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      2 種蛋白酶酶解曲拉干酪素條件優(yōu)化及抗氧化性比較

      2019-05-21 11:59:34劉倩霞何興芬楊富民趙保堂
      食品科學 2019年8期
      關鍵詞:解液螯合堿性

      劉倩霞,劉 東,張 俊,王 嬌,何興芬,楊富民*,趙保堂*

      (甘肅農業(yè)大學食品科學與工程學院,甘肅 蘭州 730070)

      牦牛乳與其他牛乳相比,其營養(yǎng)成分如蛋白質、脂肪、乳糖等含量較高[1]。曲拉是牧民將牦牛乳采用簡單方法脫脂后,在自然條件下微生物發(fā)酵產酸[2],使酪蛋白凝固、結塊、風干后的產品,亦稱為粗奶酪[3]。曲拉除當作食物外,主要用于干酪素和酪朊酸鹽等的生產[4]。曲拉干酪素產品通常作為一種天然的食品添加劑和營養(yǎng)改良劑應用于食品和醫(yī)藥行業(yè)[5],在精細化工行業(yè)也有廣泛應用,如化妝品、合成染料以及香料香精等,也可作為接觸劑、組織改良劑、增光劑等[6]。隨著曲拉干酪素用途的擴展,對于某些特定品質和功能,如抗氧化性等的要求也不斷提高。研究表明,選擇適當?shù)牡鞍酌杆舛嚯?,可制備多種生物活性肽,提高產品的附加值[7]。蛋白質水解產物的抗氧化活性取決于蛋白酶的種類和水解條件,由于酶的特異性,將產生不同的小肽和游離氨基酸。游離氨基酸和肽段的大小、水平和組成的變化影響抗氧化性。大豆蛋白、乳清蛋白、小麥蛋白等不同來源的蛋白水解物具有良好的抗氧化能力[8-10],但有關牦牛曲拉酶解產物抗氧化性的研究報道較少。為探討甘南夏河藏區(qū)曲拉酶解產物的抗氧化性,以堿性蛋白酶和胰蛋白酶作為水解酶,以水解度為指標,采用響應面法優(yōu)化2 種蛋白酶酶解曲拉干酪素的條件,通過測定酶解產物超氧陰離子自由基、羥自由基清除率等抗氧化性指標比較2 種酶酶解曲拉干酪素溶液的抗氧化能力。本研究旨在明確堿性蛋白酶和胰蛋白酶曲拉干酪素酶解液抗氧化性的差異,為曲拉干酪素酶解工藝以及產物的進一步利用提供依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      曲拉產自甘肅甘南夏河縣,曲拉干酪素(蛋白質質量分數(shù)≥90.0%) 甘肅華安生物科技集團;2-氨基-2-(羥甲基)-1,3-丙二醇(2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol,TRIS)、堿性蛋白酶(200 000 U/g)、胰蛋白酶(250 U/mg) 日本Solarbio公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)美國Sigma公司;ferrozine 北京中生瑞泰科技有限公司;其他試劑均為國產分析純。

      1.2 儀器與設備

      UV759(PC)紫外-可見分光光度計 上海悅豐儀器儀表有限公司;HH-4A恒溫攪拌水浴鍋 常州金壇精達儀器制造有限公司;PHS-3C pH計、精密天平 上海精密科學儀器有限公司;GT10-1型高速臺式離心機 北京時代北利離心機有限公司。

      1.3 方法

      1.3.1 曲拉干酪素酶解

      燒杯中加入蒸餾水,預熱到適宜溫度,取定量的曲拉干酪素加入蒸餾水中,適量NaOH(1 mol/L)溶液助溶,使曲拉干酪素溶解完全,調節(jié)溶液pH值到設定值,加入酶,酶解一定時間(反應過程中保持pH值恒定),反應結束后,沸水浴20 min滅酶活性,冷卻至常溫后,離心取上清液(4 000 r/min,20 min),冷凍干燥,每個實驗重復3 次。

