線性變化至5%。

MS條件：參考Ares等[16]方法，并加以改進(jìn)。Orbitrap Q Exactive Focus高分辨質(zhì)譜，電子電離源正離子模式，掃描模式Full MS-dd-MS2，分辨率7 000，掃描范圍m/z 50～500；霧化氣N2，1.5 mL/min；輔助氣N2，8 mL/min；噴霧電壓3.4 kV；毛細(xì)管溫度320 ℃；輔助氣加熱溫度350 ℃；二級(jí)質(zhì)譜碰撞電壓15/30/45 V；分辨率17 500。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Excel 2010與SPSS 19.0對(duì)單因素試驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析（用LSD多重比較進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05，差異顯著），采用Design-Expert V8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理，用Galaxie Chromatography Data System操作半制備HPLC。UPLC-MS中UPLC由Control Panel軟件控制，MS由Tune、Tracefinder 4.1軟件控制，數(shù)據(jù)由Thermo Xcalibur Qual軟件處理，所有圖形均用Origin 9.0軟件繪制，結(jié)構(gòu)式由Chemdraw 16軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘿卜硫素HPLC結(jié)果

圖 1 蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)品（A）與粗提取物（B）、純化物（C）HPLC圖Fig. 1 HPLC chromatograms of sulforaphane standard (A), crude extract (B) and purified sulforaphane (C)

如圖1所示，對(duì)比蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)品與粗提取物兩者的出峰情況，發(fā)現(xiàn)在保留時(shí)間為7.909 min時(shí)均有峰出現(xiàn)，峰形一致且無雜峰干擾，因此判定保留時(shí)間7.90 min為蘿卜硫素峰，并以此時(shí)的峰面積為蘿卜硫素定量。

在相同HPLC條件下，得到蘿卜硫素質(zhì)量濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)線性回歸，得到回歸方程為Y=44 980.333x-45.169，R2=0.996 6，說明回歸方程擬合性好，可作為蘿卜硫素定量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖 2 蘿卜硫素提取單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig. 2 Results of one-factor-at-a-time experiments

由圖2a可知，西蘭花副產(chǎn)物在70 ℃干燥時(shí)，蘿卜硫素提取量顯著高于其他溫度下蘿卜硫素提取量，約為6～7 倍。推測(cè)是70 ℃干燥時(shí)蘿卜硫苷并未熱分解且全部保留，而西蘭花自身的ESP蛋白（一種特異硫蛋白，主要誘導(dǎo)硫代葡萄糖苷水解生成蘿卜硫素腈[17]）和黑芥子酶在70 ℃下完全失活，再次添加外源酶時(shí)才生成蘿卜硫素；當(dāng)溫度低于70 ℃時(shí)，西蘭花中的ESP蛋白和黑芥子酶均未失活，但ESP蛋白促使蘿卜硫苷生成蘿卜硫素腈，從而使蘿卜硫素含量降低。這一推測(cè)與Maheshwari[18]和Pereira[19]等的研究結(jié)果一致，前者發(fā)現(xiàn)蘿卜硫苷在110 ℃以下較穩(wěn)定，當(dāng)溫度高于110 ℃時(shí)會(huì)發(fā)生降解；后者發(fā)現(xiàn)蘿卜硫苷在外源黑芥子酶的作用下，蘿卜硫素是其唯一水解產(chǎn)物[21]。但80 ℃時(shí)蘿卜硫素含量下降，可能與西蘭花內(nèi)部其他因素變化有關(guān)，具體原因有待繼續(xù)探究。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均以70 ℃干燥的西蘭花副產(chǎn)物粉為原料。

由圖2b可知，隨著酶液添加量的增加，蘿卜硫素提取量呈緩慢上升趨勢(shì)。當(dāng)酶液添加量為20 mL時(shí)，蘿卜硫素提取量最高，為（78.36±0.48）μg/g，但由于外源酶價(jià)格昂貴，選擇15 mL為最適外源酶添加量，提取量為（76.91±0.77）μg/g，與前者無顯著差異。另外，以磷酸緩沖液為對(duì)照水解西蘭花粉，得到蘿卜硫素提取量為（4.41±1.09）μg/g，說明實(shí)驗(yàn)中大部分黑芥子酶在70 ℃干燥時(shí)被滅活[20]，蘿卜硫素的生成依賴于外源黑芥子酶。

