殼聚糖-六氫-β-酸可食性抑菌膜的制備及抑菌劑的釋放

李 帥，鐘耕輝，陳 婷，劉玉梅*

（新疆大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，煤炭清潔轉(zhuǎn)化與化工過程自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830046）

可食性膜以其取材方便、可食用、易被生物降解、對(duì)環(huán)境無污染等優(yōu)點(diǎn)，成為食品包裝材料的重要研究方向[1]。其中，多糖類可食性膜因其均勻、透明、有適宜的機(jī)械性能等特點(diǎn)日益受到關(guān)注。目前，用于制備多糖類可食性膜的基材主要有淀粉、纖維素、殼聚糖、普魯蘭多糖、海藻酸鈉、魔芋葡甘聚糖、果膠等[2-5]，其中殼聚糖具有生物可降解性、較好的生物相容性、廣譜抑菌性和優(yōu)良的成膜特性而被廣泛使用，但其抑菌活性較弱[6-9]。為彌補(bǔ)以上不足，通常將抑菌劑直接添加到殼聚糖中制備可食性抑菌膜[10-12]。啤酒花軟樹脂成分之一的β-酸具有較強(qiáng)的抑菌作用，其氫化衍生物六氫-β-酸抑菌、防腐活性更強(qiáng)[13]，還具有抗腫瘤、抗氧化等功效[14]，在近年來的研究中逐漸被關(guān)注。

對(duì)于可食性功能膜而言，功能性添加劑是提供包裝膜功能活性的重要組分。前期對(duì)六氫-β-酸的抑菌和抗氧化活性的研究已表明，六氫-β-酸具有較強(qiáng)的抗氧化和抑菌活性，對(duì)大腸桿菌和金黃葡萄球菌的最小抑菌濃度小于20 μg/mL[15-16]。綜合考慮六氫-β-酸的水溶性及抑菌活性的問題，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)比較，確定1 000 μg/mL添加量研究殼聚糖-六氫-β-酸可食性抑菌膜的制備工藝。機(jī)械性能是可食性膜中的重要性能，其中抗拉強(qiáng)度（tensile strength，TS）和斷裂伸長率（elongation at break，EB）是包裝材料非常重要的參數(shù)[17]。TS表示膜抵抗拉伸的能力，以維持膜的結(jié)構(gòu)完整性。EB與膜斷裂時(shí)的拉伸性有關(guān)，使膜具有柔軟性。因此，選擇TS和EB作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化殼聚糖-六氫-β-酸可食性抑菌膜的工藝條件。

本研究以膜的機(jī)械性能為考察指標(biāo)，以六氫-β-酸為抑菌劑，在單因素試驗(yàn)結(jié)合正交試驗(yàn)優(yōu)化甘油體積分?jǐn)?shù)、殼聚糖質(zhì)量濃度及干燥溫度及其交互作用對(duì)制備殼聚糖-六氫-β-酸可食性抑菌膜影響的基礎(chǔ)上，研究抑菌劑六氫-β-酸在55%、75%、95%乙醇溶液中（模擬含有超過20%乙醇溶液的食品體系、油水乳濁液體系、油性食品體系）的釋放；并以Peppas和Peleg方程進(jìn)行擬合，確定抑菌劑的釋放規(guī)律，以期為殼聚糖-六氫-β-酸可食性抑菌膜的開發(fā)應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼聚糖（脫乙酰度＞90%） 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；六氫-β-酸（純度≥95%） 實(shí)驗(yàn)室制備[18]；甘油（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%） 西安化學(xué)試劑廠；乙酸、無水乙醇等均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

DF-II型集熱式磁力加熱攪拌器 金壇市醫(yī)療儀器廠；FAH04N型電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；DPH-420型電熱恒溫培養(yǎng)箱 北京市永光明儀器廠；KQ5200B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；H5KT型靜態(tài)力學(xué)測試儀 英國Tinus Olsen公司；UV-5300PC型紫外-可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 單因素試驗(yàn)

1.3.1.1 甘油體積分?jǐn)?shù)的確定

將1 g殼聚糖溶解于50 mL體積分?jǐn)?shù)2%乙酸溶液中，70 ℃攪拌至完全溶解，得到2 g/100 mL殼聚糖溶液。待冷卻至室溫后，攪拌下分別加入與殼聚糖溶液體積分?jǐn)?shù)為1%、2%、3%、4%甘油，25 ℃攪拌1 h，加入10 mg/mL六氫-β-酸溶液5 mL，25 ℃攪拌1 h后，靜置過夜。超聲脫氣2 h后，取21 g膜液，流延法將膜液鋪在17.5 cm×7.5 cm玻璃板上，40 ℃干燥20 h后，揭膜。以膜的機(jī)械性能為指標(biāo)，確定甘油最佳體積分?jǐn)?shù)。

