豬流行性腹瀉病毒N蛋白單克隆抗體的制備與鑒定

張慶橋,王一鵬,魏艷秋,米建華,趙 雪,孫立旦,宋勤葉

(1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,河北 邯鄲 056021；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 河北省獸用生物制品工程技術(shù)研究中心,河北 保定 071000；3.河北省淶水縣畜牧水產(chǎn)局,河北 淶水 074199)

豬流行性腹瀉病毒(PEDV)屬于尼多病毒目(Nidovirales)冠狀病毒科(Coronaviridae)甲型冠狀病毒屬(Alphacoronavirus)成員。該病毒引起的豬流行性腹瀉(PED)是豬場(chǎng)常見(jiàn)的一種腸道傳染病,以豬嘔吐、腹瀉、脫水和死亡為特征。1971年P(guān)ED首次發(fā)生于英國(guó)的生長(zhǎng)育肥豬群,1973年我國(guó)上海發(fā)生PED,隨后該病主要以地方流行性形式在國(guó)內(nèi)多地豬場(chǎng)發(fā)生[1]。但2010年秋冬以來(lái),PEDV變異株引起的PED在國(guó)內(nèi)暴發(fā)流行,初生仔豬的發(fā)病率和死亡率高達(dá)100%,給養(yǎng)豬場(chǎng)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[2-4]。目前PEDV是導(dǎo)致仔豬腹瀉的最重要的致病因子[5-6],此外,豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒豬δ-冠狀病毒以及大腸桿菌等也是引起仔豬腹瀉常見(jiàn)病原[5-6]。不同病原引起的臨床表現(xiàn)相似,給臨床診斷造成了很大困難。因此,研究高效特異的診斷試劑,建立快速檢測(cè)技術(shù),具有重要實(shí)踐意義。

單克隆抗體(McAb)以其高特異性、高均一性、方便生產(chǎn)、容易標(biāo)準(zhǔn)化和商品化等優(yōu)勢(shì),成為病原學(xué)或血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)、感染與免疫機(jī)制研究以及靶向治療的理想工具。核衣殼蛋白是PEDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白,保守性高,在PEDV感染早期,細(xì)胞內(nèi)N蛋白濃度高,是病毒感染早期診斷與監(jiān)測(cè)的主要靶蛋白[7]。此外,N蛋白還與病毒致病以及機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)有關(guān)[8]。本研究旨在用體外表達(dá)的重組N蛋白作為免疫原,應(yīng)用雜交瘤技術(shù),獲得分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,制備PEDV特異性單克隆抗體,為PEDV診斷或檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)一步研發(fā)以及感染免疫機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與毒株 Vero細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞,購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；表達(dá)PEDV N蛋白的工程菌E.Coli BL21,由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病實(shí)驗(yàn)室制備。PEDV HBMC2012株(GenBank ID：JX163294),由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病實(shí)驗(yàn)室分離鑒定與保存。

1.2 主要試劑與試劑盒 DMEM、HAT(次黃嘌呤-氨甲蝶呤-胸腺嘧啶核苷)和HT(次黃嘌呤-胸腺嘧啶核苷),均購(gòu)自Sigma公司；胎牛血清,購(gòu)自Hyclone公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(H+L),購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgM,購(gòu)自武漢博士徳生物工程有限公司；山羊抗鼠 IgG+IgM H&L(FITC),Abcam公司產(chǎn)品。Pierce Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit,購(gòu)自Thermo公司；IgM類單克隆抗體純化試劑盒,購(gòu)自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c小鼠,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.4 間接 ELISA 每孔用0.1 μg純化的PEDV包被96孔酶標(biāo)板；棄去包被液,洗滌3次；每孔加入100 μL封閉液,37℃封閉1 h；棄去封閉液,每孔加入100 μL鼠抗 PEDV陽(yáng)性血清(1∶40倍稀釋),37℃孵育1 h,洗滌；加入HRP-羊抗鼠IgG(1∶2 000倍稀釋),100 μL/孔,37 ℃孵育45 min,洗滌；加入 TMB底物溶液,100 μL/孔,避光反應(yīng)15 min；加入2 mol/L 的 H2SO4,50 μL/孔,終止反應(yīng)。用自動(dòng)酶聯(lián)檢測(cè)儀測(cè)定OD450nm值,當(dāng)待檢樣本的OD450nm值≥0.3時(shí),判定為抗體陽(yáng)性；當(dāng)OD450nm值＜0.3時(shí)判定為陰性。

