耐熱克魯維酵母和粟酒裂殖酵母順序接種發(fā)酵對美樂干紅葡萄酒品質(zhì)的影響

王玉華，盛文軍，李 敏，米 蘭，蔣玉梅，王 婧*

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省葡萄與葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，甘肅 蘭州 730070）

近幾年，中國已經(jīng)成為葡萄酒的消費(fèi)大國，但對于進(jìn)口葡萄酒的過度依賴，使我國本土葡萄酒產(chǎn)品面臨嚴(yán)峻的市場競爭[1]。目前，與國外優(yōu)質(zhì)干紅葡萄酒相比，我國葡萄酒同質(zhì)化嚴(yán)重，各產(chǎn)區(qū)、各企業(yè)產(chǎn)品的質(zhì)量層次均一，特點(diǎn)、個(gè)性不突出，無法滿足現(xiàn)在消費(fèi)者對多元化和多樣化的需求[2]。西部作為我國優(yōu)質(zhì)葡萄酒產(chǎn)區(qū)，其干紅葡萄酒在品質(zhì)上依然存在色度較淺、顏色穩(wěn)定性不佳、產(chǎn)地特征不明顯等諸多問題[3]，因此不斷提升我國葡萄酒品質(zhì)是葡萄酒產(chǎn)業(yè)目前亟待解決的問題。

葡萄汁發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的生物化學(xué)過程，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在乙醇發(fā)酵中起著決定性作用。然而，近幾年研究發(fā)現(xiàn)，一些非釀酒酵母（non-Saccharomyces）對葡萄酒香氣的復(fù)雜性和風(fēng)格的獨(dú)特性方面具有積極影響[4-5]。因此利用優(yōu)選的非釀酒酵母進(jìn)行多菌種協(xié)同發(fā)酵，揭示其對干紅葡萄酒品質(zhì)的影響，對解決葡萄酒產(chǎn)品缺陷和品質(zhì)提升具有十分重要的意義。

粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomce spombe）是一株裂殖屬的非釀酒酵母，具有較高的乙醇發(fā)酵能力和蘋果酸轉(zhuǎn)化能力[5]，其作為非釀酒酵母已經(jīng)被成功用于朗姆酒和棕櫚酒的發(fā)酵生產(chǎn)[6]；國際葡萄與葡萄酒組織已允許其作為生物降酸劑在葡萄酒中使用；已有研究表明[7]，S. pombe可代謝產(chǎn)生含量較高的吡喃型花色苷、甘油和一些特征性香氣物質(zhì)，因此在葡萄酒發(fā)酵方面具有糾正顏色參數(shù)、提高香氣復(fù)雜性等應(yīng)用潛力。耐熱克魯維酵母（Lachancea thermotolerans）是一株能夠代謝產(chǎn)生乳酸的非釀酒酵母，具有增加酒體酸度、降低pH值的能力[8]。有研究指出L. thermotolerans在不同條件下能夠使葡萄酒中乳酸含量從0.23 g/L增加到9.6 g/L，然而L. thermotolerans具有中等乙醇發(fā)酵能力，不能單獨(dú)完成葡萄汁的乙醇發(fā)酵，必須與發(fā)酵能力較強(qiáng)的酵母菌共同作用來完成乙醇發(fā)酵[9]。Benito等[10]利用L. thermotolerans與S. cerevisiae共同發(fā)酵來探索其對西班牙南部葡萄產(chǎn)區(qū)的應(yīng)用效果，其結(jié)果表明L. thermotolerans在提高葡萄酒乳酸含量、甘油含量、增加揮發(fā)性香氣物質(zhì)方面有顯著效應(yīng)。然而，微生物菌種因地域環(huán)境的不同和發(fā)酵基質(zhì)的差異其作用結(jié)果也有很大差異[11]。目前國內(nèi)對S. pombe和L. thermotolerans在葡萄酒發(fā)酵中的應(yīng)用研究尚鮮見報(bào)道。

本研究以甘肅武威葡萄酒產(chǎn)區(qū)美樂葡萄為原料，分別采用S. cerevisiae和S. pombe單獨(dú)接種發(fā)酵以及L. thermotolerans與S. pombe順序接種發(fā)酵的方式釀造美樂干紅葡萄酒，研究其順序接種方式對美樂干紅葡萄酒理化指標(biāo)、主要香氣物質(zhì)的種類、含量及風(fēng)味品質(zhì)的影響，以期建立一種多菌種發(fā)酵工藝模式，為利用非釀酒酵母提升干紅葡萄酒品質(zhì)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

