花青素與大豆分離蛋白的不同共價(jià)交聯(lián)法對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響

劉英杰，隋曉楠，黃 國(guó)，趙思明，徐 悅，劉貴辰，孫紅波，齊寶坤，江連洲*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）是一種全價(jià)植物蛋白，富含人體必需氨基酸。其營(yíng)養(yǎng)豐富，不含膽固醇，是植物蛋白中為數(shù)不多的可替代動(dòng)物蛋白的品種之一，目前被人類廣泛應(yīng)用于不同食品加工領(lǐng)域中[1-2]。據(jù)報(bào)道，SPI可以與其他某些食物成分發(fā)生相互作用，多酚就是其中一種[3]。多酚是一類廣泛存在于植物體內(nèi)且具有多元酚結(jié)構(gòu)的次生代謝物，根據(jù)其碳骨架的特征，可分為酚酸類、黃酮類、少見(jiàn)的芪類和木脂素類。而花青素就屬于一種常見(jiàn)的水溶性黃酮類化合物，普遍存在于水果和蔬菜中[4-5]。其具有抗氧化、抗炎等生物學(xué)活性；并對(duì)肥胖癥、糖尿病、胸膜炎等疾病患者的治療起重要作用[6-7]。目前科學(xué)研究表明，花青素作為一種小分子物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)具有獨(dú)特的理化性質(zhì)，在食品加工及生產(chǎn)過(guò)程中，能與多種化合物發(fā)生交互作用，其中蛋白質(zhì)是最主要的化合物[8]。

研究表明蛋白質(zhì)與多酚相互作用主要通過(guò)兩種方式：可逆的非共價(jià)作用和不可逆的共價(jià)交聯(lián)[5]。其中蛋白與多酚的非共價(jià)作用通過(guò)形成氫鍵、范德華力、π鍵、疏水作用和離子相互作用實(shí)現(xiàn)[9-11]。而共價(jià)交聯(lián)則主要分為生物共價(jià)交聯(lián)法和化學(xué)共價(jià)交聯(lián)法，其原理為酚類物質(zhì)在有多酚氧化酶或堿性（pH 9）條件下，可以被酶或氧氣分子氧化從而形成醌類物質(zhì)，其醌類物質(zhì)可以與蛋白質(zhì)多肽鏈上的氨基酸和巰基形成C—N鍵和C—S鍵，從而完成兩者的共價(jià)交聯(lián)[12-13]。

本課題組研究發(fā)現(xiàn)，SPI與花青素可以形成非共價(jià)鍵及共價(jià)鍵，并就兩者在堿性條件下發(fā)生的共價(jià)交聯(lián)作用對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)及界面蛋白性質(zhì)的影響進(jìn)行剖析[14-15]。Chung等[16]研究發(fā)現(xiàn)在多酚氧化酶（漆酶）存在條件下，兒茶素可以被氧化形成醌類物質(zhì)，從而與明膠發(fā)生共價(jià)交聯(lián)。Ali等[12]分別利用化學(xué)堿法和生物酶法對(duì)β-乳球蛋白與綠原酸進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)處理，結(jié)果表明兩種共價(jià)交聯(lián)方式都使β-乳球蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，且化學(xué)堿法對(duì)β-乳球蛋白產(chǎn)生的影響大于生物酶法。但是目前在探究蛋白質(zhì)與多酚相互作用的文獻(xiàn)中，兩者之間共價(jià)交聯(lián)的研究相對(duì)較少[13]且多數(shù)局限于單一共價(jià)交聯(lián)方法，關(guān)于生物共價(jià)交聯(lián)法和化學(xué)共價(jià)交聯(lián)法在同一食品基質(zhì)中對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響差異解析不夠明確，尤其是花青素與SPI。