1.5 PEDV-N重組蛋白的制備 參照文獻(xiàn)[9]所述方法,將表達(dá)PEDV-N蛋白的E.Coli BL21單個(gè)菌落接種到Amp+/LB培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng),待對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600nm值=0.6～0.8),用終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5 h。離心收集菌體,冰浴下超聲裂解細(xì)胞；離心,收集上清。按照Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒說(shuō)明書(shū),純化重組N蛋白,回收透析后的蛋白,測(cè)定蛋白含量,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 動(dòng)物免疫 用純化的PEDV-N重組蛋白免疫4只6～8周齡的BALB/c小鼠,連續(xù)免疫3次,間隔兩周,每次每只小鼠經(jīng)背部皮下注射50 μg蛋白。首次免疫抗原與弗氏完全佐劑乳化,第2、3次免疫抗原與弗氏不完全佐劑乳化。最后1次免疫后10 d,用間接ELISA檢測(cè)小鼠血清中的PEDV特異性抗體水平。在融合前3 d每只小鼠腹腔注射100 μg蛋白,進(jìn)行加強(qiáng)免疫。

1.7 雜交瘤細(xì)胞株的建立

1.7.1 細(xì)胞融合 無(wú)菌摘出加強(qiáng)免疫后3 d的小鼠脾臟,制備脾細(xì)胞。將脾細(xì)胞與SP/20骨髓瘤細(xì)胞按照5∶1的比例混合,1 000 r/min離心10 min,棄上清；取細(xì)胞沉淀,使其均勻松散成糊狀；應(yīng)用聚乙二醇(PEG 4 000)方法使脾細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞融合。然后將融合后的細(xì)胞加入到鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中,100 μL/孔,置 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在融合后的第3天、6天、9天用HAT的1640培養(yǎng)液半量換液,第12天改用含1%HT的DMEM培養(yǎng)液半量換液,第14天后用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液半量換液。

1.7.2 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選與克隆 當(dāng)孔內(nèi)雜交瘤細(xì)胞克隆生長(zhǎng)到孔底面積的1/4～1/3時(shí),用1.4的間接ELISA方法篩檢分泌特異抗體的陽(yáng)性孔。采用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性孔細(xì)胞進(jìn)行3～4次亞克隆,當(dāng)克隆細(xì)胞株的所有細(xì)胞孔的上清液結(jié)果均為陽(yáng)性時(shí),擴(kuò)大培養(yǎng)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞,并凍存于液氮中。

1.7.3 雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的穩(wěn)定性檢測(cè) 復(fù)蘇凍存的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞,進(jìn)行傳代培養(yǎng)。收集第2、5、10、15、20、25、30 代的細(xì)胞培養(yǎng)上清,用間接ELISA法檢測(cè)細(xì)胞分泌的抗體水平,評(píng)價(jià)雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的穩(wěn)定性。

1.8 單克隆抗體的大量制備 采用體內(nèi)誘生腹水法大量制備單克隆抗體。取雌性BALB/c小鼠(≥12周齡),每只小鼠腹腔注射滅菌的石蠟油10～14 d后,腹腔注射雜交瘤細(xì)胞5×106個(gè)/只。約7～10 d后,抽取腹水,8 000 r/min離心10 min,收集上清,按照IgM類單克隆抗體純化試劑盒的說(shuō)明書(shū)純化腹水,ELISA測(cè)定抗體效價(jià)后,分裝后凍存于-80℃。

1.9 單克隆抗體的鑒定

1.9.1 單克隆抗體的類和亞類的鑒定將獲取的單克隆抗體作1∶50倍稀釋,按照鼠單克隆抗體類/亞類鑒定ELISA試劑盒(Thermo Scientific)的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行抗體類型鑒定,當(dāng)OD450nm值≥0.2判為陽(yáng)性反應(yīng)。

1.9.2 Western Blot試驗(yàn) 用PEDV N蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳,通過(guò)半干轉(zhuǎn)印法將N蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,封閉后,取1∶400倍稀釋的腹水作Western Blot,檢測(cè)抗體與N蛋白的特異性結(jié)合活性。

1.9.3 間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA) 將生長(zhǎng)良好的Vero細(xì)胞鋪于96孔板,待細(xì)胞單層生長(zhǎng)達(dá)90%匯合時(shí),感染HBQY2016株(0.5 MOI),同時(shí)設(shè)立未接毒陰性對(duì)照；將培養(yǎng)板至于37℃ 5%CO2孵育1 h；棄去病毒液,加入MEM維持液,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。按照文獻(xiàn)[10]所述方法,將制備的腹水作1∶1 000倍稀釋,進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn),分析抗體與PEDV的結(jié)合特性。

