乳酸菌飲料中嗜酸乳桿菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法

張娜娜，劉 洋,*，俞 漪，趙 渝，竇同海，徐 瓊，段文鋒，翁史昱

（1.上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院，國家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（上海），上海 200233；2.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234；3.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438；4.上海市質(zhì)量管理科學(xué)研究院（上海），上海 200050）

嗜酸乳桿菌是重要的益生菌，被大量應(yīng)用在食品中[1]。研究表明嗜酸乳桿菌能在乳制品中產(chǎn)生乳酸，并能通過氨基酸代謝增加風(fēng)味[2-3]。嗜酸乳桿菌主要作用有降低pH值、產(chǎn)生抗菌素（如嗜酸菌素和乳酸殺菌素等），在一定程度上抑制腸道中有害微生物的有害作用[4-6]。有研究[7-9]發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌對大腸桿菌、腹瀉致病菌等均有抑制作用；大量的嗜酸乳桿菌還可阻礙膽固醇的合成，降低血漿中膽固醇含量[10]；另外對于乳糖不耐癥也有一定的療效[11-12]。嗜酸乳桿菌對腸道菌群的平衡和對微生態(tài)的調(diào)節(jié)也證明其對健康具有促進(jìn)的作用[13-14]。在我國，飲料中添加益生菌特別是嗜酸乳桿菌成為新的發(fā)展趨勢[15-16]。

關(guān)于益生菌的使用我國發(fā)布了一系列的法律法規(guī)，2016年，衛(wèi)計(jì)委關(guān)于印發(fā)《可用于食用的菌種名單》的通知（衛(wèi)辦監(jiān)督發(fā)[2010]65號）[17]，規(guī)定食品中允許使用的菌種。2013年衛(wèi)生部發(fā)布關(guān)于食品中使用菌種標(biāo)簽標(biāo)識(shí)有關(guān)問題的復(fù)函（衛(wèi)辦監(jiān)督函[2013]367號）[18]中明確指出，預(yù)包裝食品中使用了上述菌種的，應(yīng)當(dāng)按照GB 7718—2011《預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則》[19]的要求標(biāo)注其菌種名稱，企業(yè)可同時(shí)在預(yù)包裝食品上標(biāo)注相應(yīng)的菌株名、菌株號和活菌量。2016年制定了關(guān)于乳酸菌檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.35—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》并在GB 7101—2015《飲料》規(guī)定乳酸菌飲料產(chǎn)品標(biāo)簽應(yīng)標(biāo)明活菌或非活菌，標(biāo)識(shí)活菌的其活菌數(shù)至少要達(dá)到1×106CFU/mL[20-21]。標(biāo)準(zhǔn)檢測方法操作復(fù)雜、結(jié)果判讀時(shí)間長，很難滿足市場快速檢測的要求。為防止市場上出現(xiàn)濫竽充數(shù)的情況，建立基于分子水平的菌種特異性鑒定方法十分重要[22]。

目前在DNA水平上的分子檢測方法越來越多，其檢測方法快速方便、靈敏、省時(shí)被廣泛應(yīng)用到物種檢測中[23]。其中實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)因其高特異性、高靈敏度、無污染等優(yōu)點(diǎn)，在食品檢測中備受青睞。本研究建立基于嗜酸乳桿菌SPIDR保守區(qū)域的序列結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法定量檢測飲料中的嗜酸乳桿菌，以保障食品安全監(jiān)管順利進(jìn)行。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

據(jù)2016年衛(wèi)計(jì)委發(fā)布，衛(wèi)辦監(jiān)督發(fā)《可用于食品的菌種名單》[7]與市場上常見的乳酸菌菌株及可能存在的致病菌，本研究所選菌株為嗜酸乳桿菌4 株，非嗜酸乳桿菌共17 株，其中包括乳桿菌14 株，嗜熱鏈球菌、大腸桿菌以及沙門氏菌各1 株。菌株樣本見表1。菌種購買后均由上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院自行保存。

表 1 標(biāo)準(zhǔn)菌種名稱及其編號Table 1 Information about standard strains used in this study

1.2 儀器與設(shè)備

5430R振蕩水浴槽 德國艾本德有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱 美國Shellab公司；ESCO LA2-4A1生物安全柜 新加坡藝思高公司；7500 Fast熒光定量PCR儀美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株及乳酸菌飲料中嗜酸乳桿菌的培養(yǎng)

按照GB 4789.35—2016方法進(jìn)行培養(yǎng)[21]。

1.3.2 乳酸菌核酸提取

改良的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）法提取核酸[24]。

標(biāo)準(zhǔn)菌株核酸提取：用無菌棉簽沾取培養(yǎng)基上的菌株，在裝有無菌水的2 mL離心管中洗脫，離心，加入400 μL溶菌酶（50 ng/μL），37 ℃孵育2 h，再加入40 μL蛋白酶K（20 mg/mL）和400 μL SDS，56 ℃水浴2 h，后按照核酸提取的步驟提取核酸。