由圖2c可知，pH 5.0為外源酶的最適pH值，低于或高于其值酶促反應(yīng)速率下降，與黃肖欽等[21]結(jié)果一致。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均以pH 5.0磷酸緩沖液為進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)的零水平。

由圖2d可知，隨著酶解溫度的升高，蘿卜硫素提取量先增加后減少，于35 ℃時(shí)達(dá)到最高，說明35 ℃為芥菜籽黑芥子酶的最適反應(yīng)溫度，這與Mahn等[22]研究結(jié)果一致，此時(shí)的蘿卜硫素提取量為（101.32±8.66）μg/g。隨著溫度繼續(xù)升高，黑芥子酶活性逐漸下降并伴隨蘿卜硫素降解[23]，使蘿卜硫素提取量不斷降低，當(dāng)溫度達(dá)65 ℃時(shí)，蘿卜硫素提取量低于50%的最高提取量。因此，選擇酶解溫度35 ℃為進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)的零水平。

由圖2e可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，蘿卜硫素提取量逐漸增加，并在酶解60 min時(shí)達(dá)到最大，因此，選擇酶解時(shí)間60 min為進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)的零水平。蘿卜硫素提取量在60～90 min內(nèi)降低不明顯，推測(cè)蘿卜硫素因超聲的旋渦作用而分解的量較少，或水解生成的蘿卜硫素量與降解的量相等。

由圖2f可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，蘿卜硫素提取量逐漸增加。但考慮到溶劑提取只是簡(jiǎn)單的溶解過程，超聲時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)大大降低提取效率，增加時(shí)間成本，且超聲時(shí)間超過90 min后，蘿卜硫素的提取量并無明顯增加。因此，選擇超聲時(shí)間90 min為最優(yōu)提取時(shí)間。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 Box-Behnken試驗(yàn)

表 2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

8 1 0 1 147.87±2.01 9 0-1 -1 141.21±0.73 10 0 1 -1 142.88±1.98 11 0 -1 1 146.92±1.08 12 0 1 1 147.34±0.22 13 0 0 0 156.63±0.36 14 0 0 0 156.87±1.38 15 0 0 0 155.59±1.22 16 0 0 0 154.44±0.53 17 0 0 0 153.74±2.22

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表2所示。對(duì)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合分析，得到各因素與蘿卜硫素提取量（Y）的二次多項(xiàng)式模型：Y=155.45+0.57X1+1.10X2+2.32X3+0.26X1X2+0.078X1X3-0.31X2X3-8.78X12-7.27X22-1.59X32。

2.3.2 二次回歸模型方差分析

表 3 蘿卜硫素提取量回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model describing sulforaphane yield

二次回歸分析模型方差分析如表3所示，回歸模型P值小于0.000 1，說明回歸模型具有高度的顯著性，失擬項(xiàng)P值為0.674 9，失擬項(xiàng)不顯著，決定系數(shù)R2為0.987 3和校正決定系數(shù)R2Adj為0.971 0說明回歸模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間擬合性好，可解釋97.10%響應(yīng)值的變化，可用此模型分析酶解條件對(duì)蘿卜硫素提取量的影響。

方差分析中一次項(xiàng)X1和各交互項(xiàng)X1X2、X1X3、X2X3對(duì)響應(yīng)值的影響不顯著，X2和二次項(xiàng)X32影響顯著，X3和X12、X22的影響極顯著，說明各因素對(duì)蘿卜硫素提取量影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。各因素對(duì)蘿卜硫素提取量的影響次序依次為X3（酶解時(shí)間）＞X2（酶解溫度）＞X1（酶解pH值）。