美樂葡萄于2016年9月采自甘肅省武威市民勤縣夏博覽葡萄酒莊園，含糖240 g/L（以還原糖計(jì)）、可滴定酸7.30 g/L（以酒石酸計(jì)）。

1.1.2 菌種與培養(yǎng)基

S. pombe：菌株SP-70購于北京北歐博偉生物技術(shù)有限公司（菌種保藏號SP-70）。L. thermotolerans：菌株LTA購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（菌種保藏號33099）；菌株LTB購于北京北歐博偉生物技術(shù)有限公司（菌種保藏號2.4066）；菌株LTC由安琪酵母公司提供。S. cerevisiae：CECA釀酒酵母活性干粉，安琪酵母公司提供；酒酒球菌（Oenococcus oeni）：OMEGA酒酒球菌活性干粉，購于法國Lallemand公司。

YPD液體培養(yǎng)基（均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母浸粉1%；YPD固體培養(yǎng)基（均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母浸粉1%，瓊脂2%；賴氨酸培養(yǎng)基購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 試劑

氯化鈉、醋酸、醋酸鈉、無水碳酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉、無水葡萄糖、一水合沒食子酸（均為分析純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；L-蘋果酸、L-乳酸（均為色譜純） 上海源葉生物科技有限公司；斐林試劑、次甲基藍(lán)指示液等按照GB/T 603—2002《化學(xué)試劑試驗(yàn)方法中所用制劑及制品的制備》配制。

1.2 儀器與設(shè)備

160350 D型沸點(diǎn)測定儀 法國Dujardin公司；Genesis 10s紫外-可見分光光度計(jì)、TRACE1310-ISQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 法國Salleron公司；TG-WAX氣相色譜柱、Ultimate 3000高效液相色譜儀、BDS HYPERSIL C18液相色譜柱 美國Thermo Scientific公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；500051 S立式高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；PHS-3 C pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

1.3.1.1 菌種培養(yǎng)

將各供試菌株分別接種于YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)24 h，再以1%的接種量接種于YPD液體培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)24 h，然后進(jìn)行酵母菌接種實(shí)驗(yàn)。

1.3.1.2 發(fā)酵接種方案

將采收的美樂葡萄果實(shí)除梗破碎后加入20 mg/L果膠酶，常溫浸漬24 h，取澄清汁并裝入1 L玻璃罐中，裝液量為70%，100 ℃水浴10 min[10]，冷卻后進(jìn)行接種處理。

接種處理：將擴(kuò)培的3 株L. thermotolerans菌液以2%接種量分別接種于葡萄汁中（初始菌體數(shù)量為106CFU/mL），96 h后分別以2%接種量接入S. pombe菌液進(jìn)行混合菌種發(fā)酵（接種后S. pombe初始菌體數(shù)量106CFU/mL）；將擴(kuò)培的S. pombe菌液以2%接種量接種于葡萄汁中進(jìn)行單一菌種發(fā)酵（初始菌體數(shù)量為106CFU/mL）；實(shí)驗(yàn)以S. cerevisiae菌液單一發(fā)酵作為對照（初始菌體數(shù)量也為106CFU/mL）。接種后于25 ℃控溫發(fā)酵；每處理重復(fù)3 次。

當(dāng)殘?zhí)橇康陀? g/L時(shí)，處理組酒樣中添加60 mg/L的SO2

[12]（以偏重亞硫酸鈉的形式）終止發(fā)酵并轉(zhuǎn)入滅菌的棕色玻璃罐中滿罐陳釀。對照組酒樣乙醇發(fā)酵結(jié)束后，按0.02 g/L的添加量接入OMEGA酒酒球菌啟動(dòng)蘋果酸-乳酸發(fā)酵（malolactic fementation，MLF），利用紙層析法檢測蘋果酸減少和乳酸的生成監(jiān)測發(fā)酵進(jìn)程[13]，當(dāng)蘋乳發(fā)酵結(jié)束，則取各發(fā)酵試樣檢測理化指標(biāo)。所有酒樣低溫貯存，陳釀4 個(gè)月后對各發(fā)酵組取樣檢測香氣成分。