乳酸菌飲料及模擬樣品中核酸提?。簶悠坊靹?，取2 mL加入離心管中，2 000×g離心5 min，上清液移至新的離心管中，加入5 mL無菌水，混勻，沸水中放置10 min，2 000×g離心5 min，上清液移至新的離心管中，再次9 000×g離心10 min，去上清液，沉淀加入400 μL溶菌酶（50 ng/μL），37 ℃孵育2 h，再加入40 μL蛋白酶K（20 mg/mL）和400 μL SDS，56 ℃水浴2 h，后按照核酸提取的步驟提取核酸。

1.3.3 引物、探針設(shè)計(jì)

在NCBI網(wǎng)站上（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/）下載嗜酸乳桿菌NCFM基因組，利用SPIDR的保守區(qū)域序列，借助ClustalW 軟件對此序列進(jìn)行比對，然后使用Primer Express 3 軟件設(shè)計(jì)引物、探針（NCFM F：5’-GTGATCTTTCCTTCACTGCGT-3’；NCFM R：5’-TCCTCGATGGTAACTCTGTAGC-3’；NCFM P：5’-FAM-TGTGCTTCAGGGTTACCTCCACTTTCABQH-3’）用于嗜酸乳桿菌的鑒定，擴(kuò)增片段為213 bp，在NCBI網(wǎng)站上使用BLAST數(shù)據(jù)庫比對引物和探針的理論特異性。乳桿菌通用引物序列（ST16s F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；ST 1495 R：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’）用于擴(kuò)增提取的DNA，檢驗(yàn)提取物中含有核酸，作為對照。引物和探針均由英濰捷基生物公司合成。

1.3.4 PCR條件及檢測

普通PCR采用20 μL體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中包括10 μL TaKaRa Ex Taq mix，上、下游引物（5 μmol/L）各1 μL，探針（5 μmol/L）0.5 μL，2 μL DNA模板，去離子水補(bǔ)足至20 μL。

普通PCR條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火溫度依次為56、58、60、62、64、60 s，72 ℃退火40 s，38 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物檢測方法：取 5 μL PCR產(chǎn)物，在 1.0%瓊脂糖凝膠和0.5% TE緩沖液中電泳28 min（120 V），然后采用凝膠成像系統(tǒng)拍照存檔。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系為20 μL，包含TaKaRa Prober Taq mix 10 μL，上、下游引物（5 μmol/L）各1 μL，探針（5 μmol/L）0.5 μL，2.0 μL DNA 模板，去離子水補(bǔ)足至20 μL。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火35 s，40 個(gè)循環(huán)。

1.3.6 檢測方法的特異性、靈敏度和重復(fù)性測試

特異性測試：采用4 株嗜酸乳桿菌菌株，14 株近緣乳桿菌，以及3 株其他細(xì)菌的核酸為模板，采用建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系進(jìn)行檢測。

靈敏度測試：包括相對靈敏度和絕對靈敏度的檢測。絕對靈敏度測試選取4 株嗜酸乳桿菌，分別將提取的核酸溶液進(jìn)行稀釋，核酸質(zhì)量濃度依次為58、5.8、0.58、0.058、0.005 8、0.000 58、0.000 058 ng/μL，進(jìn)行熒光擴(kuò)增。相對靈敏度測試將嗜酸乳桿菌ATCC4356培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋提取的核酸為模板，采用建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系進(jìn)行檢測。靈敏度的檢測每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置6 個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，最終滿足不小于96%置信區(qū)間的要求。

重復(fù)性測試：采用嗜酸乳桿菌ATCC4356標(biāo)準(zhǔn)菌株核酸的6 個(gè)質(zhì)量濃度的梯度稀釋液進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)質(zhì)量濃度4 個(gè)平行，計(jì)算Ct值的標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard deviation，SD）和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系的抗干擾能力檢測

對建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系抗干擾能力測試包括培養(yǎng)物水平抗干擾能力檢測和核酸水平抗干擾能力檢測。核酸水平是將提取的嗜酸乳桿菌ATCC4356核酸稀釋至58、5.8、0.58、0.058、0.0058、0.000 58 ng/μL，分別添加300 pg/μL、3 ng/μL、30 ng/μL的大腸桿菌ATCC25922核酸，對制備的混合核酸模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增；培養(yǎng)物水平是將嗜酸乳桿菌ATCC4356培養(yǎng)至108CFU/mL后依次稀釋至10 CFU/mL，然后添加濃度為104CFU/mL和106CFU/mL的大腸桿菌ATCC25922，并提取核酸。每個(gè)濃度2 個(gè)平行，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

