新型抗肝癌化合物CBI-5725對RAF/MEK/ERK通路及癌細胞凋亡的影響

王 威，徐 波，閆素英*

0 引言

肝細胞癌(HCC)被認為是世界第六大常見癌癥，也是癌癥相關死亡的第三大原因[1]。并且，由于肝癌是由慢性肝病引起的，經常在晚期時才被診斷出來，因此,藥物是晚期肝癌患者治療的主要手段之一。化療藥物如多柔比星是目前用于治療肝癌的主要藥物;然而，這些具細胞毒性的藥物是非選擇性的，并能引起嚴重的毒副作用[2]。因此，研究人員開始研究靶向治療藥物。索拉非尼(Sorafenib)是唯一獲得批準的適用于HCC患者的一線靶向藥物[2]。其通過抑制RAF激酶(突變體、野生型的B-RAF和C-RAF)，阻礙RAF/MEK/ERK信號通路，從而抑制腫瘤增殖[3]。此外，索拉非尼強烈抑制促進血管生成的酪氨酸激酶受體(Receptor tyrosine kinase,RTK)，如血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)、血管內皮生長因子受體3(VEGFR 3)、血小板衍生生長因子受體-β(PDGFR-β)、Flt3和c-Kit[4]。除了阻斷RAF/MEK/ERK通路外，索拉非尼還能誘導肝癌細胞PLC/PRF/5的凋亡，與caspase的活化無關[3]。盡管索拉非尼是可以延長晚期HCC患者總生存時間的唯一可用的治療藥物，但隨之而來的耐藥性通常阻礙其長期療效[5]。隨著索拉非尼的出現(xiàn)，研究者已經對一系列藥物(主要是分子靶向藥物)進行了臨床研究，然而，除了瑞格非尼(Regorafenib)、樂伐替尼(Lenvatinib)外，其他藥物試驗均以失敗告終[6]。CBI-5725是一種新型雙芳基脲，中美冠科生物技術有限公司(Crown Bioscience Inc.China)擁有其專利。本研究，評估了該化合物的體外和體內的抗肝癌作用，探討了CBI-5725的抗肝癌機制。

1 材料

1.1 儀器 酶標儀/分光光度計(德國Fluostar Optima BMG公司)；成像分析系統(tǒng)(美國UVP公司)；倒置顯微鏡(日本YMPUS IMT-2公司)；60 mm×15 mm組織培養(yǎng)皿(美國Nunclon)；凝膠電泳儀、濕式轉膜儀(美國Bio-Rad公司)；EC3成像系統(tǒng)(美國UVP)；普通離心機(德國Hettish Rotofix32公司)；流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)。

1.2 化合物與試劑 索拉非尼購自Selleck (中國，上海藍木)，CBI-5725由中美冠科生物技術有限公司(Crown Bioscience Inc.China)合成。見圖1。化合物均溶解在100%的DMSO(德國AppliChem公司)中，并用含10%胎牛血清(奧地利PAA公司)的培養(yǎng)基MEM[中國邁晨科技(北京)有限公司]稀釋成不同濃度，并使DMSO最終濃度為0.1%。用DMSO作為溶劑對照處理細胞，最終濃度為0.1%(v/v)。AlamarBlue試劑購自美國Thermo Fisher Scientific公司，0.1 mmol/L釩酸鹽購自美國Santa Cruz公司，蛋白酶抑制劑混合片劑購自瑞士Roche公司，RIPA裂解緩沖液購自美國Applgene公司，牛血清白蛋白(BSA)購自美國Amresco公司，磷酸化B-RAF(pB-RAF)、磷酸化C-RAF(pC-RAF)、磷酸化MEK(p-MEK)、磷酸化ERK(p-ERK)、相應的非磷酸化蛋白、GAPDH、caspase-3和PARP抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司。山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗購自美國Santa Cruz公司。Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自上海生工Sangon Biotech公司。

圖1 CBI-5725化學結構式

1.3 細胞 人肝癌細胞系PLC/PRF/5購自中國食品藥品檢定研究院。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) PLC/PRF/5細胞培養(yǎng)于MEM培養(yǎng)液,臨用時加入10%的胎牛血清，然后置于37 ℃ 溫箱，5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