1.3.2 指標(biāo)測定

1.3.2.1 葡萄酒理化指標(biāo)測定

總糖、乙醇體積分?jǐn)?shù)、總酸和揮發(fā)酸等理化指標(biāo)參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定；色度、色調(diào)參照Somers等[14]的方法進(jìn)行測定。

1.3.2.2 蘋果酸、乳酸分析

參照Buglass[15]和Pérez-Ruiz[16]等方法，并略作修改，采用高效液相色譜儀進(jìn)行測定。

色譜條件：色譜柱BDS HYPERSIL C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；二極管陣列檢測器；流動(dòng)相0.005 mol/L硫酸溶液；流速0.5 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL；檢測波長210 nm。

定性：將配好的蘋果酸、乳酸單一標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣，確定各自的出峰時(shí)間，根據(jù)保留時(shí)間進(jìn)行定性。定量：將配好不同濃度的蘋果酸和乳酸混合標(biāo)準(zhǔn)液分別進(jìn)樣，進(jìn)行定量分析。以不同混合酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為橫坐標(biāo)，出峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到蘋果酸、乳酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

樣品測定：取2 mL待測酒樣，加入4 mL水，于10 ℃、8 000 r/min的條件下高速離心10 min。然后取上清液用0.45 μm的無菌濾膜過濾后進(jìn)樣。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別計(jì)算出酒樣中蘋果酸、乳酸的含量。

1.3.2.3 CO2質(zhì)量損失的測定

參照周麗華等[17]的方法，略作修改。從葡萄汁接入菌種當(dāng)天開始，每隔24 h對發(fā)酵瓶進(jìn)行稱質(zhì)量并記錄數(shù)據(jù)，2 個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間的質(zhì)量差即為CO2質(zhì)量損失（即CO2的釋放量）。以CO2質(zhì)量損失為縱坐標(biāo)，發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制CO2生成曲線。

1.3.2.4 細(xì)胞生物量測定

參照Gobbi等[8]的方法，略作修改。單獨(dú)接種S. cerevisia和S. pombe的發(fā)酵酒樣分別用YPD固體平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。S. pombe和L. thermotolerans順序發(fā)酵的酒樣先用YPD平板進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)總數(shù)，再用賴氨酸培養(yǎng)基根據(jù)形態(tài)差異對L. thermotolerans進(jìn)行計(jì)數(shù)，差值即為S. pombe的生物量。

1.3.2.5 揮發(fā)性化合物測定

取8 mL酒樣于頂空瓶中。加入2.4 g NaCl及10 μL內(nèi)標(biāo)物2-辛醇，并加入磁力攪拌轉(zhuǎn)子，密封并搖勻，然后將樣品放于40 ℃磁力攪拌器中，平衡30 min，插入萃取頭于40 ℃恒溫水浴鍋中磁力攪拌吸附富集30 min。

氣相色譜-質(zhì)譜條件：進(jìn)樣溫度250 ℃，解吸5 min，不分流進(jìn)樣，10 min后開啟分流閥；載氣為高純氦氣；流速1 mL/min；程序升溫：初始溫度40 ℃，3.5 ℃/min升至180 ℃，保持15 min；連接桿和離子源溫度分別為180 ℃和200 ℃；掃描范圍m/z 50～350。

定性：香氣成分利用MS全離子掃描模式下的總離子流圖譜，依據(jù)色譜保留時(shí)間和質(zhì)譜信息、NIST08標(biāo)準(zhǔn)譜庫比對結(jié)果以及參考相關(guān)文獻(xiàn)相結(jié)合的方法進(jìn)行定性分析。定量：采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析。

1.3.3 感官分析

選擇10 名經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)葡萄酒專業(yè)的老師及研究生（6 名女性和4 名男性）對所釀葡萄酒進(jìn)行感官評定。感官評價(jià)的場所在本學(xué)院的品酒室進(jìn)行。供品嘗酒樣在14 ℃下貯存，以隨機(jī)順序提供給品嘗者。品鑒從視覺（顏色強(qiáng)度、色調(diào)）、香氣（香氣強(qiáng)度、花香、果香、異味）和風(fēng)味（甜味、酸味、酒體、余味長短）共10 個(gè)屬性方面進(jìn)行，用8 分結(jié)構(gòu)化數(shù)值進(jìn)行量化，0～8 分表示感官逐漸增強(qiáng)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，利用Duncan多重比較在置信區(qū)間0.05下對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，對不同處理酒樣的香氣化合物進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本理化指標(biāo)