由此，為更加明確地了解SPI與花青素共價(jià)交聯(lián)對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響，本實(shí)驗(yàn)選用兩種常見(jiàn)的共價(jià)交聯(lián)機(jī)制——生物酶法和化學(xué)堿法對(duì)不同質(zhì)量濃度花青素與SPI進(jìn)行共價(jià)處理，并就兩種共價(jià)交聯(lián)方式對(duì)SPI結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響進(jìn)行比較，同時(shí)探究添加不同質(zhì)量濃度花青素后對(duì)SPI結(jié)構(gòu)的改變。旨在為SPI與花青素共價(jià)交聯(lián)作用的研究提供重要指導(dǎo)意義，這些研究的積極成果將使人們更加直觀及深入地了解生物酶法與化學(xué)堿法對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響，為SPI在食品中的合理應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆 市售；SPI由實(shí)驗(yàn)室自制；花青素黑米提取物陜西天之潤(rùn)生物科技有限公司；乙腈、甲酸（均為色譜純） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；漆酶 河北仟盛生物科技有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 北京新光化工試劑廠；正己烷、乙酸乙酯、甲醇 天津北科化學(xué)品有限責(zé)任公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GL-25MS超速高速冷凍離心機(jī) 上海盛析儀器設(shè)備有限公司；WAT023635高效液相色譜儀、SunFire C18反向色譜柱（250 mm×4.6 mm）美國(guó)Waters公司；傅里葉紅外光譜儀 美國(guó)尼高麗公司；Tecan Infinite 200 Pro酶標(biāo)儀 瑞士帝肯公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI的制備

參考Petruccelli等[17]的制備方法。大豆去皮粉碎后過(guò)60 目篩網(wǎng)，用豆粉-正己烷（1∶3（g/mL））對(duì)篩選后的豆粉進(jìn)行3 次脫脂。得到的脫脂豆粉與去離子水（1∶20（g/mL））混合后，用NaOH溶液（2 mol/L）將混合溶液的pH值調(diào)節(jié)至8，在室溫?cái)嚢? h，將其懸浮液在4 ℃、10 000×g離心20 min，取其上清液用鹽酸溶液（2 mol/L）調(diào)節(jié)pH值至4.5后靜置1 h，在4 ℃、6 000×g離心20 min，得到蛋白沉淀物，將蛋白沉淀物用去離子水水洗3次后溶解，用NaOH溶液（2 mol/L）調(diào)節(jié)蛋白溶液pH 7，將此蛋白溶液凍干并研磨，即可得到SPI。

1.3.2 花青素的提純與定量分析

參考Rodriguez-Saona等[18]的方法對(duì)黑米提取物進(jìn)行提純，用去離子水溶解黑米提取物后，將其抽濾。將濾液通過(guò)固相萃取柱以吸附花青素，后用2 倍柱體積的酸化水洗脫樣品中不溶性成分，用2 倍柱體積的乙酸乙酯溶液洗脫樣品中除花青素外的多酚類雜質(zhì)，最后用酸化的甲醇溶液洗脫吸附于柱上的花青素。將此溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以去除甲醇，即可得到花青素提純物。采用高效液相色譜法對(duì)純化后的花青素進(jìn)行定量分析[19]，取花青素提純物過(guò)0.45 μm濾膜后用C18色譜柱聯(lián)合高效液相色譜設(shè)備進(jìn)行分析，流量1 mL/min，溫度25 ℃，進(jìn)樣體積50 μL，檢測(cè)器波長(zhǎng)520 nm，梯度洗脫條件根據(jù)Sui Xiaonan[19]的方法，同時(shí)為方便計(jì)算，本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)一使用矢車菊素-3-葡萄糖苷（黑米提取物中花青素主要成分）質(zhì)量濃度為花青素質(zhì)量濃度做近似處理。

1.3.3 SPI與花青素共價(jià)聚合物的制備

參考Prigent等[20]的方法并稍作修改。用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）配制質(zhì)量濃度為10 g/L的SPI溶液，分別加入不同質(zhì)量濃度（0.17、0.25、0.5 g/L）的花青素后，加入漆酶溶液（10 U）避光攪拌24 h。參照Rohn等[21]的方法，用0.01 mol/L PBS配制質(zhì)量濃度為10 g/L的SPI溶液，分別加入不同質(zhì)量濃度（0.17、0.25、0.5 g/L）的花青素后，調(diào)節(jié)溶液pH 9.0后避光攪拌24 h。將6 組反應(yīng)后的樣品透析48 h（截留分子質(zhì)量8～10 kDa），每隔8 h換水一次以確保未反應(yīng)的游離多酚完全透析出去。將透析液凍干，即可得到共價(jià)交聯(lián)聚合樣品。