2.2 AlarmaBlue檢測化合物對細胞增殖的影響 取對數(shù)生長期的細胞，0.25%胰酶消化液消化制成單細胞懸液，以最佳濃度5×104/ml 接種于無菌96孔培養(yǎng)板中，100 μl/孔，各實驗組均設置3個復孔。置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱孵育24 h。棄掉原培養(yǎng)液，用PBS清洗一遍，再加入按3倍倍比稀釋成不同濃度(0、0.007 6、0.022 9、0.068 6、0.205 8、0.617 3、1.85、5.55、16.7、50 μmol/L)的索拉非尼或CBI-5725各100 μl,并使DMSO最終濃度為0.1%，溶劑對照組加入0.1%(v/v)的DMSO。每一濃度均設3個重復孔，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h,每孔加入AlarmaBlue 10 μl,繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h。用多功能酶標儀在595 nm波長處測定每孔的熒光強度值。繪制熒光強度值與藥物濃度之間的曲線，計算IC50。

2.3 Western blot法檢測細胞中pB-RAF、pC-RAF、pMEK、pERK1/2、caspase-3、PARP、Akt蛋白表達 取對數(shù)生長期的細胞，0.25%胰酶消化液消化制成單細胞懸液，以6×105個細胞/皿的密度接種于60 mm×15 mm組織培養(yǎng)皿中。置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱孵育24 h。之后，將細胞用無血清培養(yǎng)基洗滌一次，并用不同濃度的索拉非尼或CBI-5725處理2 h。用含有0.1 mmol/L釩酸鹽的預冷PBS洗滌細胞以抑制脫磷酸化，然后用含有蛋白酶抑制劑混合片劑的RIPA裂解緩沖液裂解細胞。離心裂解物后，將90 μg可溶性蛋白質經十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離。采用半干式電轉印法將蛋白轉入聚偏氟乙烯膜，在10%牛血清白蛋白(BSA)(磷酸化蛋白質)或10%脫脂奶室溫封閉轉印1 h，放入雜交袋中，加入一抗稀釋液(1∶1 000)，封口，4 ℃孵育過夜，隨后洗膜3次，每次10 min；加入HRP標記的二抗，室溫放置1 h后洗膜3次，每次10 min。用增強化學發(fā)光法處理膜，并通過EC3成像系統(tǒng)檢測蛋白質信號。用Image-Pro Plus Version 6.0軟件進行分析，試驗重復3次。

2.4 Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測化合物對細胞凋亡的影響 取對數(shù)生長期的細胞，0.25%胰酶消化液消化制成單細胞懸液，以2×105個細胞/孔的密度接種于6孔板中。置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱孵育24 h。用不同濃度的化合物處理細胞24 h 或48 h，細胞凋亡刺激完畢后，離心，收集細胞，用預冷的PBS洗滌細胞兩次，然后重懸于500 μl結合緩沖液中。 向細胞中加入5 μl的Annexin V-FITC，并在室溫下溫育10 min。 隨后，加入5 μl碘化丙啶(PI)，將細胞避光孵育10 min，隨即進行流式細胞儀檢測。

2.5 小鼠腫瘤模型實驗 雄性NCr-nu/nu小鼠，5周齡，購自Vital River(中國北京)公司。小鼠被安置并隨意接受水和食物。根據(jù)宣武醫(yī)院動物倫理委員會批準的方案進行使用這些小鼠的實驗。取對數(shù)生長期的PLC/PRF/5細胞，用胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen，USA)消化制成單細胞懸液。PLC/PRF/5細胞(5×106)懸浮于含50%基質膠(BD Biosciences，USA)的無血清培養(yǎng)基中，被注射入每只老鼠的背側。甲苯磺酸索拉非尼(Sorafenib tosylate)和CBI-5725溶解于聚氧乙烯蓖麻油EL(Cremophor EL)/95%乙醇(50∶50; Sigma-Aldrich，USA)中。當PLC/PRF/5腫瘤達到200～220 mm3時，口服給藥，每日1次，持續(xù)14 d，劑量為甲苯磺酸索拉非尼(Sorafenib tosylate)8 mg/kg或20 mg/kg，CBI-5725 2 mg/kg或6 mg/kg或15 mg/kg。使用游標卡尺測量腫瘤，通過測量最長(a)和最短(b)直徑來確定腫瘤體積，并使用公式a×b2×π/6來計算腫瘤體積。

