羊Toll樣受體MyD88信號通路接頭分子MyD88、TRAF6、AP-1、NF-кB基因TaqMan探針熒光定量檢測方法的建立及應用

楊 源，王 軍，唐 沙，岳 筠，周 怡，文 明，周碧君，程振濤*

(1.貴州大學 動物科學學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室，貴州 貴陽 550025；3.貴州省動物疫病預防控制中心，貴州 貴陽 550008)

Toll 樣受體作為識別病原相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular patterns，PAMPs)的 一種模式識別受體(Pattern recognition receptor，PRRs)[1]，在識別內(nèi)源性或外源性配體后，募集細胞中的包括髓樣分化因子88(Myeloid differentiation factor 88，MyD88)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6 (TNF receptor-associated factor 6，TRAF6)、激 活蛋白 1(Active protein-1，AP-1)和核轉(zhuǎn)錄因子κB(Nuclear factor of κB，NF-κB)等接頭分子，通過系列的信號級聯(lián)效應，將信號沿著MyD88 依賴性或TRIF 途徑傳導[2]，啟動機體的固有免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)，最終調(diào)控 IL-1、IL-6、TNF、IFN 等炎性因子和趨化因子的轉(zhuǎn)錄，幫助機體抵御和清除病原體[3-4]。近年來，越來越多的研究闡明了Toll 樣受體介導了多種疾病的發(fā)生，包括人支原體肺炎、哮喘、禽流感等呼吸系統(tǒng)疾病[5-7]；II 型糖尿病等營養(yǎng)代謝性疾病和豬的支原體肺炎等動物疫病[8]。但關(guān)于羊疫病與Toll 樣受體關(guān)系的研究相對較少，本研究建立羊Toll 樣受體MyD88 依賴信號傳導途徑中的重要接頭分子MyD88、TRAF6、NF-κB、AP-1基因TaqMan探針熒光定量PCR (qPCR)方法，同時將其應用于檢測貴州省境內(nèi)的5 種羊健康狀態(tài)下肺組織中各接頭分子基因的含量，為探究羊呼吸系統(tǒng)疫病的發(fā)生與Toll樣受體關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 山羊肺組織樣本的采集 健康貴州黑山羊、貴州白山羊、黔北麻羊、波爾山羊和湖羊5 種羊的肺組織各5份，分別采集自貴州省境內(nèi)地方品種羊飼養(yǎng)區(qū)規(guī)模養(yǎng)殖場。

1.2 主要試劑 RNA 提取試劑RNAiso Plus (TRI-zol)、Premix ExTaqTM(Probe qPCR)、反轉(zhuǎn)錄試劑One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit (Perfect Real Time)購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物的設(shè)計與合成 參照GenBank 中登錄的MyD88、TRAF6、NF-κB、AP-1 基因序列設(shè)計特異性引物和TaqMan 探針，探針發(fā)光基團為 6-FAM，淬滅基團為BHQ1，引物與探針由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物信息見表1。

表1 引物探針信息列表Table 1 The information of primers and probes

1.4 各目的基因重組質(zhì)粒標準品的構(gòu)建與鑒定 采用TRIzol 法提取羊肺組織總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA 后 ，以表1中的引物，通過PCR方法擴增MyD88、TRAF6、NF-кB、AP-1 基因，并將目的基因經(jīng)膠回收純化后克隆至pMD18-T 載體，采用質(zhì)粒PCR 和序列分析的方法鑒定各目的基因質(zhì)粒。陽性重組質(zhì)粒應用微量核酸蛋白檢測儀進行濃度檢測，按照公式：拷貝數(shù)(拷貝 /μL)=[6.02×1023×測定質(zhì)粒濃度(ng/μL)×10-9/(660×堿基數(shù))]計算各質(zhì)粒標準品的拷貝數(shù)后，作為各基因的質(zhì)粒標準品。

1.5TaqMan 探針qPCR 方法的優(yōu)化 按照Premix ExTaqTM(probe qPCR)試劑盒說明書建立 20 μL 反應體系。分別對qPCR 方法初始體系的退火溫度(54 ℃、56 ℃、58 ℃、60 ℃、62 ℃、64 ℃)和引物、探針濃度(0.4 μmol/L、0.6 μmol/L、0.8 μmol/L、1.0 μmol/L、1.2 μmol/L)進行優(yōu)化，以最小 Ct 值、最強熒光強度和最佳試劑消耗配置確定最優(yōu)體系。