1.3.1.2 殼聚糖質(zhì)量濃度的確定

分別將0.5、0.75、1、1.25 g殼聚糖溶解于50 mL體積分?jǐn)?shù)2%乙酸溶液中，70 ℃攪拌至完全溶解，得到1、1.5、2、2.5 g/100 mL殼聚糖溶液。待冷卻至室溫后，加入1.3.1.1節(jié)確定最佳體積分?jǐn)?shù)甘油，后續(xù)膜的制備過程和測定方法同1.3.1.1節(jié)，確定殼聚糖最佳質(zhì)量濃度。

1.3.1.3 干燥溫度的確定

在1.3.1.1節(jié)和1.3.1.2節(jié)結(jié)果基礎(chǔ)上按照1.3.1.1節(jié)的步驟鋪膜，分別于30、40、50、60 ℃干燥20 h后，揭膜。以膜的機(jī)械性能為指標(biāo)，確定最佳干燥溫度。

1.3.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以甘油體積分?jǐn)?shù)、殼聚糖質(zhì)量濃度、干燥溫度為影響因素，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以膜TS和EB評(píng)分和為指標(biāo)，對(duì)殼聚糖-六氫-β-酸可食性抑菌膜的制備條件進(jìn)行優(yōu)化，確定膜的最佳工藝。

TS和EB評(píng)分按如下方法計(jì)算：設(shè)正交試驗(yàn)的組數(shù)為n，每組正交試驗(yàn)的測定次數(shù)均為3 次，則TS和EB均有3n 個(gè)數(shù)據(jù)，分別表示為TS11，…，TSn3和EB11，…，EBn3。令min{TS11，…，TSn3}或min{EB11，…，EBn3}=1 分，max{TS11，…，TSn3}或max{EB11，…，EBn3}=10 分，則將TS評(píng)分與對(duì)應(yīng)EB評(píng)分之和作為正交試驗(yàn)的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.3.3 膜的機(jī)械性能測定

分別在制備好的膜中取5 個(gè)點(diǎn)，用游標(biāo)卡尺測定其厚度，取平均值。將膜切成10 cm×2 cm大小的膜片，用靜態(tài)力學(xué)測試儀測定膜的TS和EB。初始夾距為33 mm，拉伸速率為5 mm/min[19-20]。TS和EB的計(jì)算見式（1）、（2）：

式中：F為拉伸時(shí)的最大拉力/N；L為膜的寬度/mm；d為膜的厚度/mm。

式中：L0為膜的初始長度/mm；L1為膜斷裂時(shí)的長度/mm。

1.3.4 釋放實(shí)驗(yàn)

1.3.4.1 六氫-β-酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取105 ℃烘干至恒質(zhì)量的六氫-β-酸10 mg，甲醇溶解并定容至100 mL，得六氫-β-酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取六氫-β-酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，于350 nm波長處測定吸光度。以吸光度A對(duì)六氫-β-酸質(zhì)量濃度C（μg/mL）進(jìn)行擬合，得回歸方程為A=0.052 4C+0.001 4，R2=0.999 1，線性范圍為2～25 μg/mL。

1.3.4.2 六氫-β-酸釋放量的測定

將最佳工藝所制備的膜裁剪為1 cm×2 cm的長條，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入55%、75%、95%乙醇溶液50 mL，分別于25、30、35 ℃釋放一定時(shí)間，取1 mL搖勻后的釋放液測定350 nm波長處的吸光度，以相應(yīng)釋放溶劑為參比，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算六氫-β-酸含量，釋放量按式（3）計(jì)算：

1.3.4.3 釋放模型的建立

采用2 種經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ痛_定釋放實(shí)驗(yàn)的機(jī)制，利用Korsmeyer-Peppas模型的廣義表達(dá)式研究聚合物松弛導(dǎo)致活性成分從聚合物向溶劑中的擴(kuò)散，其方程見式（4）：

式中：MF,t/MF,e為在t時(shí)釋放活性成分的百分比；k為與擴(kuò)散過程有關(guān)的速率常數(shù)；n為擴(kuò)散指數(shù)，表示與釋放機(jī)制相關(guān)的參數(shù)。n≤0.5，說明釋放過程是按照Fick擴(kuò)散或準(zhǔn)Fick擴(kuò)散進(jìn)行；n＞0.5，為非Fick擴(kuò)散，即擴(kuò)散和聚合物松弛的速率相當(dāng)[21-22]。