1.3.4 共價(jià)結(jié)合率的測(cè)定

花青素與SPI的共價(jià)結(jié)合率及共價(jià)交聯(lián)花青素含量的測(cè)定參考本課題組之前的研究[15]方法并稍作修改，將所有未經(jīng)透析的SPI-花青素共價(jià)聚合物樣品放入分子截留量為8～10 kDa的透析袋中，并將透析袋放入蒸餾水中在4 ℃透析24 h，后取其透析液用高效液相色譜測(cè)定透析液中游離花青素的含量，測(cè)定方法與上述花青素定量方法一致?；ㄇ嗨嘏cSPI的共價(jià)結(jié)合率及共價(jià)交聯(lián)花青素含量（以SPI計(jì)）的計(jì)算公式如下：

1.3.5 游離巰基含量的測(cè)定

參考Beveridge等[22]的方法并稍作修改。將75 mg樣品溶解于10 mL含有1 mmol/L EDTA和1% SDS的PBS中（0.1 mol/L，pH 8.0），取3 mL樣品溶液加入3 mL上述PBS，再加入0.1 mL Ellman's試劑，混勻后于25 ℃條件下水浴1 h，將其混合物在10 000×g離心30 min，取上清液在412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。其中以不加Ellman's試劑的混合液為空白。用公式（3）計(jì)算巰基的含量：

式中：A412nm為在412 nm波長(zhǎng)處的吸光度；C為樣品質(zhì)量濃度/（mg/mL）；D為稀釋倍數(shù)；73.53=106/（1.36×104），其中 1.36×104為摩爾吸光系數(shù)。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜分析

參考劉勤勤等[23]的方法，將樣品粉末與溴化鉀粉末按1∶100的比例混合后壓片，在分辨率為4 cm-1條件下掃描64 次，600～4 000 cm-1波數(shù)譜段范圍內(nèi)記錄紅外光譜。

1.3.7 紫外-可見(jiàn)光譜分析

參考劉勤勤等[23]的方法稍作修改。用PBS（0.01 mol/L，pH 7）溶解樣品使蛋白質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，取200 μL樣品溶液置于96 孔板中，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)掃描260～350 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收光譜。

1.3.8 熒光光譜分析

根據(jù)Roy等[10]的方法稍加修改。用PBS（0.01 mol/L，pH 7）溶解樣品使蛋白質(zhì)量濃度0.2 mg/mL，取200 μL樣品溶液置于96 孔板中用酶標(biāo)儀進(jìn)行熒光測(cè)定。其中，起始激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，掃描波長(zhǎng)為310～500 nm，發(fā)射光帶寬20 nm，激發(fā)光帶寬10 nm。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

實(shí)驗(yàn)每組數(shù)據(jù)重復(fù)3次，利用Origin 8.0軟件處理數(shù)據(jù)作圖。利用SPSS V17.0軟件進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析及相關(guān)性分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 共價(jià)結(jié)合率分析

圖 1 生物酶法和化學(xué)堿法條件下花青素與SPI的共價(jià)相互作用分析圖Fig. 1 Analysis of covalent interaction betweenanthocyanin and SPI under enzymatic and alkaline conditions

應(yīng)用反相高效液相色譜法測(cè)定花青素與SPI共價(jià)聚合物中游離花青素的含量，進(jìn)而對(duì)兩種共價(jià)交聯(lián)方式下的花青素-SPI共價(jià)聚合物中共價(jià)交聯(lián)花青素含量及兩者的共價(jià)結(jié)合率進(jìn)行評(píng)估。如圖1所示，在漆酶氧化條件下，花青素與SPI的共價(jià)結(jié)合率在97.0%～98.0%之間，比堿性條件下（pH 9）共價(jià)交聯(lián)的花青素與SPI的共價(jià)結(jié)合率（93.0%～95.5%）高（P＜0.05）。但總體來(lái)看，無(wú)論是在生物酶法氧化還是化學(xué)堿法氧化條件下，多酚與蛋白的共價(jià)結(jié)合率都相對(duì)較高（93.0%～98.0%），這主要是因?yàn)榉宇惢衔镌诙喾友趸富驂A性條件下，容易被氧氣分子氧化從而形成相應(yīng)的醌類物質(zhì)，所得醌類可與親核試劑（蛋白質(zhì)上的側(cè)鏈基團(tuán)）發(fā)生親核反應(yīng)以形成比較強(qiáng)而且穩(wěn)定的共價(jià)鍵[24-25]，進(jìn)而使花青素醌牢牢綁定SPI。

