生姜蛋白酶對干腌羊火腿品質(zhì)特性的影響

阿爾祖古麗·阿卜杜外力，玉素甫·蘇來曼，巴吐爾·阿不力克木*

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

生姜蛋白酶是作為一種新型植物蛋白酶，在結(jié)構(gòu)與性質(zhì)上與木瓜蛋白酶等植物蛋白酶具有較多的相似性，被認(rèn)為是木瓜蛋白酶家族的一個新成員[1]。生姜蛋白酶食用安全，可用作嫩肉劑[2]、酒澄清劑[3]、乳制品凝固劑[4]以及大豆蛋白粉[5]等食品添加劑，它還能特異水解脯氨酸P2位含有脯氨酸的多肽和蛋白質(zhì)，對脯氨酸的這種特殊親和性使其在生化研究中成為一種很有前途的工具蛋白酶[6]。生姜蛋白酶用于肉類嫩化，不僅可以使其嫩度顯著提高，還可以使其具有良好的風(fēng)味。其對肉類嫩化的作用機理是通過分解膠原蛋白和肌動球蛋白（尤其是對膠原蛋白的分解能力很強）而實現(xiàn)的，能降解肌原纖維，導(dǎo)致肌原纖維的斷裂而提高肉類的嫩度[7]。俞沛初等[8]通過對雞肉、牛肉中添加不同劑量生姜汁實驗，考察生姜汁對肉類有明顯的致嫩效果。唐曉珍等[9]報道，生姜汁和生姜蛋白酶對豬肉的嫩化效果，并指出生姜汁可以直接在肉類嫩化中應(yīng)用，確定生姜蛋白酶嫩化豬肉的最適條件。Naveena等[10]研究姜汁對印度水牛肉的嫩化效果，結(jié)果表明姜汁處理增加了樣品的膠原蛋白溶解度，促進了肌漿蛋白以及肌原纖維蛋白的分解，降低了剪切力，肌肉蛋白質(zhì)的電泳圖案中蛋白條帶數(shù)量減少，表明生姜蛋白酶具有廣泛的蛋白水解能力。孫國梁[11]研究生姜蛋白酶對牛肉的嫩化效果實驗，對酶用量、pH值、處理溫度、處理時間進行測試，結(jié)果表明生姜蛋白酶對牛肉的嫩化效果十分顯著，通過正交試驗確定生姜蛋白酶對牛肉嫩化的最佳工藝條件為酶用量0.06%、pH 7.0、處理溫度50 ℃、處理時間2 h。

干腌羊火腿，通過選料、修整腿坯、低溫腌制、洗脫鹽分、風(fēng)干發(fā)酵成熟等工序，用食鹽、亞硝酸鹽和蔗糖干腌而成，并以其獨特的風(fēng)味日益受到消費者喜愛。但其生產(chǎn)周期長、成本高、受特殊地區(qū)氣候條件限制，會影響火腿工業(yè)化生產(chǎn)。目前有關(guān)干腌火腿的研究主要在改善其生產(chǎn)工藝和內(nèi)原酶對其風(fēng)味的影響方面[12]；而利用外源酶，提高其嫩度并縮短其成熟期的研究鮮見報道。

本實驗選用質(zhì)量約為2.50～3.00 kg的巴什拜羊后腿肉，按不同添加量生姜蛋白酶制作干腌羊火腿，并以剪切力、pH值、水分含量、系水力、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值、總氮含量（total nitrogen，TN）、非蛋白氮（non-protein nitrogen，NPN）含量以及蛋白質(zhì)降解指數(shù)（proteolysis index，PI）等作為品質(zhì)特性指標(biāo)，通過單因素試驗確定生姜蛋白酶最佳濃度，為日后干腌羊火腿的工業(yè)化生產(chǎn)和生姜蛋白酶在肉制品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用新疆巴什拜羊，6～9 月齡公羊鮮后腿，購自烏魯木齊沙依巴克區(qū)和田街新朱蘭清牛羊肉配送中心。

生姜蛋白酶（酶活力≥800 U/mg） 上海鼓臣生物技術(shù)有限公司；氯化鉀、三氯乙酸、硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸、鹽酸、甲基紅、溴甲酚綠、硼酸、氫氧化鈉、硫代巴比妥酸、95%乙醇等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DK-8D電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司；雷磁PHS-3C pH計上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；721可見分光光度計上海菁華科技儀器有限公司；電子天平 上海上天精密儀器有限公司；TA XT plus物性測定儀 英國Stable Micro System公司；Avanti-J-26S XPI落地式高速冷凍離心機 美國Beckman Coulter有限公司；Food ALYT D4000凱氏定氮儀 德國Omnilab-Laborzentrum GmbH &Co.KG公司；FSH-2可調(diào)高速勻漿機 武漢格萊莫檢測設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 干腌羊火腿的制作與取樣