      1.3.2 酶解單因素試驗

      參照鄭志強[10]、張根生[11]等方法略作修改,堿性蛋白酶在酶解溫度50 ℃、曲拉干酪素質量濃度60 g/L、pH 8.5、酶添加量140 U/g、酶解時間3.5 h的條件下;胰蛋白酶在酶解溫度45 ℃、曲拉干酪素質量濃度35 g/L、pH 7.5、酶添加量3 000 U/g、酶解時間2.5 h的條件下,保持其他條件不變,改變其中一個因素,以水解度為指標,進行單因素試驗。因素設置:堿性蛋白酶:酶解溫度分別為40、45、50、55、60 ℃;曲拉干酪素質量濃度分別為30、40、50、60、70 g/L;pH 7.5、8.0、8.5、9.0、9.5;酶添加量分別為80、100、120、140、160 U/g。胰蛋白酶:酶解溫度分別為35、40、45、50、55 ℃;曲拉干酪素質量濃度分別為25、30、35、40、45 g/L;pH 6.5、7.0、7.5、8.0、8.5;酶添加量分別為1 500、2 000、2 500、3 000、3 500 U/g。堿性蛋白酶和胰蛋白酶酶解時間均設置為0~5.0 h,每0.5 h取樣。

      1.3.3 響應面試驗

      依據(jù)單因素試驗結果,選取酶解時間(X1)、酶解溫度(X2)、酶添加量(X3)和pH值(X4)為影響因素,以水解度作為響應值,采用4因素3水平分析方法,設計見表1。

      表 1 Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors with actual and coded levels used in Box-Behnken design

      1.3.4 水解度測定

      水解度測定參照文獻[11]方法。

      1.3.5 抗氧化性的測定

      1.3.5.1 超氧陰離子自由基清除能力的測定

      參考Li Xican[12]方法:吸取2.0 mL樣品于試管中與2 950 μL Tris-HCl(pH 7.4)溶液和50 μL 5 mmol/L聯(lián)苯三酚混合,快速振蕩,在325 nm波長處測定30 s時的吸光度A1,300 s時為A2,計算見公式(1):

      式中:ΔAs=A2-A1;ΔAb為空白組吸光度,雙蒸水取代樣品。

      1.3.5.2 羥自由基清除率的測定

      參考Zhang Yufeng等[13]方法:吸取1.0 mL樣品于試管中,依次向試管內加入1.0 mL 1.865 mmol/L鄰二氮菲-乙醇溶液,2.0 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4),1.0 mL 1.865 mmol/L FeSO4·7H2O和1.0 mL 0.03% H2O2溶液,振蕩均勻,恒溫水浴(37 ℃)反應60 min,冷卻至室溫,4 000 r/min離心10 min,532 nm波長處測定吸光度As,計算見公式(2):

      式中:Ab為空白組吸光度,雙蒸水取代樣品;An為損傷組吸光度,雙蒸水代替H2O2溶液。

      1.3.5.3 DPPH自由基清除率的測定

      參考Tai等[14]方法略作調整:將2 mL樣品與2 mL 0.1 mmol/L DPPH-95%乙醇溶液混合,暗處反應30 min,3 000 g/min離心15 min,517 nm波長處測定吸光度,計算見公式(3):

      式中:As為2 mL樣品與DPPH溶液吸光度;Ac為2 mL樣品與2 mL 95%乙醇溶液吸光度;Ab為2 mL樣品與DPPH-95%乙醇溶液吸光度。

      1.3.5.4 還原力的測定

      參考Gu Fenglin等[15]方法。將1 mL樣品與2.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.6)與2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液混勻,50 ℃水浴反應20 min,加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液,3 000 r/min離心10 min,取2.5 mL上清液,依次加入2.5 mL雙蒸水、0.5 mL 0.1% FeCl3溶液,室溫放置10 min,于700 nm波長處測定吸光度。

      1.3.5.5 Fe2+螯合能力的測定

      參考Carrasco-Castilla等[16]方法。將1 mL樣品與0.1 mL 2 mmol/L FeCl2溶液和3.7 mL雙蒸水預混合,加入0.2 mL 5 mmol/L ferrozine溶液,3 000 g/min離心5 min,離心后混合物在室溫下放置20 min于562 nm波長處測定吸光度,計算見公式(4):