由圖1可知，在同一共價(jià)交聯(lián)方式下，共價(jià)交聯(lián)花青素含量隨花青素質(zhì)量濃度升高而升高，這主要是因?yàn)橥还矁r(jià)處理?xiàng)l件下，不同質(zhì)量濃度花青素與SPI的共價(jià)結(jié)合率幾乎相同（生物酶法：97.0%～98.0%；化學(xué)堿法：93.0%～95.5%），所以共價(jià)聚合物中花青素的質(zhì)量濃度越高，共價(jià)交聯(lián)花青素含量越高。而且，圖1表明LC1共價(jià)交聯(lián)花青素含量高于AC1 3.87%，LC2高于AC2 2.58%，LC3高于AC3 4.43%。上述結(jié)果表明在漆酶氧化條件下，花青素與SPI可以發(fā)生更強(qiáng)的共價(jià)相互作用。由此，推測(cè)其原因是在氧氣存在的情況下，多酚氧化酶（漆酶）可以更完全地氧化花青素形成相應(yīng)的花青素醌。

2.2 游離巰基含量分析

圖 2 生物酶法和化學(xué)堿法條件下花青素與SPI的共價(jià)相互作用對(duì)蛋白游離巰基含量的影響

蛋白質(zhì)中的巰基基團(tuán)具有很高的反應(yīng)活性，對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能特性有重要影響[26]。如圖2所示，使用生物酶法與化學(xué)堿法共價(jià)交聯(lián)花青素與SPI后，明顯降低了SPI的游離巰基含量（P＜0.05）。同時(shí)，隨著花青素質(zhì)量濃度升高，所有樣品的游離巰基基團(tuán)含量呈現(xiàn)持續(xù)降低趨勢(shì)。尤其是在多酚氧化酶（漆酶）存在的條件下，當(dāng)花青素質(zhì)量濃度為0.5 g/L時(shí)，相比較于天然SPI，樣品的游離巰基含量降低了66.73%，并且其降低程度明顯高于同質(zhì)量濃度花青素在堿性條件下對(duì)SPI游離巰基含量的影響（P＜0.05）。這是因?yàn)樵谏锩阜ㄑ趸╬H 7）和化學(xué)堿法氧化（pH 9）條件下，花青素容易被氧化為相應(yīng)的醌，其醌類物質(zhì)能夠與SPI側(cè)鏈的游離巰基基團(tuán)發(fā)生親核反應(yīng)，從而形成C—S鍵，進(jìn)而使SPI的游離巰基基團(tuán)的含量降低[27]，而且在生物酶法條件下，花青素能夠更加完全地被氧化成相應(yīng)的醌，從而與SPI發(fā)生更強(qiáng)的共價(jià)交聯(lián)，更大程度地降低了SPI的游離巰基含量。

2.3 傅里葉變換紅外光譜分析

圖 3 花青素與SPI共價(jià)聚合物的傅里葉紅外光譜圖Fig. 3 FT-IR spectra of for the covalent conjugates of anthocyanin and SPI

傅里葉變換紅外光譜法是一種研究蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象變化的常用技術(shù)[28]，其中酰胺I帶（1 700～1 600 cm-1）紅外吸收峰的變化可以反映蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。研究文獻(xiàn)表明，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)與各子峰間波數(shù)的對(duì)應(yīng)關(guān)系為：α-螺旋：1 646～1 664 cm-1；β-折疊：1 615～1 637 cm-1和1 682～1 700 cm-1；β-轉(zhuǎn)角：1 664～1 681 cm-1；無(wú)規(guī)卷曲：1 637～1 645 cm-1。圖3顯示了天然SPI以及不同質(zhì)量濃度花青素-SPI共價(jià)聚合物的傅里葉紅外光譜圖，如圖3A和圖3B所示，不同質(zhì)量濃度花青素的添加都降低了SPI酰胺I帶的吸光度，并且致使SPI酰胺I帶的紅外吸收峰發(fā)生不同程度的藍(lán)移，這表明不同質(zhì)量濃度花青素對(duì)SPI的共價(jià)交聯(lián)作用不同程度地改變了蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)[29]。當(dāng)花青素質(zhì)量濃度為0.5 g/L時(shí)，將生物酶法和化學(xué)堿法兩種共價(jià)交聯(lián)方式下的花青素-SPI共價(jià)聚合物與天然SPI的傅里葉紅外光譜圖進(jìn)行比較。如圖3C所示，在添加同質(zhì)量濃度（0.5 g/L）的花青素條件下，不同共價(jià)交聯(lián)方式處理花青素與SPI致使天然SPI酰胺I帶的紅外吸收峰發(fā)生藍(lán)移的程度也不同（生物酶法：1 634.38 cm-1藍(lán)移至1 631.97 cm-1；化學(xué)堿法：1 634.38 cm-1藍(lán)移至1 632.93 cm-1），這表明不同共價(jià)交聯(lián)方式可以不同程度地改變蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