1.6 標準曲線建立 將各質(zhì)粒標準品從1×109拷貝/μL 10 倍倍比稀釋至 1×100拷貝 /μL。各取 7 個濃度的質(zhì)粒標準品，按優(yōu)化好的體系，進行qPCR 擴增，根據(jù)擴增的Ct 值和相對應的濃度關(guān)系，繪制各基因擴增的標準曲線。

1.7 特異性試驗 應用建立的各目的基因的Taq-Man探針qPCR方法分別對含 MyD88、AP-1、NF-кB、TRAF6 基因質(zhì)粒標準品的混合物進行擴增，以評價所建方法的特異性。

1.8 敏感性試驗 以最佳反應體系，對濃度為1×109拷貝 /μL～1×100拷貝 /μL 的含 MyD88、TRAF6、NF-кB、AP-1 基因的質(zhì)粒標準品分別進行 qPCR 擴增，分析所建方法的敏感性。

1.9 重復性試驗組內(nèi)重復：取每個目的基因3 個已知濃度質(zhì)粒為模板，每個濃度設(shè)3 個重復，在同一個反應程序下進行qPCR 擴增，計算每個濃度下3 個重復Ct 值的變異系數(shù)。組間重復：取每個目的基因3 個已知濃度的質(zhì)粒為模板，每個濃度設(shè)3 個重復，分別在不同時間進行qPCR 擴增，計算每次試驗Ct 值的變異系數(shù)，以評估該方法的重復性。

1.10 不同品種羊肺組織樣本目的基因的檢測與分析 對采集自貴州黑山羊、貴州白山羊、黔北麻羊、波爾山羊和湖羊共5 種羊的等量肺組織樣本(每種羊 5份)，按 TRIzol 法提取每份樣品的總 RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，分別進行MyD88、TRAF6、NF-кB、AP-1 的 qPCR 擴增，并應用已建立的標準曲線計算相應分子的轉(zhuǎn)錄水平，每份樣本重復3次，濃度計算結(jié)果采用SPSS 軟件分析。

2 結(jié) 果

2.1 各目的基因重組質(zhì)粒標準品的鑒定 應用各目的基因的特異性引物，以羊肺組織cDNA 為模板，進行PCR 擴增，結(jié)果顯示：擴增分別得到了約為137 bp、151 bp、161 bp 和 151 bp 的目的條帶，分別與 MyD88、TRAF6、NF-кB、AP-1 基因片段大小相符(圖略)。將各基因片段克隆至 pMD18-T 載體，構(gòu)建含4 個目的基因的質(zhì)粒標準品，采用質(zhì)粒PCR和序列分析方法鑒定各重組質(zhì)粒，結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR 能夠擴增出各目的基因的特異性條帶(圖1)，測序結(jié)果經(jīng) NCBI 比對正確。表明正確構(gòu)建了含各目的基因的重組質(zhì)粒標準品。

圖1 MyD88 通路分子基因質(zhì)粒PCR 鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of the plasmids of MyD88 pathway linkers by PCR

2.2 目的基因qPCR 的優(yōu)化結(jié)果 對檢測MyD88、TRAF6、NF-кB、AP-1基因的qPCR方法進行條件優(yōu)化，最終優(yōu)化結(jié)果見表2。

表2 檢測各基因的qPCR 體系優(yōu)化結(jié)果Table 2 The optimization of the qPCR conditions for target gene detection

2.3 各目的基因標準曲線的建立 將含MyD88、TRAF6、NF-кB、AP-1 4 個基因的重組質(zhì)粒在 1×109拷貝 /μL～1×103拷貝 /μL 共 7 個濃度進行 qPCR 擴增，繪制的各基因擴增曲線以及標準曲線結(jié)果顯示，各基因濃度與 Ct 值均有較好的線性關(guān)系(圖2～圖5)，且相關(guān)系數(shù) R2分別為 1、1、1 和 0.998。擴增效率 E 分別為 97.24 %、98.03 %、93.08 %和1.01 %，均在 90 %～105 %。表明建立的 4 種基因的qPCR 方法具有較好的擴增效率。