工藝流程：新鮮羊后腿→冷卻修整→低溫腌制→浸泡洗腿→吊掛風(fēng)干→成熟→成品。

羊腿的選擇和處理：選擇2.50～3.00 kg左右的新鮮羊后腿12 條，去除表面可見脂肪，修成琵琶狀。

低溫腌制：以羊腿質(zhì)量計，使用食鹽3%、亞硝酸鈉0.01%、蔗糖0.5%的比例混合后，分3 次撒在鮮腿表面揉搓，并在4～8 ℃腌制3 d。

酶處理：將腌制后的羊后腿隨機分為對照組和實驗組；再按實驗組羊腿質(zhì)量參照孫國梁[11]的方法分別注射生姜蛋白酶量0.01%、0.03%、0.05%，并在生姜蛋白酶最適酶活性溫度50 ℃滾揉處理1.5 h。

浸洗：將酶處理后的羊后腿，用溫度為10 ℃的凈水浸泡清洗2 h，除去羊腿表面的污物。

吊掛風(fēng)干：將浸洗后的羊腿晾干后，在相應(yīng)條件下進行吊掛風(fēng)干。風(fēng)干前期風(fēng)干條件為溫度10～12 ℃、相對濕度80%～85%、風(fēng)速0.8 m/s、時間5 d；風(fēng)干中期條件為溫度10～12 ℃、相對濕度75%～80%、風(fēng)速0.8 m/s、時間7 d；風(fēng)干后期條件為溫度14～15 ℃、相對濕度75%～85%、風(fēng)速0.8 m/s、時間8 d。

成熟：將風(fēng)干后的羊腿在溫度為16～18 ℃、相對濕度70%～75%、風(fēng)速0.5 m/s條件下成熟7 d。

取樣：以羊腿股二頭肌為采樣點，每組分別從鮮羊腿（0 d）、腌制（3 d）、風(fēng)干前期（8 d）、風(fēng)干中期（15 d）、風(fēng)干后期（23 d）、成熟期（30 d）6 個工藝點取樣分別記作I～VI，置于-20 ℃冷凍保藏，以備各指標(biāo)的測定。

1.3.2 剪切力的測定

將肌肉切成5 g左右的小塊，用TA XT plus物性分析儀測定6 個肉樣的剪切力并每個樣重復(fù)3 次。數(shù)值愈小，則肉愈嫩；反之，則肉愈老。

1.3.3 pH值的測定

參照GB 5009.237—2016《食品pH值的測定》。將5 g肉樣剁成碎末，并與5 倍體積的蒸餾水混合，高速勻漿機勻漿，室溫靜置10 min左右，將PHS-3C型pH計的玻璃電極直接插入肉水混合物內(nèi)，并在顯示屏上數(shù)字穩(wěn)定后，讀值。

1.3.4 水分含量的測定

參照GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》直接干燥法。

1.3.5 失水率與系水力的測定

取3 g左右的肉樣，切成小塊，精確稱量（m1），并放入50 mL離心管中2 000 r/min離心20 min，離心完后用濾紙吸取肉表面水分，再次稱量（m2），按公式（1）、

（2）計算其失水率和系水力：

1.3.6 TBA值的測定

按照Witte等[13]的方法，取5 g肉樣切碎于離心管中，加5 倍體積20% TCA溶液和3 倍體積蒸餾水，并用高速勻漿機勻漿60 s，靜置1 h，2 000 r/min離心10 min，過濾，用蒸餾水定容至50 mL，然后將5 mL濾液與0.02 mol/L TBA以體積比1∶1混合，并在100 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)20 min，取出用流動水冷卻5 min，然后用分光光度計測定其在532 nm和600 nm波長處的吸光度，并按公式（3）計算同時做空白實驗。

式中：A532nm為溶液在波長532 nm處的吸光度；A600nm為溶液在波長600 nm處的吸光度；155為摩爾吸光系數(shù)；m為樣品質(zhì)量；72.1為丙二醛的相對分子質(zhì)量。