同時(shí)利用peakfit對(duì)蛋白的酰胺I帶進(jìn)行去卷積，二階求導(dǎo)，采用Gauss面積法擬合曲線并計(jì)算得出蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的種類與含量[29]，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表1。

表 1 花青素-SPI共價(jià)聚合物中蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Table 1 Contents of protein secondary structures in the covalent conjugates of anthocyanin and SPI %

如表1所示，與天然SPI相比，所有添加花青素樣品的SPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量都發(fā)生了改變，其中α-螺旋和β-折疊含量降低，β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲含量明顯升高（P＜0.05），這可能是由于蛋白質(zhì)的α-螺旋和β-折疊逐漸轉(zhuǎn)換為β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲。這與之前的研究[30]結(jié)果一致。在添加同質(zhì)量濃度花青素條件下，生物酶法交聯(lián)得到的花青素-SPI共價(jià)聚合物比化學(xué)堿法交聯(lián)得到的聚合物增加β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲含量的趨勢(shì)更加明顯（P＜0.05），這表明生物酶法共價(jià)交聯(lián)作用比化學(xué)堿法共價(jià)交聯(lián)作用解折疊蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的能力更強(qiáng)，可以更大程度地使部分蛋白結(jié)構(gòu)展開(kāi)[15]。

2.4 紫外-可見(jiàn)光譜分析

圖 4 生物酶法和化學(xué)堿法條件下花青素與SPI共價(jià)聚合物的紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖Fig. 4 UV-Vis absorption spectra of the covalent conjugates of anthocyanin and SPI under enzymatic and alkaline conditions

蛋白質(zhì)的吸收光譜在290 nm左右處有一個(gè)主要的吸收峰，代表蛋白質(zhì)的芳香族氨基酸π-π*躍遷[31]。如圖3所示，花青素的添加使SPI的紫外-可見(jiàn)吸收光譜峰值升高，且在同一種共價(jià)交聯(lián)方式條件下，SPI的吸收光譜峰值隨花青素的質(zhì)量濃度升高而增加。但在同一質(zhì)量濃度花青素條件下，生物酶法交聯(lián)的花青素-SPI共價(jià)聚合物比化學(xué)堿法交聯(lián)的聚合物峰值高。值得注意的是，花青素的添加不僅改變了SPI吸收光譜的峰值，而且使得SPI的紫外吸收光譜在290 nm波長(zhǎng)處的峰位發(fā)生了藍(lán)移，尤其在花青素質(zhì)量濃度為0.5 g/L，生物酶法交聯(lián)的聚合物峰位藍(lán)移最為明顯，由波長(zhǎng)290 nm藍(lán)移至287 nm。

研究表明，蛋白質(zhì)吸收峰峰值的大小主要反映了蛋白質(zhì)分子與其他小分子的相互作用的強(qiáng)弱，而蛋白質(zhì)吸收峰峰位的改變主要是由于蛋白質(zhì)微環(huán)境的疏水性發(fā)生改變所引起的，并且蛋白質(zhì)微環(huán)境疏水性的改變會(huì)引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化[13]。根據(jù)圖4結(jié)果可知，花青素使SPI芳香族氨基酸處的微環(huán)境發(fā)生了改變，進(jìn)而誘導(dǎo)SPI多肽鏈伸展，發(fā)生解折疊。同一共價(jià)交聯(lián)方式下，隨著花青素質(zhì)量濃度升高，花青素與SPI的共價(jià)相互作用越強(qiáng)；而同一質(zhì)量濃度花青素條件下，生物酶法交聯(lián)比化學(xué)堿法交聯(lián)更能促進(jìn)花青素與SPI的共價(jià)相互作用。