2.3.3 各因素交互作用對(duì)蘿卜硫素提取量的影響

圖 3 各因素交互作用響應(yīng)面及等高線圖Fig. 3 Response surface and contour plots showing the interactive effects of various factors on sulforaphane yield

如圖3所示，在確定某一因素的條件下，改變另一因素條件對(duì)蘿卜硫素提取量的影響，其變化與單因素結(jié)果基本一致；從等高線圖可以看出，各交互作用的等高線圖形接近圓形，說明各因素的交互作用對(duì)蘿卜硫素的提取量影響不顯著。

2.3.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過回歸方程得到蘿卜硫素提取的最佳條件為：酶解pH 5.02、酶解溫度35.47 ℃、酶解時(shí)間67.25 min，理論上可得蘿卜硫素提取量156.33 μg/g。考慮到實(shí)際操作，將最優(yōu)條件調(diào)整為酶解pH 5.0、酶解溫度35 ℃、酶解時(shí)間67 min。經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得蘿卜硫素提取量為（151.39±2.36）μg/g，與預(yù)測(cè)值無顯著差異，證實(shí)擬合的響應(yīng)面模型具有良好的預(yù)測(cè)性，可以用來預(yù)測(cè)蘿卜硫素提取量。

天麻粉亮兒，我起床輕手輕腳收拾了一下，準(zhǔn)備出門了。大梁也爬起來，說要送我。我又到槐生跟前，摸著他的小臉兒，輕聲叫著：“槐生，槐生——娘走了呵……你要聽父的話，等我回哈……”說著說著就掉淚了?；鄙班培拧睉?yīng)著，眼都睜不開，——他會(huì)以為是個(gè)夢(mèng)吧？

2.4 半制備HPLC結(jié)果

圖 4 蘿卜硫素粗提取物（A）與蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)品（B）的半制備HPLC圖譜Fig. 4 Preparative HPLC chromatograms of crude sulforaphane (A)and sulforaphane standard (B)

應(yīng)用半制備HPLC對(duì)蘿卜硫素進(jìn)行分離純化，對(duì)比蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)品，可知保留時(shí)間23～24 min為蘿卜硫素出峰時(shí)間（圖4），收集此時(shí)的洗脫液，得到蘿卜硫素與流動(dòng)相的混合物，蒸干溶劑后得蘿卜硫素純品。將蘿卜硫素提取實(shí)驗(yàn)等比放大100 倍，經(jīng)半制備HPLC富集、純化后，理論收集蘿卜硫素（30.28±0.47）mg，實(shí)際收集28.62 mg，回收率為94.52%，純度為80.74%（圖1）。純度不高的原因可能是復(fù)溶時(shí)有雜質(zhì)污染，或收集組分的時(shí)間較長(zhǎng)使一些雜質(zhì)也一并收集，可通過精確縮短收集時(shí)間來提高產(chǎn)物純度。

2.5 UPLC-MS分析

采用UPLC-MS對(duì)純化物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，得到其二級(jí)質(zhì)譜圖與碎片離子信息（圖5）。參考相關(guān)研究[16,24-26]，對(duì)比蘿卜硫素分子式C6H11NOS2和相對(duì)分子質(zhì)量177.028，可知m/z 178.036為分子離子峰，表示為[M+H]+，其余m/z 119.053、114.038、71.991、55.055為碎片離子峰。由各碎片離子的質(zhì)量推測(cè)蘿卜硫素化學(xué)鍵斷裂特點(diǎn)，繪制蘿卜硫素碎片離子示意圖（圖6），結(jié)果與蘿卜硫素二級(jí)質(zhì)譜圖相吻合，由此可進(jìn)一步確定該純化物為蘿卜硫素。

圖 5 蘿卜硫素二級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 5 Tandem mass spectrum of sulforaphane purified by preparative HPLC