1.3.7 PI的測定

TN含量測定：參照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》凱氏定氮法；NPN含量測定：參考朱健輝[14]的方法，并略作修改。將樣品自然解凍后，剔除可見脂肪和結(jié)蹄組織，切碎，稱取5 g左右（精確到0.01 g）于50 mL離心管中，加入40 mL蒸餾水，高速勻漿機勻漿3 次，于4 ℃放置1 h后，3 000 r/min離心15 min，用快速濾紙過濾，取10 mL濾液加入等體積的10%三氯乙酸溶液混合均勻，室溫靜置30 min，2 500 r/min離心15 min，過濾，取10 mL濾液用凱氏定氮消化。PI計算公式[15]如下：

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用SPSS 19.0軟件進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶添加量對剪切力的影響

圖 1 干腌羊火腿風(fēng)干過程中酶處理組和對照組剪切力的變化Fig. 1 Change in shear force of zingibain-treated and control groups during drying of dry-cured mutton ham

剪切力是測定肉嫩度的重要指標(biāo)[16]；肉類的食用品質(zhì)是由食用期間評估的嫩度、多汁性和風(fēng)味決定的[17]。剪切力越大，則嫩度越低；剪切力越小，則嫩度越高[13]。由圖1可知，隨著風(fēng)干時間的延長，干腌羊火腿剪切力總體呈上升趨勢，各組在風(fēng)干過程中的差異顯著（P＜0.05）；是由于在風(fēng)干期間羊火腿失水較多，導(dǎo)致其體積縮小，硬度和韌性逐漸增大，切割所需要的剪切力也較大。因此，隨著加工期的延長，剪切力值呈逐漸增大的趨勢；這與Monin等[18]的實驗結(jié)果相符。而且不同添加量生姜蛋白酶處理組剪切力都明顯低于對照組，并各組在風(fēng)干階段差異顯著（P＜0.05）；當(dāng)生姜蛋白酶添加量為0.05%時，干腌羊火腿30 d剪切力（2 898.82 g）比對照組（4 035.42 g）下降了28.17%；說明0.05%的生姜蛋白酶可明顯降低干腌羊火腿的剪切力，并隨之提高其嫩度；這是因為酶用量越大，反應(yīng)速度越快，單位時間內(nèi)酶對干腌羊火腿肌肉蛋白質(zhì)降解程度越大，因此嫩化效果也很好[19]。經(jīng)生姜蛋白酶處理的干腌羊火腿與未經(jīng)處理的火腿剪切力值相差較大，說明生姜蛋白酶添加對干腌羊火腿剪切力的影響顯著（P＜0.05）。

2.2 酶添加量對pH值的影響

圖 2 干腌羊火腿風(fēng)干過程中酶處理組和對照組pH值的變化Fig. 2 Change in pH value of zingibain-treated and control groups during drying of dry-cured mutton ham

pH值是評價肉質(zhì)的基本參數(shù)，是決定火腿微生物穩(wěn)定性的主要因素之一[20]。由圖2可知，生姜蛋白酶處理組和對照組pH值整體來看呈上升趨勢，各組在風(fēng)干過程中的差異顯著（P＜0.05）。0 d的pH值均為6.07，隨著風(fēng)干過程的延長，30 d對照組pH值上升為6.15，各階段差異顯著（P＜0.05）；這是由于在羊火腿風(fēng)干成熟過程中，內(nèi)源蛋白酶使蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生氨等堿性物質(zhì)增多，使得pH值呈現(xiàn)逐漸升高趨勢；本實驗結(jié)果與郇延軍等[21]對金華火腿加工過程中pH值的變化實驗結(jié)果相一致。而生姜蛋白酶添加量為0.01%、0.03%和0.05%的處理組pH值分別上升為6.18、6.23和6.40，明顯高于對照組，各組間差異顯著（P＜0.05）；可知，隨著生姜蛋白酶添加量的增加，pH值也隨之升高；這可能是因為在風(fēng)干成熟過程中，不同添加量的生姜蛋白酶使肌肉蛋白質(zhì)發(fā)生不同程度的降解使堿性物質(zhì)增多，從而使pH值呈上升趨勢。

2.3 酶添加量對水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

水分約占肉總量的70%～80%[22]，其含量和分布狀態(tài)直接影響到肉與肉制品的色澤、嫩度、多汁性和風(fēng)味等食用品質(zhì)，同時對肉與肉制品的加工特性和貯藏品質(zhì)有一定影響。