Peleg模型主要用于根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)預(yù)測釋放動(dòng)力學(xué)，見公式（5）：

式中：MF,t為t時(shí)溶劑中活性成分的含量；k1為與擴(kuò)散過程開始時(shí)質(zhì)量轉(zhuǎn)移率成反比的模型的動(dòng)力學(xué)常數(shù)；k2為與漸近值有關(guān)的模型常數(shù)，主要與平衡值有關(guān)（1/MF,e，其中MF,e為平衡時(shí)釋放活性成分的量）[23-24]。

1.3.4.4 擴(kuò)散系數(shù)

對(duì)于短期釋放（MF,t/MF,e＜0.67）的擴(kuò)散系數(shù)計(jì)算見式（6）[25]：

以MF,t/MF,e對(duì)t0.5進(jìn)行線性擬合，斜率（S）的表達(dá)式見式（7）：根據(jù)所擬合方程的斜率，按式（8）計(jì)算擴(kuò)散系數(shù)Dp：

式中：MF,t/MF,e為在t時(shí)釋放的活性成分的百分比；Dp為擴(kuò)散系數(shù)；Lp為膜厚度，全浸泡釋放實(shí)驗(yàn)中為膜厚度的一半。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 甘油體積分?jǐn)?shù)對(duì)膜機(jī)械性能的影響

圖 1 甘油體積分?jǐn)?shù)對(duì)膜機(jī)械性能的影響Fig. 1 Effect of glycerol concentration on mechanical properties of film

聚合物形成的膜強(qiáng)度大，易脆裂，具有較高的TS和較低的EB，不能用于食品包裝，通常加入增塑劑對(duì)其機(jī)械性能進(jìn)行改善[26]。甘油是可食性膜中最常用的增塑劑，其對(duì)膜機(jī)械性能的影響如圖1所示。甘油對(duì)膜的TS和EB具有顯著影響。隨著甘油體積分?jǐn)?shù)的逐漸增大，膜的TS顯著降低，而EB先增大后基本穩(wěn)定。這主要是甘油分子容易插入到殼聚糖分子鏈中，破壞殼聚糖分子間的氫鍵作用，使其與殼聚糖結(jié)合，增加聚合物分子間的距離，使膜變得柔軟，從而TS降低，而EB增大[27]。綜合考慮，甘油體積分?jǐn)?shù)為2%時(shí)，膜的TS和EB均較優(yōu)。

2.1.2 殼聚糖質(zhì)量濃度對(duì)膜機(jī)械性能的影響

圖 2 殼聚糖質(zhì)量濃度對(duì)膜機(jī)械性能的影響Fig. 2 Effect of chitosan concentration on mechanical properties of film

由圖2可知，隨著殼聚糖質(zhì)量濃度的增大，膜的TS呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，EB呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。這是因?yàn)閱挝惑w積內(nèi)殼聚糖分子的增加，增加氫鍵的數(shù)目，使高分子間的結(jié)合更加緊密，從而使TS增大，EB減小。當(dāng)殼聚糖質(zhì)量濃度從1.5 g/100 mL增大到2 g/100 mL時(shí)，TS和EB的變化均不顯著，因此，殼聚糖質(zhì)量濃度為1.5～2 g/100 mL時(shí)，膜的機(jī)械性能較好。

圖 3 干燥溫度對(duì)膜機(jī)械性能的影響Fig. 3 Effect of drying temperature on mechanical properties of film

2.1.3 干燥溫度對(duì)膜機(jī)械性能的影響由圖3可知，干燥溫度對(duì)膜的TS和EB影響較顯著。隨著干燥溫度的升高，膜的TS顯著增大，EB逐漸降低。當(dāng)干燥溫度從40 ℃升高到50 ℃時(shí)，膜的TS增加幅度比較大；而EB幾乎不變。當(dāng)繼續(xù)升高溫度時(shí)，TS變化平緩，而EB顯著降低。這主要是膜液在干燥過程中受溫度的影響，膜液中并不只是單純的溶劑蒸發(fā)，殼聚糖和甘油之間的氫鍵作用會(huì)隨溫度的變化而相應(yīng)改變。溫度過低時(shí)，分子運(yùn)動(dòng)速度相對(duì)緩慢，溶劑蒸發(fā)慢，使成膜分子間無法有序交聯(lián)形成較規(guī)則的聚集態(tài)結(jié)構(gòu)，且膜中含水分多，表面較黏。溫度過高時(shí)，使溶劑蒸發(fā)速度過快，導(dǎo)致膜表面出現(xiàn)針孔、褶皺厚薄不均等缺陷。另外，溫度過高使殼聚糖與甘油過早地被沉積下來，成膜分子間結(jié)構(gòu)紊亂，從而降低膜的機(jī)械性能[28]。因此，綜合考慮，選擇干燥溫度為40～50 ℃。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