3 結果

3.1 CBI-5725對細胞增殖的影響 在本研究中，采用AlamarBlue測定索拉非尼或CBI-5725對人肝癌PLC/PRF/5細胞系增殖的抑制作用。不同濃度索拉非尼或CBI-5725對PLC/PRF/5細胞增殖的影響見圖2。結果顯示，兩種藥物均能明顯抑制細胞的生長，并且，隨著劑量的增加，抑制作用逐漸增強，具有濃度依賴性。在本研究中，CBI-5725作用于PLC/PRF/5細胞系的IC50是(0.83±0.09)μmol/L，索拉非尼作用于PLC/PRF/5細胞系的IC50是(4.99±0.13)μmol/L，CBI-5725對PLC/PRF/5細胞的抑制效果高于索拉非尼，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖2 CBI-5725或索拉非尼對PLC/PRF/5細胞的抑制作用

3.2 CBI-5725對細胞中pB-RAF、pC-RAF、pMEK、pERK、pAkt蛋白表達的影響 絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是調節(jié)正常細胞增殖、存活和分化的關鍵信號蛋白[7]。 MAPK通路通過三級激酶級聯(lián)的形式傳導細胞外信號，即從RAF激酶→MEK激酶→ERK激酶發(fā)起的級聯(lián)磷酸化過程[8]。MAPK信號通路的失調在肝細胞癌(HCC)發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[9]。蛋白表達圖見圖3，測定結果見圖4。每個磷酸化蛋白與內參蛋白的比例通過單因素方差分析(ANOVA)進行檢驗，然后進行Tukey事后檢驗。如圖3所示，在2 h 作用時間下，與對照組相比，索拉非尼或CBI-5725對pB-RAF的表達均沒有影響，但均能使pC-RAF表達水平隨著化合物濃度的增加而顯著增加。雖然CBI-5725和索拉非尼都增強了C-RAF的磷酸化，但兩者都以劑量依賴性方式抑制MEK和ERK的磷酸化，表明CBI-5725和索拉非尼都是泛RAF激酶抑制劑。

無論是CBI-5725還是索拉非尼,都沒有影響總的RAF、MEK、ERK和Akt表達，而且Akt的磷酸化也沒有發(fā)生變化。圖4顯示，CBI-5725和索拉非尼對RAF/MEK/ERK信號通路的抑制作用比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3.3 CBI-5725對PLC/PRF/5細胞凋亡的影響 為了確定細胞周期停滯表型是否與凋亡誘導相關，采用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡率。用Annexin V-FITC和碘化丙啶染色后，正常的活細胞不被Annexin V-FITC和碘化丙啶染色；凋亡早期的細胞僅被Annexin V-FITC染色，碘化丙啶染色呈陰性；壞死細胞和凋亡晚期的細胞可以同時被Annexin V-FITC和碘化丙啶染色[10]。總的凋亡細胞比例是早期凋亡和晚期凋亡細胞占所有細胞百分比的總和[11]。如圖5所示，24 h、48 h后，各處理組細胞凋亡率均高于對照組(P<0.01)。CBI-5725 5、15 μmol/L處理細胞48 h后，細胞凋亡率均高于處理24 h時，且15 μmol/L組高于5 μmol/L組(P<0.01)，表明CBI-5725呈濃度依賴性發(fā)誘導細胞凋亡；處理24 h、48 h后，CBI-5725 15 μmol/L組細胞凋亡率高于索拉非尼15 μmol/L組(P<0.01)。