由圖3可知，隨著加工期的延長，不同添加量生姜蛋白酶處理組和對照組干腌羊火腿水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)都呈下降趨勢，并各組在風(fēng)干階段的差異顯著（P＜0.05）；這與García[23]和Huang Yechuan[24]等的研究結(jié)果相似。當(dāng)生姜蛋白酶添加量為0.01%和0.03%時，其水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)與對照組水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0 d的65.04%分別下降至30 d的40.19%、42.83%和46.96%，差異顯著（P＜0.05）；而生姜蛋白酶添加量為0.05%時，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)在23 d下降至44.71%，這相當(dāng)于其他3 組30 d的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，說明生姜蛋白酶添加量為0.05%時，干腌羊火腿在23 d就達到對照組與其他兩個添加量酶處理組30 d的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)。生姜蛋白酶降解肌肉蛋白質(zhì)，使肌肉蛋白組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，并使其系水力下降，從而使水分含量逐漸減少[25]；并使干腌羊火腿的成熟時間縮短至23 d。

2.4 酶添加量對系水力的影響

肉制品的保水性（系水力）是肌肉保持水分的能力，對肉的嫩度與多汁性有重要的影響[26]；失水率是表示肉制品的保水性的重要指標(biāo)[27]。

由圖4可知，隨著羊火腿風(fēng)干成熟時間的延長，失水率呈下降趨勢，且不同生姜蛋白酶處理組失水率較對照組高，且各組在各階段差異顯著（P＜0.05）；這與水分含量變化趨勢相反。

由圖5得知，在整個風(fēng)干過程中，羊火腿系水力逐漸下降，并各組間差異顯著（P＜0.05）這與羊火腿水分含量變化趨勢一致；隨著生姜蛋白酶對肌肉蛋白質(zhì)的降解時間的延長，肌肉蛋白組織結(jié)構(gòu)被破壞，從而使系水力下降[25]。

由圖4和圖5得知，隨著風(fēng)干過程的延長，干腌羊火腿的保水性逐漸下降，其水分含量與失水率呈負(fù)相關(guān)，水分含量越少，失水率越大；水分含量越大，則失水率越小。而與系水力呈正相關(guān)，水分含量越大，系水力越大；水分含量越少，則系水力越小[28]。

2.5 酶添加量對TBA值的影響

圖 6 干腌羊火腿風(fēng)干過程中酶處理組和對照組TBA值的變化Fig. 6 Change in TBA value in zingibain-treated and control groups during drying of dry-cured mutton ham

TBA值是以多不飽和脂肪酸氧化產(chǎn)物丙二醛為主體的醛類物質(zhì)與硫代巴比妥酸反應(yīng)在波長532 nm的吸光度；并且是檢測脂肪氧化程度的一個重要指標(biāo)[29]。由圖6得知，隨著風(fēng)干過程的延長，干腌羊火腿TBA值呈上升趨勢，各組在不同風(fēng)干階段差異顯著（P＜0.05）；且0～8 d脂肪氧化程度明顯比后面加工階段快，這可能是因為在腌制期間肌肉吸收的食鹽較多導(dǎo)致快速脂肪氧化。這與Kanner[30]和Ripollés等[31]的實驗結(jié)果一致，研究表明，一定濃度的NaCl可以促進脂肪的氧化，而鹽是在火腿腌制的過程中必不可少的，因此，即便不考慮外界因素的影響，火腿在腌制過程中也會發(fā)生一定程度的氧化反應(yīng)?？芍瑢φ战M與添加量為0.01%、0.03%、0.05%的生姜蛋白酶處理組的TBA值從第0天的0.04 mg/kg分別增加為第30天的0.38、0.39、0.40、0.42 mg/kg，各組間差異顯著（P＜0.05），0.05%生姜蛋白酶處理組第30天的TBA值是對照組的1.11 倍。生姜蛋白酶處理組TBA值明顯高于對照組，這是因為注射生姜蛋白酶后，將干腌羊火腿在其最佳溫度（50 ℃）保持1.5 h后，酶處理組受到高溫影響，導(dǎo)致脂肪氧化較對照組高，但均在國家標(biāo)準(zhǔn)和國際認(rèn)可的限量范圍內(nèi)（TBA值≤1 mg/kg）[32]。

2.6 酶添加量對TN質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

圖 7 干腌羊火腿風(fēng)干過程中酶處理組和對照組TN含量的變化Fig. 7 Change in TN in zingibain-treated and control groups during drying of dry-cured mutton ham