通過單因素試驗(yàn)確定甘油體積分?jǐn)?shù)、殼聚糖質(zhì)量濃度和干燥溫度的水平。以TS和EB的綜合評(píng)分為指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)膜的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，并采用重復(fù)觀測值的方差分析對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。正交試驗(yàn)結(jié)果見表1、方差分析見表2。

表 1 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 Results of L9 (34) orthogonal array design

表 2 L9（34）正交試驗(yàn)的方差分析Table 2 Analysis of variance of L9 (34) orthogonal array design

由表2可看出，甘油體積分?jǐn)?shù)、殼聚糖質(zhì)量濃度、干燥溫度對(duì)膜的機(jī)械性能影響均極顯著。從模型誤差和試驗(yàn)誤差顯著性可看出，兩者存在顯著差異，這主要是未考慮因素間的交互作用導(dǎo)致的。為進(jìn)一步優(yōu)化膜的制備工藝，除甘油體積分?jǐn)?shù)、殼聚糖質(zhì)量濃度、干燥溫度3 個(gè)影響因素外，還考慮三者間的交互作用，且從表1篩選2 個(gè)較優(yōu)水平，進(jìn)行L8（27）正交試驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表 3 L8（27）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Results of L8 (27) orthogonal array design

K1 122.2 101.2 111.0 100.5 121.8 109.9 113.5 K2 97.7 118.7 109.0 119.5 98.2 110.1 106.4T=220.0 R 24.5 17.5 2.0 19.0 23.6 0.2 7.1

從表3可以看出，A1B2C2組合，即殼聚糖質(zhì)量濃度1.75 g/100 mL、干燥溫度40 ℃、甘油體積分?jǐn)?shù)1.4%時(shí)，膜的機(jī)械性能最佳。從極差可知，影響因素的大小為A＞AC＞C＞B＞AB＞BC。各因素及交互作用的方差分析見表4。

表 4 L8（27）正交試驗(yàn)方差分析Table 4 Analysis of variance of L8 (27) orthogonal array design

從表4可看出，模型誤差與試驗(yàn)誤差不存在顯著差異，說明優(yōu)化模型正確。影響膜機(jī)械性能的因素大小順序?yàn)锳＞AC＞C＞B，而AB和BC對(duì)其無影響。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 六氫-β-酸在食品模擬物中的釋放結(jié)果

可食性膜中抑菌劑的釋放速率是影響食品貨架期的重要因素，太快使得其抑菌有效期縮短，太慢則達(dá)不到明顯的抑菌效果，因此，需要其具有合適的釋放速率，即抑菌劑的釋放速率略大于有害菌的臨界生長速率[29]。結(jié)合數(shù)學(xué)模型確定抑菌劑的釋放規(guī)律，對(duì)于評(píng)估抑菌劑在食品中的濃度，確定抑菌劑保持在關(guān)鍵抑制濃度的時(shí)間起著重要的作用。

圖 4 六氫-β-酸在乙醇溶液中的釋放曲線Fig. 4 Release curves of hexahydro-β-acids in ethanol aqueous solutions

從圖4可知，六氫-β-酸在95%乙醇溶液中釋放緩慢，而在75%和55%乙醇溶液的釋放較快。這與于文喜[30]關(guān)于山梨酸鉀從低甲氧基果膠/羧甲基纖維素膜中釋放到95%和55%乙醇溶液的研究結(jié)果一致。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因主要是乙醇含量減小，殼聚糖-六氫-β-酸膜更容易溶脹，導(dǎo)致高分子網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而增大六氫-β-酸的釋放量。在各釋放體系中，隨著溫度的升高，釋放量總體呈逐漸增大的趨勢。另外，溫度越高，分子運(yùn)動(dòng)加劇而使溶出速率增大，使六氫-β-酸的釋放也越快，到達(dá)平衡的時(shí)間縮短。這一結(jié)果也出現(xiàn)在白藜蘆醇[31]和叔丁基對(duì)苯二酚[32]從聚乳酸膜向乙醇中的遷移研究。

2.5 釋放模型的建立結(jié)果

分別以Peppas模型和Peleg模型對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)算其對(duì)應(yīng)的參數(shù)，結(jié)果如表5所示。