圖 6 蘿卜硫素碎片離子示意圖Fig. 6 Sketch map showing ion fragmentation of sulforaphane

3 討 論

植物中蘿卜硫苷酶解生成蘿卜硫素的過程受多方面條件的影響，因此從植物中提取天然蘿卜硫素重點(diǎn)在于研究其酶解條件[8-10]，還有少部分人直接提取蘿卜硫苷[27-28]。本研究將西蘭花副產(chǎn)物在70 ℃熱風(fēng)干燥后，同時(shí)滅活ESP蛋白與黑芥子酶，阻止了蘿卜硫苷自身酶解造成的損失，保留了大部分蘿卜硫苷，再次添加外源黑芥子酶時(shí)才水解生成蘿卜硫素。此方法為后續(xù)研究天然蘿卜硫素提供新思路，且西蘭花副產(chǎn)物70 ℃干燥后易保存，可隨提隨用，有利于減少資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。

有研究表明蘿卜硫苷酶解生成蘿卜硫素的反應(yīng)不是瞬時(shí)發(fā)生的，而要經(jīng)過一個(gè)漫長(zhǎng)的過程，因此大多數(shù)酶解反應(yīng)的時(shí)間較長(zhǎng)，室溫下長(zhǎng)達(dá)8～12 h[8-9]。本研究采用超聲波輔助酶解代替室溫下靜置酶解，借助超聲波的渦旋和空化作用，使蘿卜硫苷與黑芥子酶的接觸面積和頻率增加，從而縮短酶解時(shí)間，提高提取效率，超聲時(shí)間60 min即可達(dá)到室溫下靜置酶解10 h的蘿卜硫素提取量（數(shù)據(jù)未顯示）。

蘿卜硫素提取后，研究者多采用柱層析、色譜分離或固相萃取等方法將其純化，常用的有硅膠柱層析[29]、凝膠柱層析[11]、大孔吸附樹脂[30]、反相高效制備液相色譜[26]和高速逆流色譜[31]等。但無論是柱層析還是色譜分離，在洗脫雜質(zhì)的同時(shí)也帶走了一部分目標(biāo)物質(zhì)，回收率低，且一般需經(jīng)過多方法，反復(fù)多次操作才能獲得純度較高的產(chǎn)品。本研究利用半制備HPLC純化和富集蘿卜硫素，靈敏度高，分離效果好，雖純度略低但回收率高，且純度可通過優(yōu)化色譜條件和精確蘿卜硫素的收集時(shí)間來提高，相較回收率低更容易改進(jìn)。另外，半制備HPLC用于制備其他天然產(chǎn)物時(shí)可一次實(shí)現(xiàn)多產(chǎn)物分離和收集，具有其他傳統(tǒng)純化方法所沒有的優(yōu)勢(shì)，且操作方便、高效快速，用于工業(yè)生產(chǎn)還可選用工業(yè)型制備色譜，在生物、醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

4 結(jié) 論

本研究以西蘭花副產(chǎn)物為原料，利用外源酶和超聲波輔助酶解提取蘿卜硫素，并通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化酶解浸提工藝，得到蘿卜硫素提取的最佳條件為酶解pH 5.0、酶解溫度35 ℃、酶解時(shí)間67 min。經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得蘿卜硫素提取量為151.39 μg/g，與預(yù)測(cè)值無顯著差異。在最佳條件的基礎(chǔ)上，進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)并應(yīng)用半制備HPLC對(duì)其進(jìn)行純化與富集，得到28.62 mg/200 g（干質(zhì)量）蘿卜硫素，回收率為94.52%，純度為80.74%。對(duì)純化物進(jìn)行UPLC-MS鑒定，其二級(jí)質(zhì)譜圖和碎片離子信息與蘿卜硫素相吻合，進(jìn)一步確定該提取物為蘿卜硫素。本研究從西蘭花副產(chǎn)物中提取蘿卜硫素，有利于增加西蘭花附加值，提高西蘭花利用率，減少資源浪費(fèi)，創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)效益；同時(shí)，研究提供一種原料來源廣、操作簡(jiǎn)便、設(shè)備簡(jiǎn)單的蘿卜硫素提取方法，為西蘭花副產(chǎn)物的綜合利用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。