表 1 供試酒樣乙醇發(fā)酵結(jié)束時(shí)理化指標(biāo)Table 1 Physicochemical indices of wine samples at the end of alcoholic fermentation

從表1可以看出，各處理組總糖質(zhì)量濃度均小于4 g/L。S. pombe單獨(dú)接種發(fā)酵的酒樣與對照酒樣相比，其乙醇體積分?jǐn)?shù)無顯著差異，而L. thermotolerans與S. pombe順序接種發(fā)酵的3 個(gè)處理組與對照組相比其乙醇體積分?jǐn)?shù)顯著降低，這一結(jié)果說明L. thermotolerans與S. pombe順序接種在乙醇發(fā)酵能力方面低于S. cerevisiae單獨(dú)接種發(fā)酵。揮發(fā)酸含量是判斷葡萄酒健康狀態(tài)或腐敗情況的指標(biāo)[18]，同時(shí)根據(jù)GB/T 15037—2006要求揮發(fā)酸不能高于1.0 g/L，順序接種的3 個(gè)處理組與對照組相比揮發(fā)酸含量均低于國標(biāo)要求，相比揮發(fā)酸質(zhì)量濃度顯著降低了0.11～0.16 g/L。另外，用S. pombe單獨(dú)接種的酒樣總酸質(zhì)量濃度顯著低于對照組酒樣，而順序接種的3 個(gè)處理組總酸含量與對照組相比增加了0.96～1.97 g/L。pH值的高低與總酸結(jié)果相對應(yīng)，順序發(fā)酵使pH值顯著降低0.45～0.59。關(guān)于顏色指標(biāo)方面，用S. pombe單獨(dú)接種發(fā)酵的酒樣色度值最高，有S. pombe參與的3 組順序接種酒樣的色度值也顯著高于對照組。S. pombe參與發(fā)酵的處理酒樣與對照組酒樣的色調(diào)值相比顯著降低，說明處理組酒樣比對照組更能呈紅色色調(diào)。

2.2 蘋果酸、乳酸含量分析

圖 1 供試酒樣蘋果酸、乳酸生成量Fig. 1 Production of malic acid and lactic acid of sample wines

單獨(dú)接種S. cerevisiae的對照組在MLF后進(jìn)行蘋果酸、乳酸含量測定，其他處理組的酒樣于乙醇發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行蘋果酸、乳酸含量測定。由圖1可知，S. pombe單獨(dú)發(fā)酵和順序發(fā)酵的酒樣中蘋果酸含量與接入乳酸菌進(jìn)行蘋乳發(fā)酵的對照組相比無顯著差異。3 組順序接種處理組酒樣中乳酸質(zhì)量濃度差異不顯著（2.46～2.86 g/L），但均顯著高于對照組（P＜0.05），順序發(fā)酵酒樣在不進(jìn)行MLF的情況下，減弱了口感尖銳的蘋果酸增加了口感柔和的乳酸，表明L. thermotolerans與S. pombe順序接種發(fā)酵具有代替蘋果酸-乳酸發(fā)酵的潛在可能性。

2.3 CO2質(zhì)量損失分析

在葡萄汁乙醇發(fā)酵過程中CO2質(zhì)量損失可代表菌株的發(fā)酵力，CO2質(zhì)量損失速率可作為菌株的乙醇發(fā)酵速率[17]。由圖2可知，對照組在第8天完成乙醇發(fā)酵，單獨(dú)接種S. pombe酒樣在第16天完成乙醇發(fā)酵，兩菌株CO2總質(zhì)量損失相似，說明S. pombe與S. cerevisiae菌株具有相似的發(fā)酵能力，但發(fā)酵速度較為緩慢。順序接種的3 組處理酒樣在接入L. thermotolerans菌株24 h內(nèi)均能啟動(dòng)發(fā)酵，當(dāng)?shù)?天接入S. pombe后，發(fā)酵速率提升，于第12天后發(fā)酵速率逐漸緩慢，最終在第16天時(shí)CO2釋放基本停止完成發(fā)酵。