表 5 Peppas和Peleg模型的相關(guān)參數(shù)Table 5 Parameters of Peppas and Peleg models

按照正交試驗(yàn)篩選出的膜的最佳制備條件：殼聚糖質(zhì)量濃度1.75 g/100 mL、干燥溫度40 ℃、甘油體積分?jǐn)?shù)1.4%，進(jìn)行3 次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果可得TS分別為29.70、29.01、29.07 MPa，EB分別為83.45%、80.08%、80.33%。TS和EB的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.31%、1.91%。3 次驗(yàn)證的結(jié)果與表3正交試驗(yàn)的第4組的結(jié)果（TS為28.50 MPa，EB為81.22%）無顯著差異，且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，說明該工藝具有可重復(fù)性。

75%乙醇溶液25 0.583 8 5.502 0 0.999 7 2.818 2 0.060 1 16.64 0.999 7 30 0.612 8 6.570 2 0.999 9 1.830 7 0.060 7 16.49 0.999 3 35 0.564 2 9.705 4 0.999 4 1.708 2 0.057 5 17.38 0.999 5 55%乙醇溶液25 0.592 8 7.587 4 0.997 5 0.734 0 0.060 0 16.67 0.999 9 30 0.621 5 10.793 3 0.999 2 0.165 2 0.060 0 16.68 0.999 9 35 0.756 4 4.192 9 0.999 5 0.186 9 0.057 5 17.40 0.999 9

根據(jù)Peppas模型對(duì)六氫-β-酸在95%、75%和55%乙醇溶液的釋放進(jìn)行擬合，R2均在0.995以上，說明具有較好的擬合度。從n值可知，六氫-β-酸在95%乙醇溶液中釋放的n值均小于0.5，說明其擴(kuò)散機(jī)制為準(zhǔn)Fick擴(kuò)散，而在75%和55%乙醇溶液n值均大于0.5，為非Fick擴(kuò)散。為進(jìn)一步研究六氫-β-酸在75%和55%乙醇溶液的釋放機(jī)制，采用Peleg模型對(duì)其進(jìn)行擬合，發(fā)現(xiàn)R2均大于0.995，且其計(jì)算的最大釋放量與實(shí)驗(yàn)中的最大釋放量無明顯差異（t＜t臨界值），說明Peleg模型能夠較好地預(yù)測六氫-β-酸在75%和55%乙醇溶液中的釋放動(dòng)力學(xué)。

2.6 溫度對(duì)擴(kuò)散系數(shù)的影響

圖 5 溫度對(duì)六氫-β-酸在乙醇水溶液中擴(kuò)散系數(shù)的影響Fig. 5 Effect of temperature on the diffusion coefficient of hexahydroβ-acids in ethanol aqueous solutions

擴(kuò)散系數(shù)是衡量活性成分釋放快慢的物理量。從圖5可看出，隨著溫度的升高，擴(kuò)散系數(shù)總體呈逐漸上升的趨勢，加之膜的溶脹性，擴(kuò)散系數(shù)在55%乙醇溶液中變化最為明顯。這主要是由于聚合物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)松弛后，升高溫度，分子熱運(yùn)動(dòng)加劇，自由體積變大，擴(kuò)散系數(shù)也越大[33]。因此，釋放溶劑中的含水量和溫度是影響六氫-β-酸擴(kuò)散的重要因素。

3 結(jié) 論

以機(jī)械性能為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)結(jié)合正交試驗(yàn)優(yōu)化殼聚糖-六氫-β-酸可食性抑菌膜的制備工藝，其最佳制備條件為：殼聚糖質(zhì)量濃度1.75 g/100 mL、干燥溫度40 ℃、甘油體積分?jǐn)?shù)1.4%，此工藝條件下膜TS為29.26 MPa，EB為81.29%，影響因素依次為殼聚糖質(zhì)量濃度＞殼聚糖質(zhì)量濃度與甘油體積分?jǐn)?shù)交互作用＞甘油體積分?jǐn)?shù)＞干燥溫度。以六氫-β-酸的釋放量為指標(biāo)，研究六氫-β-酸在95%、75%和55%乙醇溶液的釋放。通過Peppas和Peleg方程可知，六氫-β-酸在95%乙醇溶液中的釋放過程為Fick擴(kuò)散，而75%和55%乙醇溶液中符合Peleg方程；對(duì)擴(kuò)散系數(shù)的分析表明釋放溶劑中含水量和溫度是影響六氫-β-酸擴(kuò)散的重要因素。本研究建立殼聚糖-六氫-β-酸可食性抑菌膜的制備工藝及釋放模型，為該抑菌膜的開發(fā)應(yīng)用提供理論支持。