1.3.8 模擬樣品檢測

利用建立好的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對模擬樣品進(jìn)行檢測，模擬樣品的制作：嗜酸乳桿菌ATCC4356培養(yǎng)至109CFU/mL，以市場上購買不含嗜酸乳桿菌的乳酸菌飲料作為基質(zhì)，進(jìn)行梯度稀釋，最終將稀釋液進(jìn)行核酸提取，以該核酸為模板擴(kuò)增。每個(gè)濃度進(jìn)行5 個(gè)平行。

1.3.9 實(shí)際樣品檢測

市場上隨機(jī)購買樣品共11 份，其中5 份樣品的標(biāo)簽標(biāo)記不含嗜酸乳桿菌，6 份樣品標(biāo)記含有嗜酸乳桿菌，按建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對樣品進(jìn)行檢測。每個(gè)樣品3 個(gè)平行。

1.4 數(shù)據(jù)與圖像處理

實(shí)驗(yàn)使用的儀器自帶軟件7500 Fast System Software v1.3.2在擴(kuò)增過程中自動(dòng)進(jìn)行分析并得出Ct值，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析則借助SPSS 14.0進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 普通PCR的溫度優(yōu)化

利用普通PCR進(jìn)行溫度優(yōu)化，擴(kuò)增溫度分別選擇56、58、60、62、64 ℃幾個(gè)梯度，結(jié)果如圖1所示，擴(kuò)增效率最高的是60 ℃，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇60 ℃為體系的擴(kuò)增溫度。

圖 1 普通PCR擴(kuò)增溫度優(yōu)化Fig. 1 Optimization of amplification temperature through traditional PCR

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的特異性

圖 2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性Fig. 2 Specificity of real-time fluorescence quantitative PCR

如圖2A所示，所有嗜酸乳桿菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株均有明顯擴(kuò)增，且Ct值在16～18之間，其他菌株均無明顯的擴(kuò)增；如圖2B所示，采用乳桿菌通用引物對所有菌株進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，可見到清晰的擴(kuò)增條目。證明本研究建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法對于嗜酸乳桿菌有較好的特異性。

2.3 檢測方法的靈敏度

2.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的絕對靈敏度

表 2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的絕對靈敏度Table 2 Aabsolute sensitivity of real-time fluorescence quantitative PCR

如表2所示，嗜酸乳桿菌ATCC4356、CICC6082、NCFM、La-14可穩(wěn)定檢測的最低質(zhì)量濃度為0.000 58 ng/μL。每個(gè)模板添加4 μL，即檢測限在3 pg左右，本研究的實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系的絕對靈敏度達(dá)到3 pg。

2.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的相對靈敏度

表 3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的相對靈敏度Table 3 Relative sensitivity of real-time fluorescence quantitative PCR

相對靈敏度檢測是將嗜酸乳桿菌ATCC4356的培養(yǎng)液按照10 倍梯度稀釋法從108～102CFU/mL各濃度取1 mL提取核酸，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。由表3可以看出，嗜酸乳桿菌ATCC4356的絕對靈敏度可穩(wěn)定檢出的最低濃度為103CFU/mL。根據(jù)絕對靈敏度和相對靈敏度的檢測可得出實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測限為103CFU/mL。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的重復(fù)性檢測結(jié)果

表 4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的重復(fù)性檢測Table 4 Rrepeatability of real-time quantitative PCR

如表4所示，嗜酸乳桿菌ATCC4356不同的核酸濃度擴(kuò)增，每個(gè)質(zhì)量濃度6 個(gè)平行，最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值的SD介于0.14～0.56之間，RSD介于0.862%～2.55%之間，均在可接受范圍內(nèi)。證明建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法重復(fù)性較好。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的抗干擾能力

表 5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR在培養(yǎng)物水平上的抗干擾能力Table 5 Anti-interference ability of real-time fluorescence quantitative PCR against E. coli culture

表 6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR純基因水平上的抗干擾能力（Ct值）Table 6 Anti-interference ability of real-time fluorescence quantitative PCR against E. coli genome

在實(shí)際檢測中，樣品中的菌株一般是目標(biāo)菌和其他菌株的混合物，因此在培養(yǎng)物水平進(jìn)行檢測可以排除樣品中或在提取過程中混入雜菌的可能性；在純基因水平進(jìn)行抗干擾能力的檢測可以排除在擴(kuò)增過程中出現(xiàn)交叉污染的情況。由表5可以看出，在樣品中混入103、106CFU/mL的雜菌對實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增是沒有干擾的，且檢出限仍為103CFU/mL；由表6可以看出，在不同濃度的嗜酸乳桿菌ATCC4356的核酸中添加300 pg/μL、3 ng/μL、30 ng/μL的大腸桿菌ATCC25922的核酸提取物，各濃度梯度核酸檢出的Ct值均未受影響，證明建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系抗干擾能力強(qiáng)。