圖 2 供試酒樣CO2質(zhì)量損失Fig. 2 CO2 production of sample wines

2.4 生物量分析

圖3A為單獨(dú)接種S. cerevisiae和S. pombe的酒樣中其菌體數(shù)量的變化情況，至乙醇發(fā)酵結(jié)束，S. pombe和S. cerevisiae的生長動(dòng)態(tài)基本相似，最初菌體數(shù)量增長快速，隨后略有下降，從發(fā)酵第6天到乙醇發(fā)酵結(jié)束的第16天，其菌體數(shù)量均穩(wěn)定在106CFU/mL。3 組順序接種發(fā)酵過程中各處理酒樣中兩種非釀酒酵母生長動(dòng)態(tài)見圖3B～D。3 株L. thermotolerans在順序接種發(fā)酵過程中其菌體生長趨勢相似，自接種之后的2 d內(nèi)，菌體數(shù)量快速增加，在2～4 d內(nèi)菌體數(shù)量達(dá)到最大，當(dāng)接入S. pombe后的第2天，L. thermotolerans菌體數(shù)量開始迅速減少并逐漸消失，菌株LTA（圖3B）在第10天全部消亡，菌株LTB（圖3C）和菌株LTC（圖3D）均在第12天時(shí)無法檢測到其活細(xì)胞存在，而S. pombe在第16天乙醇發(fā)酵結(jié)束時(shí)菌體數(shù)量依然保持在105CFU/mL。

圖 3 供試酒樣生物量Fig. 3 Yeast population during wine fermentation

2.5 揮發(fā)性香氣化合物分析

葡萄酒的釀造過程是一個(gè)復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)，其香氣復(fù)雜多變，主要來源有葡萄品種，酵母發(fā)酵與陳釀過程。實(shí)驗(yàn)所得酒樣中共檢測出77 種香氣化合物，包括26 種酯類（約占香氣總量的27.89%），16 種醇類（約占香氣總量的54.64%），15 種有機(jī)酸（約占香氣總量的15.53%），12 種萜烯類（約占香氣總量的0.90%），7 種其他類化合物（約占香氣總量的1.03%）。與僅用S. cerevisiae發(fā)酵的對照組先比，順序接種處理組的酯類、醇類和酸類的含量分別下降了38.46%～49.34%、13.36%～19.42%、46.84%～49.71%，種類相差不大。而萜烯類和其他類化合物在種類和含量上均有所增加，其含量要比對照組增加32.47%～42.65%。

表 2 供試酒樣香氣成分及含量Table 2 Concentrations of aroma components in wines

續(xù)表2

續(xù)表2

2.5.1 酯類化合物

酯類物質(zhì)主要通過酵母代謝以及酒中的酯化反應(yīng)產(chǎn)生，通常賦予葡萄酒一定的花香、果香[28]。由表2可以看出，本實(shí)驗(yàn)中各發(fā)酵酒樣所檢測到酯類物質(zhì)共26種，其酯類化合物總量有所不同。L. thermotolerans和S. pombe順序發(fā)酵的酒樣酯類化合物質(zhì)量濃度在2 310.63～2 807.09 μg/L，與單獨(dú)用S. cerevisiae接種發(fā)酵4 561.44 μg/L相比降低了38.46%～49.34%，單獨(dú)用S. pombe接種的酒樣酯類總量為2 561.11 μg/L，與3 組順序發(fā)酵酒樣含量接近。在3 組順序發(fā)酵酒樣中貢獻(xiàn)較大的物質(zhì)有正己酸乙酯（550.20～569.42 μg/L）、辛酸乙酯（613.05～643.00 μg/L）和癸酸乙酯（477.88～828.85 μg/L），雖然其含量均低于對照組，但均超過相應(yīng)閾值，對葡萄酒果味香氣有積極貢獻(xiàn)。

2.5.2 高級醇類化合物

葡萄酒中高級醇類物質(zhì)主要通過酵母發(fā)酵過程中糖代謝和氨基酸轉(zhuǎn)化而成[29]。有研究顯示當(dāng)高級醇質(zhì)量濃度小于300 mg/L時(shí)，對于葡萄酒的感官品質(zhì)具有積極作用[30]。本實(shí)驗(yàn)中各發(fā)酵酒樣檢測到的高級醇類物質(zhì)總量由高到低排列順序?yàn)镾. cerevisiae純種發(fā)酵酒樣（7 241.44 μg/L）、L. thermotolerans和S. pombe順序發(fā)酵酒樣（5 834.91～6 274.28 μg/L）、S. pombe純種發(fā)酵酒樣（3 545.40 μg/L）。其中，單獨(dú)用S. pombe接種試樣中高級醇含量與對照S. cerevisiae相比顯著下降，順序接種酒樣與對照相比也下降了13.36%～19.42%。說明S. pombe參與發(fā)酵的試樣，高級醇總量均有所下降[31]。各供試酒樣個(gè)別物質(zhì)含量也存在差異，3 組順序發(fā)酵的處理組苯乙醇含量較對照組高，且超過感官閾值，為葡萄酒提供玫瑰等花粉香氣。