2.4 qPCR 特異性試驗結(jié)果 以含MyD88、TRAF6、NF-кB、AP-1 基因質(zhì)粒標準品混合物為模板，根據(jù)各基因的最佳PCR 體系，分別進行qPCR 特異性檢測。擴增結(jié)果顯示，每個qPCR 檢測體系均擴增出單一曲線(圖6)。表明本研究建立的各基因的qPCR方法具有較高特異性，彼此之間不存在相互影響。

圖2 羊MyD88 基因qPCR 擴增曲線和標準曲線Fig.2 The qPCR amplification curve and standard curve of sheep MyD88 gene

圖3 羊TRAF6 基因qPCR 擴增曲線和標準曲線Fig.3 The qPCR amplification curve and standard curve of sheep TRAF6 gene

圖4 羊NF-кB 基因qPCR 擴增曲線和標準曲線Fig.4 The qPCR amplification curve and standard curve of sheep NF-кB gene

2.5 qPCR 敏感性試驗結(jié)果 以濃度為1×109拷貝/μL～1×100拷貝 /μL 的含 MyD88、TRAF6、NF-кB、AP-1 基因的質(zhì)粒標準品為模板進行qPCR 的敏感性試驗。結(jié)果顯示，該方法對上述各質(zhì)粒最小檢出量分別為 1×101拷貝 /μL、1×102拷貝 /μL、1×102拷貝/μL、1×101拷貝 /μL (圖7)。表明本研究建立的檢測各目的基因的qPCR 方法具有較高的敏感性。

圖5 羊AP-1 基因qPCR 擴增曲線和標準曲線Fig.5 The qPCR amplification curve and standard curve of sheep AP-1 gene

圖6 各目的基因qPCR 方法特異性試驗結(jié)果Fig.6 Specific test of the established qPCR method

圖7 各目的基因qPCR 方法的敏感性試驗結(jié)果Fig.7 Sensitivity tests of the established qPCR methods

2.6 qPCR 重復性檢測結(jié)果 分別以含MyD88、TRAF6、NF-кB 和 AP-1 基因重組質(zhì)粒為模板，對建立的各基因qPCR 方法進行組內(nèi)重復和組間重復試驗。結(jié)果顯示，不同濃度各質(zhì)粒標準品的組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于5 % (表3)，表明所建立的方法具有較好重復性和穩(wěn)定性。

表3 羊Toll 樣受體MyD88 信號通路接頭分子qPCR 方法重復性試驗結(jié)果Table 3 Repetitive evaluation of the qPCR methods for the Toll-like receptor MyD88 signaling pathway linkers in goats

2.7 不同品種羊Toll 樣受體MyD88 信號通路接頭分子定量檢測與分析結(jié)果 將建立的方法應用于不同品種羊肺組織中基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測，結(jié)果顯示，NF-кB 在 0.1g 貴州黑山羊肺組織中含量為2.64×106拷貝 /μL，極顯著高于其它品種羊(p＜0.01)，且其它品種羊之間該基因含量差異不顯著(p＞0.05)；MyD88 在 0.1g 黔北麻羊肺組織中含量為 4.95×105拷貝 /μL，極顯著高于其它品種羊(p＜0.01)，其余幾種羊之間該基因的含量差異不顯著(p＜0.05)；AP-1在 0.1g 麻羊肺組織中含量為 3.5×104拷貝 /μL，極顯著高于湖羊、黑山羊和白山羊(p＜0.01)；TRAF6在 0.1g 黑山羊肺組織中含量為 4.2×105拷貝 /μL，顯著高于麻羊、白山羊和波爾山羊(p＜0.05)，極顯著高于湖羊(p＜0.01) (圖8)。表明 4 個基因在不同品種羊肺組織之間存在差異，這種差異性可能與不同品種羊?qū)σ卟〉囊赘行圆町愑嘘P(guān)。

圖8 羊Toll 樣受體MyD88 信號通路基因在不同品種羊肺組織中的定量結(jié)果Fig.8 Quantitative results of the same genes in different breeds of sheep lung tissues