由圖7得知，TN質(zhì)量分?jǐn)?shù)總體呈上升趨勢，并各組在風(fēng)干過程中的差異顯著（P＜0.05）。相比于其他階段，3 d羊火腿TN質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降，這是因為上鹽過程中水溶性蛋白不斷流失所引起的[33]；在后期加工過程中逐漸回升，這與王晶[34]與Buscailhon等[35]的研究結(jié)果一致。當(dāng)生姜蛋白酶添加量為0.01%時，0 d的TN質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.80%（蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17.5%），30 d增加為3.62%（蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22.63%），這與對照組（3.59%）（蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22.44%）相比差異不大；而添加量為0.05%的羊火腿TN質(zhì)量分?jǐn)?shù)30 d增加至4.73%（蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為29.56%），是對照組30 d的1.32 倍，差異顯著（P＜0.05）。說明生姜蛋白酶添加量的增加可有效的影響羊火腿TN質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化。生姜蛋白酶可以通過降解肌肉蛋白質(zhì)形成小肽，提高TN含量，從而使羊火腿變得更嫩，提高其食用品質(zhì)。

2.7 酶添加量對NPN質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

圖 8 干腌羊火腿風(fēng)干過程中酶處理組和對照組NPN含量的變化Fig. 8 Change in NPN in zingibain-treated and control groups during drying of dry-cured mutton ham

NPN質(zhì)量分?jǐn)?shù)指除蛋白質(zhì)外的多肽、短肽及FAA等的總含量，這些物質(zhì)的大量增加主要是由于肌肉中蛋白質(zhì)發(fā)生了降解作用[36]。由圖8得知，隨著風(fēng)干過程的延長，不同添加量生姜蛋白酶處理組和對照組都呈現(xiàn)上升趨勢，且各組在各階段差異顯著。這是因為隨著時間的延長，羊火腿中蛋白質(zhì)發(fā)生降解成小肽和游離氨基酸，使非蛋白氮呈現(xiàn)逐漸增加趨勢；這與Soriano等[37]對法國干腌火腿加工過程中含氮物進行研究也發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)果。Martín等[38]對28 個火腿的理化成分變化規(guī)律進行分析，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)：NPN、TN質(zhì)量分?jǐn)?shù)在整個加工階段都持續(xù)上升。且不同添加量酶處理都高于對照組，各組間差異顯著（P＜0.05）；0.05%生姜蛋白酶處理組羊火腿NPN質(zhì)量分?jǐn)?shù)最多，其對照（第0天）NPN質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.20%，第30天增加為0.99%，是對照組第30天（0.59%）的1.68 倍，第23天（0.87%）增加為對照組成熟期的1.48 倍，而添加量為0.01%和0.03%的生姜蛋白酶處理組第30天分別增加為0.62%和0.79%；說明隨著生姜蛋白酶添加量的增加，蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生的FAA和多肽、短肽等的含量增加，從而導(dǎo)致NPN質(zhì)量分?jǐn)?shù)較對照組多[39]。

2.8 酶添加量對PI的影響

圖 9 干腌羊火腿風(fēng)干過程中酶處理組和對照組PI的變化Fig. 9 Change in PI in zingibain-treated and control groups during drying of dry-cured mutton ham

由圖9可知，PI隨著羊火腿風(fēng)干過程的延長而逐漸上升，各階段差異顯著（P＜0.05）；0.01%、0.03%、0.05%生姜蛋白酶處理組和對照組（第0天）PI為7.18%，第30天PI分別上升為17.03%、18.57%、21.06%和16.30%，酶處理組蛋白質(zhì)降解程度明顯高于對照組，第30天時，0.05%的酶處理組較對照組增加了1.29 倍，第23天（19.69%）增加至對照組23 d（15%）的1.31 倍，各組間差異顯著（P＜0.05）；說明不同添加量生姜蛋白酶的羊火腿的蛋白質(zhì)發(fā)生不同程度降解，而且添加量越大，肌肉蛋白質(zhì)降解程度越高。添加生姜蛋白酶雖然能加速蛋白質(zhì)的降解，但酶解過程中要對蛋白質(zhì)的降解程度進行嚴(yán)格控制。Careri等[40]通過對意大利Parma火腿中蛋白質(zhì)降解的研究發(fā)現(xiàn)，PI在22%～30%時，對火腿的質(zhì)地、風(fēng)味有積極影響。因此，添加量為0.05%的生姜蛋白酶處理組PI接近此范圍。

3 結(jié) 論

生姜蛋白酶對干腌羊火腿品質(zhì)特性指標(biāo)的影響顯著。通過分析PI和其他品質(zhì)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，生姜蛋白酶最佳添加量為0.05%；在此添加量下，生姜蛋白酶促進干腌羊火腿肌肉蛋白質(zhì)降解并破壞其組織結(jié)構(gòu)，從而降低蛋白質(zhì)的持水能力。因此，水分含量逐漸下降，而且添加0.05%生姜蛋白酶的處理組在風(fēng)干后期（23 d）達到對照組成熟期（30 d）的水分含量，從而將其成熟期縮短為23 d。