圖3 PLC/PRF/5各組細胞中pB-RAF、pC-RAF、pMEK、pERK、pAkt、GAPDH蛋白的表達

圖4 PLC/PRF/5細胞中pB-RAF、pC-RAF、pMEK、pERK、pAkt蛋白表達的光密度分析

圖5 PLC/PRF/5細胞中CBI-5725或索拉非尼介導的細胞凋亡

注：與對照組比較，* *P<0.01; 與CBI-5725 15 μmol/L比較，##P<0.01

3.4 CBI-5725對細胞中caspase-3前體、PARP及切割后的PARP片段的表達的影響 蛋白表達及測定結果見圖6， 對目的蛋白灰度值與內參 GAP-DH灰度值的比值進行單因素方差分析(ANOVA)，然后進行Tukey事后檢驗。如圖6所示，用CBI-5725處理細胞48 h后，caspase-3前體和PARP的表達水平呈濃度依賴性的減低，切割后的PARP片段表達水平呈濃度依賴性的升高。然而，在用索拉非尼處理的細胞中，caspase-3前體、PARP及切割后的PARP片段的表達水平無顯著差異(P>0.05)。CBI-5725 15 μmol/L組caspase-3前體和PARP的水平遠低于對照組細胞(P<0.01)，但切割后的PARP片段表達水平高于對照組(P<0.01)。然而，索拉非尼15 μmol/L組上述指標與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。這與Annexin V-FITC/PI雙染檢測到的細胞凋亡結果一致。結果表明，CBI-5725能更好地引起caspase-3介導的細胞凋亡，這可能是本品能更有效地誘導細胞凋亡的原因。

3.5 CBI-5725抑制PLC/PRF/5小鼠腫瘤模型的腫瘤生長 為了驗證CBI-5725對PLC/PRF/5細胞的作用是否具有臨床相關性，我們用HCC小鼠腫瘤模型以評估并比較CBI-5725與索拉非尼的體內效應。在實驗中使用的每只小鼠中均觀察到單個腫瘤，每個治療組相對于對照組體重沒有增加。如圖7B所示，CBI-5725顯著抑制PLC/PRF/5腫瘤生長。對照組的最大腫瘤直徑為21 mm，2 mg/kg CBI-5725在治療結束時抑制約73%的腫瘤生長(最大腫瘤直徑為13.4 mm)，6、18 mg/kg CBI-5725分別抑制89%、92%的腫瘤生長(最大腫瘤直徑分別為10.7、10.3 mm)。另一方面，圖6A顯示，甲苯磺酸索拉非尼以劑量依賴性方式抑制PLC/PRF/5腫瘤生長。在劑量為10、20 mg/kg時，索拉非尼分別抑制19%和64%的腫瘤生長(最大腫瘤直徑分別為19.5、15 mm)。

圖6 PLC/PRF/5各組細胞中Caspase-3前體、PARP及切割后的PARP片段的表達(*P<0.05，**P<0.01)

4 討論

索拉非尼是一種多激酶抑制劑，是唯一批準用于HCC患者的一線靶向藥物。然而，HCC中索拉非尼耐藥性的增加降低了其療效[12]。最近研究表明，多激酶抑制劑樂伐替尼和瑞格非尼分別到達了一線和二線治療的主要終點，其中瑞格非尼是目前唯一被FDA批準的治療HCC的二線藥物。3種藥物的作用靶點、生存期、不良反應等見表1[13]。

本研究中，與索拉非尼相比，CBI-5725更有效地阻止了人類HCC細胞系的增殖并誘導細胞凋亡。 CBI-5725阻斷RAF/MEK/ERK通路，并誘導依賴于caspase-3/PARP活化的細胞凋亡。 此外，CBI-5725通過抑制PLC/PRF/5小鼠腫瘤模型的腫瘤生長發(fā)揮了強大的抗腫瘤活性。 因此，CBI-5725是替代索拉非尼治療HCC的潛在治療選擇。

圖7 CBI-5725(B)或sorafenib(A)對PLC/PRF/5小鼠腫瘤模型的作用(***P<0.001)