2.6 模擬樣品的檢測及標(biāo)準(zhǔn)曲線

為驗(yàn)證建立的方法是否可以在實(shí)際樣品中進(jìn)行檢測，在進(jìn)行實(shí)樣檢測之前，利用模擬樣品對該方法進(jìn)行驗(yàn)證。這樣不僅可以節(jié)約時(shí)間，且節(jié)省成本在不含嗜酸乳桿菌的乳酸菌飲料為基質(zhì)的模擬樣品檢測中，以Ct值為縱坐標(biāo)，以嗜酸乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)株已知的不同稀釋菌數(shù)對數(shù)值（lg（CFU/g））為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性方程為y=-3.312 4x+38.939，R2=0.987，檢測結(jié)果的線性較好且檢測限仍為103CFU/mL。說明本實(shí)驗(yàn)建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測方法可行，且檢測的結(jié)果與實(shí)際添加量是一致的。

2.7 實(shí)際樣品檢測結(jié)果

對市售的11 份樣品采用建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測，利用乳桿菌通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，樣品核酸全部擴(kuò)增出目的條帶，表明樣品中已提出可擴(kuò)增的DNA；采用嗜酸乳桿菌屬的特異性引物、探針擴(kuò)增，含有嗜酸乳桿菌的6 份乳酸菌飲料全部擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，定量檢測結(jié)果表7所示。

表 7 實(shí)際樣品的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果Table 7 Detection of actual samples by real-time fluorescence quantitative PCR

由表7可以看出，11 份樣品中，6 份樣品檢測出含有嗜酸乳桿菌，編號分別為B1、B4、B6、B7、B8、B9，這與購買樣品的便簽信息一致。檢測結(jié)果可以看出，嗜酸乳桿菌的含量在5.83×102～3.68×104CFU/mL之間，建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法可以用砸乳酸菌飲料中對嗜酸乳桿菌進(jìn)行定量。

3 討論與結(jié)論

乳酸菌飲料中添加嗜酸乳桿菌的產(chǎn)品越來越多，且價(jià)格較高，利益驅(qū)使下可能會(huì)出現(xiàn)“濫竽充數(shù)”的現(xiàn)象，值得監(jiān)管部門重視。我國衛(wèi)生部曾發(fā)布相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：乳酸菌飲料中益生菌活菌的添加量要不低于106CFU/mL。目前對于乳酸菌飲料特別是非活菌飲料中益生菌的菌種鑒定、益生菌定量檢測缺少快速、準(zhǔn)確、特異性、高通量的檢測方法。

傳統(tǒng)方法一般依賴于國家標(biāo)準(zhǔn)對嗜酸乳桿菌進(jìn)行檢測，即基于培養(yǎng)法，耗時(shí)耗力，結(jié)果受操作者經(jīng)驗(yàn)影響較大，難以滿足市場精確鑒定和定量的要求。利用分子生物法進(jìn)行檢測的手段已在食品微生物檢測中得到應(yīng)用[25-28]。Guo Zihao[29]和包秋華[30]等研究了發(fā)酵食品中嗜酸乳桿菌的檢測技術(shù)，有研究表明利用熒光定量PCR方法對發(fā)酵乳中的乳酸菌或雙歧桿菌進(jìn)行檢測，并與平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行比較，結(jié)果顯示PCR法與平板法技術(shù)結(jié)果相符[31-33]。這些均證明實(shí)時(shí)熒光定量PCR可以在乳酸菌飲料的檢測中應(yīng)用，且具有快速、通量高、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)。目前，國內(nèi)外對嗜酸乳桿菌的定性定量檢測研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)建立乳酸菌飲料中添加嗜酸乳桿菌的定性定量檢測方法，對方法的特異性、靈敏度、重復(fù)性、抗干擾能力等多方面參數(shù)進(jìn)行研究，結(jié)果表明該方法具有很強(qiáng)的實(shí)用性。

本研究利用設(shè)計(jì)的嗜酸乳桿菌屬的特異性引物建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法在乳酸菌飲料中的檢測應(yīng)用。結(jié)果證明，該方法的特異性好，檢測限低，純基因水平檢測限在3 pg左右，絕對靈敏度檢測達(dá)到103CFU/mL，且重復(fù)性較好；在純基因水平與培養(yǎng)物水平的抗干擾能力都很強(qiáng)；模擬樣品檢測中其檢測限未改變，重復(fù)性較好，證明適合在市場檢測中使用；實(shí)際樣品檢測結(jié)果與標(biāo)簽信息一致。并得出嗜酸乳桿菌相應(yīng)的添加量，只是嗜酸乳桿菌的含量有所不同。這一研究證明該方法可應(yīng)用在乳酸菌飲料中嗜酸乳桿菌的快速檢測。