2.5.3 酸類化合物

酸類化合物是酵母發(fā)酵過程中代謝的副產(chǎn)物，主要在乙醇發(fā)酵和蘋乳發(fā)酵過程中產(chǎn)生，葡萄酒中通常表現(xiàn)出來的奶酪味以及脂肪味與葡萄酒中存在的酸類化合物密切相關(guān)[32-33]。由表2可知，各發(fā)酵試樣酸類化合物種類相差不多，用S. cerevisiae單獨(dú)接種發(fā)酵的酒樣酸類化合物質(zhì)量濃度（2 637.04 μg/L）高于順序發(fā)酵酒樣（1 326.21～1 401.81 μg/L）。順序發(fā)酵酒樣與對照相比酸類化合物含量降低了46.84%～49.71%，各發(fā)酵酒樣中單個(gè)有機(jī)酸類物質(zhì)在含量上存在一定差異，但排在前三位的有機(jī)酸類物質(zhì)相同，分別為辛酸、癸酸、己酸。

2.5.4 萜烯類化合物

萜烯類化合物來源于葡萄果實(shí)本身，主要以糖苷鍵合態(tài)形式存在，釀造過程中可在糖苷酶作用下轉(zhuǎn)變?yōu)閾]發(fā)性的游離態(tài)香氣化合物，從而賦予葡萄酒品種香氣特征[34]。本實(shí)驗(yàn)處理組中所檢測到的萜烯類物質(zhì)的種類和含量均高于對照組，對照組中僅檢測到橙花醇和葉醇。單獨(dú)接種S. pombe的酒樣中萜烯類物質(zhì)總量達(dá)到120.55 μg/L，L. thermotolerans和S. pombe順序接種的酒樣中萜烯類物質(zhì)質(zhì)量濃度范圍在83.47～126.03 μg/L。其中，對順序發(fā)酵酒樣起到主要貢獻(xiàn)作用的物質(zhì)有芳樟醇（薰衣草香）和香茅醇（檸檬、柑橘香），這些物質(zhì)含量均超過感官閾值，賦予葡萄酒花果香氣，提高了葡萄酒香氣的復(fù)雜性。

2.5.5 其他類化合物

本實(shí)驗(yàn)酒樣中還檢測到了癸醛、仲辛酮、大馬酮、枯烯、苯乙烯、2,6-二叔丁基對甲酚、2,4-二叔丁基對甲酚7 種物質(zhì)，這些物質(zhì)對于酒體的平衡具有一定的貢獻(xiàn)，其質(zhì)量濃度由高到低排序?yàn)轫樞虬l(fā)酵酒樣（124.82～130.11 μg/L）、S.cerevisiae純種發(fā)酵酒樣（85.50 μg/L）、S. pombe純種發(fā)酵酒樣（69.63 μg/L）。在非釀酒酵母參與發(fā)酵的酒樣中均有大馬酮（蘋果、蜂蜜、玫瑰香）和2,6-二叔丁基對甲酚（藥味、煙味、酚醛味）的檢出，但順序發(fā)酵的酒樣大馬酮的含量高于S. pombe純種發(fā)酵的試樣，而2,6-二叔丁基對甲酚的含量在非釀酒酵母酒樣中含量相差不大。

2.6 各處理酒樣揮發(fā)性香氣的主成分分析

將供試酒樣進(jìn)行主成分分析，以特征值大于1為依據(jù)，提取4 個(gè)公因子，其中PC1、PC2和PC3的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為86.20%。由圖4可知，PC1、PC2、PC3的方差貢獻(xiàn)率分別為51.05%、20.41%和14.74%。可以看出，與PC1高度正相關(guān)的是一些具有濃郁花果香的酯類、醇類（如乙酸異戊酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯和卞醇）以及某些具有消極氣味的酸類（如辛酸、癸酸等），而1-壬醇和2,6-二丁基對甲酚與PC1呈負(fù)相關(guān)（載荷系數(shù)大于0.9）。PC2主要體現(xiàn)了乙酸苯乙酯、苯乙醇、3-乙氧基丙醇等香氣化合物的重要信息（載荷系數(shù)大于0.7），與檢測到的大多數(shù)萜烯類物質(zhì)呈負(fù)相關(guān)。對PC3起主要貢獻(xiàn)作用的物質(zhì)有2,3-丁二醇、2,4-二丁基對苯酚等（正相關(guān)），與丁二酸單乙酯、仲辛酮呈負(fù)相關(guān)。