      式中:As為樣品吸光度;Ac為對照組吸光度,雙蒸水取代樣品。

      1.3.5.6 Cu2+螯合能力的測定

      參照Zhu Lijuan等[17]方法,在1 mL樣品中依次加入1 mL 2 mmol/L CuSO4溶液、1 mL中性吡啶溶液、20 μL 0.1%鄰苯二酚紫溶液迅速混勻,室溫放置5 min,于632 nm波長處測定吸光度,計算見公式(5):

      式中:As為樣品組吸光度;Ab為對照組吸光度,雙蒸水取代樣品。

      1.4 統(tǒng)計分析

      數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0軟件進行方差分析和多重比較。

      2 結果與分析

      2.1 單因素試驗結果

      圖 1 酶解單因素試驗結果Fig. 1 Results of one-factor-at-a-time experiments

      由圖1A1、B1可知,隨著酶解時間的延長,堿性蛋白酶在0~3.5 h、胰蛋白酶在0~2.5 h內,水解度均呈上升。堿性蛋白酶在3.5 h達到最大,水解度為24.97%,胰蛋白酶則在2.5 h達到最大,水解度為12.29%。之后隨著時間延長,2 種酶的水解度均稍有下降,但變化均不明顯(P>0.05)。其原因可能是因為在酶解初期,由于酶切位點較多,導致水解度上升趨勢明顯,而隨著酶解時間不斷延長,暴露的酶切位點相對較少,使反應速率逐漸下降,反應趨勢減弱。

      由圖1A2、B2可知,堿性蛋白酶和胰蛋白酶分別在酶解溫度50、45 ℃以下時,隨著酶解溫度的升高,水解度均不斷增大。在50、45 ℃時分別達到最大,水解度分別為25.15%、13.72%,之后隨著溫度的逐漸升高,水解度略有下降,這是由于溫度升高導致酶失活的結果。

      由圖1A3、B3可知,隨著曲拉干酪素質量濃度的增加,水解度整體呈先增大后減小趨勢,堿性蛋白酶在曲拉干酪素質量濃度60 g/L達到最大,水解度為25.65%,胰蛋白酶在曲拉干酪素質量濃度35 g/L時達到最大,為12.65%。底物質量濃度在一定范圍內,反應體系的溶質含量少,酶與底物反應完全,水解度呈增大趨勢,隨著底物質量濃度逐漸增加,酶與底物結合飽和,同時由于反應體系的流動性變差,使反應速率降低,水解度稍有下降。

      由圖1A4、B4可知,在一定的pH值范圍內,水解度呈增加趨勢,堿性蛋白酶在8.5時達到最大,為25.15%,胰蛋白酶在7.5時達到最大,為14.05%,但隨著pH值的不斷增加,水解度均有所下降,pH值影響酶與蛋白質之間的解離狀態(tài),要使水解度呈最大值,必須是反應體系處于適宜的酸堿環(huán)境,不適宜將會導致酶的空間結構改變,使部分酶活性降低。

      由圖1A5、B5可知,隨著酶添加量的增加,水解度呈上升趨勢,堿性蛋白酶在酶添加量140 U/g時,水解度最大,為25.65%;胰蛋白酶在酶添加量3 000 U/g時,水解度達到最大,為13.28%。之后隨酶添加量增大,水解度均稍有下降。適宜的酶添加量可與底物充分結合、反應完全,當酶添加超量時,超量部分酶無法與底物結合,水解度則基本無明顯變化。

      2.2 響應面試驗結果

      2.2.1 堿性蛋白酶

      表 2 堿性蛋白酶響應面試驗設計及結果Table 2 Response surface design with results for optimization of alkaline protease hydrolysis

      表 3 堿性蛋白酶二次回歸方程模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the quadratic regression model for alkaline protease hydrolysis

      注:**. P<0.01,差異極顯著;*. P<0.05,差異顯著。下同。

      利用Design-Expert 8.0設計軟件,采用Box-Behnken試驗設計方案,結果見表2。以酶解溫度、酶解時間、酶添加量、pH值對酶解工藝參數(shù)進行優(yōu)化,獲得二次回歸方程為:

      水解度=25.85+0.23X1+0.036X2-0.015X3+0.31X4-0.41X1X2-0.30X1X3+0.23X1X4-0.22X2X3+1.02X2X4+0.42XX-2.48X2-2.51X2-2.80X2-2.59X2341234

      由表3可知,試驗所選用的回歸模型極顯著(P<0.000 1),失擬項P值為0.377 6,不顯著;模型R2Adj為0.921 7,R2=0.960 9,說明該模型與實際相切合,建立較合理,試驗誤差小,信噪比15.036大于4。

      圖 2 堿性蛋白酶水解度的響應面圖Fig. 2 Response surface plots for alkaline protease hydrolysis

      由圖2可以看出,pH值變化對水解度的影響顯著,酶解溫度和酶添加量的影響不顯著。酶解溫度與pH值之間的交互作用極顯著(P<0.01),其他因素之間存在一定交互作用,F(xiàn)值越大影響越顯著,響應面的梯度曲線曲面彎曲程度大,表示影響越顯著[18]。各因素對水解度的影響順序為X3<X2<X1<X4,與回歸結果分析相一致。

      綜合單因素及響應面試驗結果,堿性蛋白酶酶解曲拉干酪素的優(yōu)化工藝參數(shù)為酶解時間3.84 h、酶解溫度49.84 ℃、酶添加量139.37 U/g、pH 8.54,預測值為24.88%,按最優(yōu)條件為堿性蛋白酶酶解時間3.8 h、酶解溫度49.8 ℃、曲拉干酪素質量濃度60 g/L、pH 8.5、酶添加量140 U/g,驗證實驗(n=3)得水解度為24.25%。

      2.2.2 胰蛋白酶

      表 4 胰蛋白酶響應面試驗設計及結果Table 4 Response surface design with results for trypsin hydrolysis

      25 0 0 0 0 13.72 26 0 0 0 0 13.77 27 0 0 0 0 13.96 28 0 0 0 0 13.92 29 0 0 0 0 13.28

      胰蛋白酶響應面設計及結果見表4,胰蛋白酶酶解工藝二次回歸方程為:水解度=13.73-0.24X1-0.32X2-0.058X3+0.062X4-0.46X1X2-1.13X1X3+0.85X1X4+0.10X2X3+0.13X2X4+0.26X3X4-1.68X12-0.43X22-0.38X32-0.52X42。

      表 5 胰蛋白酶二次回歸方程模型方差分析Table 5 Analysis of variance for the quadratic regression model for trypsin hydrolysis

      表5表明,試驗所選用的模型極顯著(P<0.000 1),失擬項P值為0.644 7,不顯著;模型R2Adj為0.942 4,R2=0.971 2,說明該模型試驗誤差小,擬合程度較好,信噪比19.289大于4。

      圖 3 胰蛋白酶水解度的響應面圖Fig. 3 Response surface plots for trypsin hydrolysis

      由圖3可見,交互項(X1X2、X1X3、X1X4)對水解度影響極顯著(P<0.01),交互項(X2X3、X2X4、X3X4)影響均不顯著(P>0.05),二次項(X22、X32、X42)對水解度的影響極顯著(P<0.01),各因素對水解度的影響順序為X3<X4<X1<X2。

      綜合以上單因素及響應面試驗結果,胰蛋白酶優(yōu)化工藝參數(shù)為酶解時間2.53 h、酶解溫度47.79 ℃、酶添加量2 882.00 U/g、pH 7.50,水解度預測值為13.80%,按最優(yōu)條件為胰蛋白酶酶解時間2.5 h、酶解溫度47.8 ℃、曲拉干酪素質量濃度35 g/L、pH 7.5、酶添加量2 900 U/g,驗證實驗(n=3)得水解度為13.57%,實驗值與預測值基本切合。

      2.3 2 種蛋白酶酶解液抗氧化性

      2.3.1 超氧陰離子自由基清除能力

      圖 4 酶解液質量濃度對超氧陰離子自由基清除能力的影響Fig. 4 Superoxide anion radical activity of different concentrations of hydrolysates