3 討 論

qPCR 技術(shù)被廣泛應用于基因的定量檢測中，主要有染料法和探針法兩種，其中探針法具有較高的特異性。李世芳等通過qPCR 的方法，闡明了epsilon 干擾素的轉(zhuǎn)錄水平在口蹄疫病毒感染后不同時間段內(nèi)并無變化，進一步闡明了I 型干擾素的不同亞型在其抗病毒感染過程中的作用[9]；孫文超等采用qPCR 技術(shù)，對山羊痘病毒N1 蛋白缺失株感染山羊外周血淋巴細胞后，TLR2 和TLR9 基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測，結(jié)果證明了TLR2 和TLR9 在抗病毒感染過程中的作用[10]。Xue 等通過qPCR 技術(shù)證明了綿羊肺炎支原體感染羊支氣管上皮細胞后，TLR2/TLR4 基因在 MyD88 傳導通路中的重要作用[11]。本研究建立了檢測不同品種山羊Toll 樣受體MyD88信號傳導途徑中 MyD88、AP-1、NF-кB、TRAF6 4種接頭分子的TaqMan 探針 qPCR 方法，具有較強的特異性、較好的穩(wěn)定性和重復性；敏感性與多數(shù)文獻報導一致。本研究在對羊的該4 個功能基因進行特異性檢測時，采用了區(qū)別于病原微生物特異性檢測時以同科異屬、同屬異種或臨床較難區(qū)分的疫病的病原核酸為模板，進行qPCR 特異性檢測的方法，考慮更多的是在檢測4 個基因時，彼此之間是否存在非特異性的擴增，所以采用含4 個基因的混合質(zhì)粒為模板進行qPCR 擴增，以確定彼此之間是否干擾。結(jié)果表明，建立的檢測方法特異性強，擴增4 個基因時不存在相互干擾的情況[12-13]。

Toll 樣受體在調(diào)節(jié)機體免疫和抗感染方面具有重要的作用[14]。越來越多的研究表明：Toll 樣受體與機體肺部炎癥等疾病的發(fā)生有密切的聯(lián)系。方曉敏等研究顯示，豬TRL2、TRL4 的變異導致豬對支原體肺炎感染存在明顯的差異性[15]。研究顯示在TLR1～TLR10 中除了 TLR3 之外，所有 TLRs 信號將會沿著TLRs-MyD88-TRAF6- NF-κB/AP-1途徑進行信號傳遞[16]。對MyD88 信號傳導途徑的研究，在闡明Toll 樣受體介導的病原分子與機體的相互關(guān)系方面至關(guān)重要。李玲等用中草藥麻杏石甘湯灌喂禽流感病毒感染小鼠模型后，定量分析TLR4-MyD88-TRAF6 信號傳導途徑中，各接頭分子轉(zhuǎn)錄水平的變化，闡明了該藥劑通過抑制MyD88 通路中接頭蛋白分子的表達，從而減緩肺部炎癥的發(fā)生[17]。張子杰等通過對 TLR-MyD88-NF-κB 信號通路接頭分子變化的定量分析，闡明了Toll 樣受體與肝癌的臨床病理分期、血清腫瘤標志物含量密切相關(guān)[18]。但是目前，關(guān)于羊呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生與Toll 樣受體關(guān)系的研究相對較少。應用本研究建立的方法對不同品種山羊在健康狀態(tài)下肺部組織中的MyD88 依賴性途徑接頭分子轉(zhuǎn)錄水平進行定量分析，顯示不同品種羊在正常狀態(tài)下的Toll 樣受體MyD88 通路分子MyD88、TRAF6、NF-κB和AP-1轉(zhuǎn)錄水平存在差異，這種轉(zhuǎn)錄水平的差異是否會與不同品種羊?qū)粑到y(tǒng)疫病的易感性存在關(guān)系，有待進一步研究。本研究建立的方法為探究山羊呼吸系統(tǒng)疫病的發(fā)生與Toll 樣受體信號傳導的關(guān)系奠定基礎(chǔ)，并為研究羊Toll 樣受體信號傳導與動物疫病的發(fā)生關(guān)系提供參考資料。