2.5 熒光光譜分析

圖 5 生物酶法和化學(xué)堿法條件下花青素與SPI共價(jià)聚合物的熒光光譜圖Fig. 5 Emission fluorescence spectra of the covalent conjugates of anthocyanin and SPI under enzymatic and alkaline conditions

蛋白質(zhì)被認(rèn)為具有固有的發(fā)射熒光，主要是由于它們的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基。激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm時(shí)，苯丙氨酸可以忽略，當(dāng)這些芳香族殘基暴露于不同的溶劑條件下時(shí)，熒光發(fā)射光譜特征會(huì)改變[13]。如圖5所示，花青素與SPI的共價(jià)交聯(lián)使得SPI的熒光強(qiáng)度發(fā)生了猝滅現(xiàn)象，并且花青素質(zhì)量濃度越高，SPI的熒光強(qiáng)度猝滅現(xiàn)象越明顯。同一花青素質(zhì)量濃度，生物酶法條件下花青素對(duì)SPI熒光強(qiáng)度的猝滅程度高于化學(xué)堿法條件。這說(shuō)明生物酶法條件下和化學(xué)堿法條件下花青素與SPI發(fā)生了相互作用，可能是因?yàn)榛ㄇ嗨匮趸纬傻孽愇镔|(zhì)上的C與SPI芳香族氨基酸的自由氨基（—NH2）的N發(fā)生親核反應(yīng)形成C—N鍵，從而導(dǎo)致蛋白發(fā)色基團(tuán)的減少，使得SPI的熒光強(qiáng)度下降，并且兩者在生物酶法條件下的相互作用強(qiáng)于在化學(xué)堿法條件下的反應(yīng)。而且不同質(zhì)量濃度花青素對(duì)SPI的交聯(lián)使得SPI的λmax發(fā)生不同程度的紅移，使其從328 nm紅移至334 nm，這表明花青素與SPI的共價(jià)相互作用誘導(dǎo)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生解折疊，并且使得SPI的主要發(fā)色基團(tuán)色氨酸暴露于較為親水環(huán)境中[32]。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用生物酶法和化學(xué)堿法共價(jià)交聯(lián)花青素與SPI，運(yùn)用不同的色譜和光譜手段探究?jī)煞N共價(jià)交聯(lián)方式對(duì)SPI結(jié)構(gòu)的影響。研究得出以下結(jié)論：1）加入同質(zhì)量濃度花青素，相較于化學(xué)堿法來(lái)說(shuō)，生物酶法共價(jià)處理使花青素與SPI的結(jié)合率更高。2）花青素對(duì)SPI的共價(jià)交聯(lián)降低了蛋白質(zhì)中的游離巰基含量，且花青素質(zhì)量濃度越高，樣品中游離巰基含量越少；生物酶法交聯(lián)的花青素-SPI共價(jià)聚合物比化學(xué)堿法交聯(lián)的聚合物巰基含量少。3）傅里葉變換紅外光譜表明共價(jià)交聯(lián)處理下，隨著花青素質(zhì)量濃度升高，蛋白α-螺旋和β-折疊含量逐漸降低，β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲含量逐漸升高，花青素進(jìn)而誘導(dǎo)蛋白質(zhì)解折疊，而生物酶法處理的樣品中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的改變比化學(xué)堿法更明顯。4）紫外-可見(jiàn)吸收光譜和熒光光譜表明花青素對(duì)SPI的共價(jià)交聯(lián)使得SPI的紫外吸收值升高，熒光強(qiáng)度下降、最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生改變，而上述趨勢(shì)，生物酶法交聯(lián)的花青素-SPI共價(jià)聚合物展現(xiàn)的更為顯著，這表明花青素可以改變SPI芳香族氨基酸殘基的微環(huán)境，使SPI多肽鏈解折疊，進(jìn)而使其三級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象發(fā)生改變，而同質(zhì)量濃度花青素下，生物酶法較化學(xué)堿法使得花青素與SPI共價(jià)相互作用更強(qiáng)，花青素能更大程度地改變蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

以上結(jié)果為生物酶法和化學(xué)堿法處理花青素與SPI對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響的差異提供了部分參考，使多酚與蛋白復(fù)合食品的合理應(yīng)用有一定的理論依據(jù)。