      酶解液對超氧陰離子自由基的清除屬濃度依賴型,由圖4可知,隨著酶解液質量濃度的增大,酶解液的清除能力呈上升趨勢。其中,酶解后胰蛋白酶的清除能力顯著(P<0.01),胰蛋白酶超氧陰離子自由基清除率從74.05%上升到82.07%,增大8.02%(P<0.05),堿性蛋白酶組從67.31%上升到77.27%,增大9.96%(P<0.01),曲拉干酪素溶解液(對照)增加不明顯(P>0.05)。歧化和其他類型的反應可產生H2O2和羥自由基[20-21],使清除能力增強,2 種酶均能夠顯著提高水解度,產生的小分子質量肽段增多[22]。鄭志強[10]和Raghavan[19]等報道,水解度越大,酶解液的抗氧化性越強,研究與Yu Jie等[23]報道的螺旋藻酶解液清除超氧陰離子自由基的趨勢相一致。

      圖 5 酶解液質量濃度對羥自由基清除能力的影響Fig. 5 Hydroxyl radical scavenging activity of different concentrations of hydrolysates

      2.3.2 羥自由基清除能力由圖5可知,隨著酶解液質量濃度的增大,酶解液的羥自由基清除能力呈現(xiàn)上升趨勢,但2 種蛋白酶無顯著性差異(P>0.05)。羥自由基可以與細胞中幾乎所有的物質發(fā)生反應,從而誘導產生對細胞的嚴重破壞[24-25],本實驗結果與Zhang Yufeng等[25]報道的堿性蛋白酶酶解鷹嘴豆羥自由基清除效果不一致,其原因可能是曲拉與鷹嘴豆蛋白結構不同、酶解條件等不同所造成的。

      2.3.3 DPPH自由基清除能力

      圖 6 酶解液質量濃度對DPPH自由基清除能力的影響Fig. 6 DPPH radical scavenging activity of different concentrations of hydrolysates

      隨著酶解液質量濃度的增大,酶解液DPPH自由基清除能力均呈上升趨勢。由圖6可見,5.0 mg/mL堿性蛋白酶解液DPPH自由基清除率較1.0 mg/mL提高18.32%,顯著高于胰蛋白酶(P<0.01)。胰蛋白酶組結果增長緩慢,趨勢平緩,清除能力不到30%,2 種蛋白酶之間差異顯著(P<0.01)。堿性蛋白酶較胰蛋白酶清除效果更佳,可能是因為堿性蛋白酶主要酶解疏水性的氨基酸,電子供體存在于酶解液中,自由基與之反應結合為穩(wěn)定產物[27]。DPPH自由基可與供給質子抗氧化劑等反應清除自由基,降低吸光度[28],溶液顏色從深紫色逐漸變?yōu)辄S色,通過接受電子或氫自由基形成非磁性分子[29]。結果與Ghribi等[26]報道的鷹嘴豆堿性蛋白酶酶解物DPPH自由基清除率相一致,與鄭志強等[10]的報道存在差異,需進一步研究。

      2.3.4 還原力

      圖 7 酶解液質量濃度對還原力的影響Fig. 7 Reducing power of different concentrations of hydrolysates

      由圖7可知,酶解液還原力隨著酶解液質量濃度的增加而增大,堿性蛋白酶在1.0 mg/mL時為0.46,5.0 mg/mL達到0.64,增大26%(P<0.01);胰蛋白酶從1.0 mg/mL時的0.11增大到5.0 mg/mL的0.29,增大62%(P<0.01),相比于曲拉干酪素溶解液和胰蛋白酶,堿性蛋白酶組的增加顯著(P<0.05),但增加趨勢胰蛋白酶明顯優(yōu)于堿性蛋白酶(P<0.01)。還原力測定通常用于評估天然抗氧化劑提供電子或氫的能力[30],一種樣品具有更高還原能力則具有更好的供電子能力,吸光度越高,還原力越大[31]。酶解能夠提高酶解液的還原力,原因是酶解液可以作為電子供體發(fā)揮作用,釋放出來的還原劑能夠快速與鐵氰化鉀形成絡合物,使Fe3+還原成Fe2+。結果與于麗娜等[32]關于酶解花生的報道相一致。