RAF激酶是MEK/ERK激酶的重要調節(jié)者，RAF/MEK/ERK的信號級聯(lián)調節(jié)正常細胞增殖和存活所需要的多種生理功能。然而，該信號通路的過度激活誘導了人類腫瘤中異常的細胞生長。RAF/MEK/ERK通路的信號傳導上調在肝癌的發(fā)生發(fā)展中有重要作用[3]。RAF激酶活性與癌癥密切相關，在過去的十年中已經開發(fā)了多種ATP競爭性的RAF激酶抑制劑[14]。 當上游的RAS發(fā)生致癌突變時，選擇性B-RAF激酶抑制劑，如維羅非尼(Vemurafenib)和達拉非尼(Dabrafenib),與RAF異二聚體(C-RAF/B-RAF)中的一員結合，這樣的結合抑制了二聚體中的一員，但是反式激活了無藥物結合的另一員[15],因此，選擇性B-RAF抑制劑能夠激活C-RAF和隨后的ERK信號傳導，反而增強腫瘤細胞增殖。為了規(guī)避選擇性B-RAF激酶抑制劑的限制，一系列泛RAF激酶抑制被開發(fā)出來，如索拉非尼[16]。索拉非尼是一種泛RAF激酶抑制劑，其抑制BRAF激酶并驅動CRAF激活，但其同時結合并抑制CRAF激酶，因此不激活ERK[17]。本研究中采用的PLC/PRF/5細胞系，具有K-RAS-mutant及B-RAF wild type的基因表型，推測該細胞癌變的原因與MAPK通路受干擾有關。本研究顯示，RAF/MEK/ERK信號通路對CBI-5725或索拉非尼的敏感性相當。CBI-5725不激活ERK，因此，其可能與索拉非尼一樣，是泛RAF激酶抑制劑，且抑制RAF/MEK/ERK信號通路的效果與索拉非尼類似。

在本研究中，Annexin V-FITC/PI檢測了CBI-5725誘導的劑量依賴性的PLC/PRF/5細胞凋亡，且CBI-5725比索拉非尼更能有效地誘導細胞凋亡。Caspases是細胞凋亡途徑的基礎，是細胞凋亡的啟動者和執(zhí)行者。Caspases可以通過兩種常見的途徑被激活。內在和外在途徑都匯集于下游的Caspase-3。一旦被激活，caspase-3前體被切割，產生了caspase-3的活性形式，負責切割PARP[18-20]。 PARP在轉錄和細胞周期調控、DNA損傷反應、凋亡和基因組完整性維護方面起重要作用[21]。 PARP的切割促進細胞破壞，并且是細胞凋亡的標志[22]。用CBI-5725處理細胞后，caspase-3前體和PARP水平降低，而切割的PARP片段水平升高，表明CBI-5725依賴caspases途徑在PLC/PRF/5細胞中誘導凋亡。然而，索拉非尼沒有顯著改變caspase-3前體、PARP和切割的PARP片段的水平，表明索拉非尼誘導的細胞凋亡可能不依賴caspases的活化。這個結果與以前的研究結果一致[3]。

在PLC/PRF/5小鼠腫瘤模型中，CBI-5725可有效防止腫瘤生長。在口服給藥14 d后，6～18 mg/kg 的CBI-5725幾乎完全抑制腫瘤的生長。 另一方面，甲苯磺酸索拉非尼在劑量高達20 mg/kg時，仍未完全抑制腫瘤生長。從體外實驗獲得的結果提示，RAF/MEK/ERK信號通路的阻斷和細胞凋亡可能是CBI-5725抑制PLC/PRF/5小鼠腫瘤模型的腫瘤生長的原因。

表1 不可切除肝細胞癌分子靶向治療

總之，本研究表明，CBI-5725抑制RAF/MEK/ERK信號通路，效果與索拉非尼近似，CBI-5725比索拉非尼更能誘導腫瘤細胞凋亡，其機制與啟動caspase-3誘導的細胞凋亡有關。這些因素都使得CBI-5725比索拉非尼更能有效地抑制PLC/PRF/5的增殖。這些因素可能有助于CBI-5725對人類HCC小鼠腫瘤模型的顯著抗腫瘤功效。 因此，CBI-5725可能成為一種有效的抗腫瘤藥物，替代索拉非尼用于肝癌患者。