圖 4 香氣化合物主成分分析的因子載荷圖Fig. 4 PCA loading plots of volatile aroma compounds

圖 5 不同酒樣主成分分析得分圖Fig. 5 PCA score plots of wines

由圖5可知，所有供試酒樣可聚為3 類。純種S. cerevisiae發(fā)酵的對照組聚為一類，PC1得分最高。兩株非釀酒酵母順序接種的3 個(gè)處理組距離較近，可聚為一類，且PC2得分相對較高，主體香氣化合物為乙酸苯乙酯、苯乙醇等物質(zhì)，賦予葡萄酒濃郁的花果香氣。純種S. pombe發(fā)酵可單獨(dú)聚為一類，位于PC3的正半軸，主要與一些具有消極氣味的物質(zhì)（如2,3-丁二醇、2,4-二丁基對苯酚）相關(guān)。

2.7 感官分析

圖 6 感官分析雷達(dá)圖Fig. 6 Rader map of sensory analysis

通過對所有酒樣的感官分析（圖6）可知，各發(fā)酵試樣在酒體和余味長短方面得分無顯著差異。在顏色方面，S. pombe單獨(dú)發(fā)酵的酒樣顏色強(qiáng)度獲得最高分?jǐn)?shù)，有S. pombe參與的順序發(fā)酵試樣得分也高于用S. cerevisiae純種發(fā)酵的酒樣，與圖3結(jié)論相一致。對香氣分析說明，3 株L. thermotolerans與S. pombe順序接種發(fā)酵的酒樣花香味突出明顯，但與對照相比有稍微明顯的生青味。另外，順序接種發(fā)酵有較高的酸度和甜度。綜上所述，3 組順序接種發(fā)酵酒樣相對于傳統(tǒng)的釀酒方式顏色外觀有所提升，酸度增加，花香較突出。另外，3 組順序發(fā)酵酒樣感官品質(zhì)分析得分無太大差異。