      2.3.5 Fe2+螯合能力

      圖 8 酶解液質量濃度對Fe2+螯合能力的影響Fig. 8 Fe2+ Chelating ability of different concentrations of hydrolysates

      由圖8可知,酶解液對Fe2+的螯合能力隨著酶解液質量濃度增加而增加。對于堿性蛋白酶,當酶解液質量濃度從1.0 mg/mL增加到5.0 mg/mL時,螯合能力從20.93%增加到59.32%(P<0.01),胰蛋白酶則從50.25%增加到78.60%(P<0.01),本實驗與Carrasco-Castilla等[16]報道的胰蛋白酶酶解菜豆具有良好的Fe2+螯合能力相一致。過渡金屬離子通過作為單電子供體形成烷氧基自由基而與過氧化物反應速度非??靃33],在體內發(fā)生多種氧化反應,F(xiàn)e2+可催化Haber-Weiss反應,即Fe2+和過氧化氫同時存在情況下,轉化為羥自由基,與鄰近的生物分子快速反應并引起嚴重的損害[34]。胰蛋白酶屬特殊多酶體系,可水解產生帶有羧端的氨基酸,蛋白質的游離羧端是金屬離子的潛在結合位點,酶解物作為金屬螯合化合物是有效的[35],胰蛋白酶的螯合效果優(yōu)于堿性蛋白酶。

      2.3.6 Cu2+螯合能力

      圖 9 酶解液質量濃度對Cu2+螯合能力的影響Fig. 9 Cu2+ Chelating ability of different concentrations of hydrolysates

      由圖9可知,隨著酶解液質量濃度的增加,Cu2+螯合能力逐漸增大,堿性蛋白酶組從44.52%增大到59.65%,增大15.13%(P<0.05),胰蛋白酶組從45.67%增大到57.18%,增加11.51%(P<0.05),與曲拉干酪素溶解液相比均顯著增大(P<0.01),但2 種蛋白酶之間差異不顯著(P>0.05)。由于特定的肽結構和氨基酸側鏈基團不僅在終止自由基鏈反應而且在螯合過渡金屬離子中起重要作用[36]。酶解后,酶解物Cu2+螯合能力增加。酶的性質不同則酶切位點不同,形成的分子質量大小不同,形成的氨基酸肽鏈組成不同,與金屬離子的配位鍵則存在差異,將導致酶解液金屬離子螯合能力不同[37]。此外,酶解液Cu2+螯合能力取決于Cu2+配位點多少、分子質量大小以及肽段結構等[38-39]。

      3 結 論

      采用堿性蛋白酶和胰蛋白酶對曲拉干酪素進行酶解,通過單因素和響應面試驗優(yōu)化,分別在酶解時間3.8、2.5 h、酶解溫度49.8、47.8 ℃、曲拉干酪素質量濃度60、35 g/L,pH 8.5、7.5,酶添加量140、2 900 U/g時水解度較高。

      曲拉干酪素堿性蛋白酶和胰蛋白酶2 種酶解液,均表現(xiàn)出良好的抗氧化性和電子或氫供體能力。通過對抗氧化性的比較,清除羥自由基、DPPH自由基能力和還原力的效果堿性蛋白酶相對較好,超氧陰離子自由基清除效果則胰蛋白酶解液優(yōu)于堿性蛋白酶解液。金屬螯合能力方面,堿性蛋白酶解液Cu2+螯合能力優(yōu)于胰蛋白酶解液,而Fe2+螯合能力則相反。堿性蛋白酶酶解曲拉干酪素的水解度明顯優(yōu)于胰蛋白酶,更適宜用于曲拉干酪素的酶解。隨著對曲拉干酪素抗氧化肽活性功能研究的深入,需要對不同分子質量肽段進行分離、純化、鑒定,明確其肽序列,深入研究肽的結構和特定的抗氧化機制及動物體抗氧化性效果等。

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