3 討 論

L. thermotolerans和S. pombe菌株順序培養(yǎng)發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，這取決于L. thermotolerans菌株的生長程度，因此本研究以間隔4 d的順序接種模式，目的是確保在添加S. pombe前，L. thermotolerans的生長數(shù)量達(dá)到最大。Kapsopoulou等[35]證實(shí)L. thermotolerans菌株在體積分?jǐn)?shù)9%乙醇環(huán)境中只能夠存活數(shù)天，其乳酸生成曲線與其生長曲線一致，當(dāng)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到最大，乳酸生產(chǎn)量也達(dá)到最大，這也支持了本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，L. thermotolerans在發(fā)酵第4天菌體數(shù)量達(dá)到最大，當(dāng)接入S. pombe菌液后，L. thermotolerans菌體數(shù)量開始迅速減少，在兩種菌體混合發(fā)酵的過程中，L. thermotolerans能夠存活的時(shí)間不超過12 d。也有研究顯示[9-10]，不同的L. thermotolerans菌株及不同發(fā)酵條件，乳酸產(chǎn)量差異較大（0.23～9.6 g/L），本實(shí)驗(yàn)中L. thermotolerans菌株LTA最多能夠產(chǎn)生的乳酸為2.86 g/L，供試的3 種菌株之間對乳酸的產(chǎn)生量差異不大。L. thermotolerans和S. pombe順序接種釀造的美樂干紅葡萄酒降低了揮發(fā)酸和乙醇體積分?jǐn)?shù)，但需要更長的時(shí)間完成發(fā)酵，這與Del-Fresno等[9]的研究結(jié)果一致，由于S. pombe具有將蘋果酸轉(zhuǎn)化為乙醇[5]的能力，順序發(fā)酵酒樣可在不添加酒酒球菌的情況下降解尖銳的蘋果酸增加口感柔和的乳酸。Benito等[36]的研究也表明L. thermotolerans和S. pombe混合發(fā)酵具有代替MLF的潛能。本研究處理酒樣中色度值顯著增加，色調(diào)值顯著下降，這主要是由于S. pombe菌株參與發(fā)酵的結(jié)果。vitisin A是葡萄酒中主要的吡喃型花色苷，在葡萄酒釀造過程中，丙酮酸可將花色苷吡喃環(huán)上的第4個(gè)C原子和與其相連的苯環(huán)第5個(gè)C原子連成六元的含氧雜環(huán)，形成vitisin A[37]。S. pombe在葡萄汁發(fā)酵過程中可產(chǎn)生大量的丙酮酸，使vitisin A產(chǎn)量增加從而改善顏色參數(shù)[38]。其次，S. pombe的羥基肉桂酸乙酯脫羧酶活性高于釀酒酵母，該酶能夠促進(jìn)羥基肉桂酸脫羧形成乙烯基苯酚，并與葡萄花色素縮合形成顏色穩(wěn)定的苯乙烯基吡喃花色苷加合物[38]。對于揮發(fā)性化合物，L. thermotolerans和S. pombe菌株順序發(fā)酵酒樣中酯類、高級醇類和酸類化合物的含量都有所下降，Morales等[39]對L. thermotolerans和S. cerevisiae混合發(fā)酵酒樣的揮發(fā)性化合物進(jìn)行定期監(jiān)控，發(fā)現(xiàn)混合發(fā)酵酒樣的酯類、高級醇類和酸類化合物的含量均不及單獨(dú)用S. cerevisiae發(fā)酵的葡萄酒。其中，高級醇類含量的下降主要與S. pombe菌株相關(guān)，Loira等[31]指出有S. pombe參與的混合發(fā)酵，高級醇含量均有所下降。本實(shí)驗(yàn)還得出順序發(fā)酵酒樣的苯乙醇含量有所增加，Gobbi等[8]在L. thermotolerans和S. cerevisiae混合發(fā)酵的酒樣中也得到相同結(jié)論。

傳統(tǒng)葡萄酒釀造通常選擇S. cerevisiae作為單一的發(fā)酵劑，本實(shí)驗(yàn)將L. thermotolerans和S. pombe兩種非釀酒酵母順序接種釀造美樂干紅葡萄酒打破了傳統(tǒng)的釀酒模式，提高了干紅葡萄酒的感官品質(zhì)。但此實(shí)驗(yàn)僅為相關(guān)菌種的基礎(chǔ)研究，對于其在酒廠中的實(shí)際應(yīng)用及基因方面的研究仍需進(jìn)一步探索。目前，國內(nèi)對于非釀酒酵母改善葡萄酒品質(zhì)的研究還鮮有報(bào)道，因此，開發(fā)出更多具有特色的非釀酒酵母勢在必行。

4 結(jié) 論

L. thermotolerans和S. pombe以間隔4 d順序接種發(fā)酵過程中，L. thermotolerans菌體前期數(shù)量增長迅速，第4天菌體數(shù)量達(dá)到最大，但在接入S. pombe的第2天，菌體數(shù)量明顯減少，并在10～12 d完全消亡。3 株L. thermotolerans和S. pombe菌株以順序接種方式發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸含量無顯著差異，其質(zhì)量濃度為2.46～2.86 g/L。發(fā)酵的美樂干紅葡萄酒其基本理化指標(biāo)符合國標(biāo)要求，順序接種發(fā)酵能夠使揮發(fā)酸降低0.11～0.16 g/L，總酸增加0.96～1.97 g/L，也能夠增加酒體色度，降低酒體色調(diào)。順序接種發(fā)酵酒樣中酯類、高級醇類和有機(jī)酸類化合物的含量分別下降了38.46%～49.34%、13.36%～19.42%、46.84%～49.71%，但增加了苯乙醇、萜烯類和大馬士酮等揮發(fā)性化合物的產(chǎn)出，提高了香氣的復(fù)雜性。感官分析表明順序發(fā)酵改善了葡萄酒的色澤，酸度偏高，花果香氣明顯。表明L. thermotolerans菌株與S. pombe菌株以間隔4 d的順序接種方式發(fā)酵具有替代蘋果酸-乳酸發(fā)酵的潛力，對葡萄酒增酸和感官品質(zhì)的提升也具有積極影響。