1.10 單克隆抗體的初步應(yīng)用

1.10.1 免疫過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)(IPMA)用HBQY2016株感染(0.1 MOI)生長(zhǎng)良好的Vero細(xì)胞,同時(shí)設(shè)立非感染陰性對(duì)照。感染后48 h,棄去孔內(nèi)液體,PBS輕洗細(xì)胞。每孔加入200 μL固定液(40%丙酮和0.2%BSA的PBS),室溫固定20 min；棄去固定液,PBS洗滌3次；每孔加入100 μL 30%H2O2和甲醇混合液(1∶50),室溫孵育 20 min；棄去孔中液體,PBST洗滌細(xì)胞3次；用含2%BSA的PBST于37℃封閉30 min；棄去封閉液,每孔加入100 μL單克隆抗體(4A7,1∶1 000倍稀釋),37℃溫育1 h；PBST洗滌5次,加入50 μL山羊抗鼠IgMHRP(1∶2 000倍稀釋),37℃溫育45 min；PBST洗滌5次,每孔加入100 μL DAB溶液,室溫顯色10～15 min,用水沖洗終止反應(yīng),顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.10.2 免疫組化 取QY2016株人工感染初生仔豬的小腸,4%多聚甲醛固定后,制成石蠟切片,經(jīng)過(guò)脫蠟水化、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性以及封閉后,取1∶500稀釋的腹水(4A7),通過(guò)免疫組化技術(shù),檢測(cè)感染豬小腸內(nèi)的病毒。

2 結(jié)果

2.1 免疫鼠血清特異性抗體 第3次免疫后10 d,4只小鼠的血清抗體全部轉(zhuǎn)陽(yáng),ELISA抗體效價(jià)在1∶1 280～1∶2 560 之間(圖 1)。 選擇抗體效價(jià)為1∶2 560的小鼠用于細(xì)胞融合前進(jìn)行沖擊免疫。

2.2 雜交瘤細(xì)胞株 免疫小鼠的脾細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合后,以純化的PEDV作為包被抗原用間接ELISA方法篩選陽(yáng)性克隆孔,然后通過(guò)有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性克隆孔進(jìn)行3～5次亞克隆,最終獲得了4株穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞,分別命名為：4A7、6C1、5E10和6F7,其分泌的抗體效價(jià)分別為：1∶3 200、1∶1 600、1∶800、1∶800(圖 2a)。 復(fù)蘇凍存的4株雜交瘤細(xì)胞,并連續(xù)傳代培養(yǎng)30代,4A7和6C1的抗體效價(jià)穩(wěn)定在1∶1 600～1∶3 200之間,5E10與6F7的抗體效價(jià)在1∶800～1∶1 600之間,表明4株雜交瘤細(xì)胞具有良好的抗體分泌穩(wěn)定性。4A7、6C1、5E10和6F7雜交瘤細(xì)胞誘生的腹水抗體效價(jià)分別為：1∶106、1∶105、1∶105和 1∶105(圖 2b)。

2.3 單克隆抗體的類、亞類與型 經(jīng)鼠單克隆抗體類/亞類鑒定ELISA試劑盒鑒定,4A7、6C1、5E10和6F7四株雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體均與抗IgM抗體、抗κ輕鏈抗體反應(yīng),OD450nm值＞0.2,表明獲得的4株雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體均為IgM,其輕鏈均為κ鏈(表1略)。

2.4 單克隆抗體能與PEDV-N蛋白特異性結(jié)合Western Blot結(jié)果顯示,4株單抗與PEDV N蛋白反應(yīng)后,均在40 kDa處出現(xiàn)清晰條帶(圖3),說(shuō)明4株單克隆抗體均能夠與PEDV N蛋白發(fā)生特異結(jié)合。

圖2 雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液和小鼠腹水中的PEDV特異性抗體效價(jià)

圖3 單克隆抗體與PEDV-N蛋白反應(yīng)的Western-Blot鑒定

2.5 單克隆抗體能與PEDV特異性結(jié)合 IFA檢測(cè)顯示,4株單抗均能與PEDV感染Vero細(xì)胞內(nèi)的病毒發(fā)生特異性結(jié)合,在胞漿內(nèi)發(fā)出特異性綠色熒光,而未感染病毒的陰性對(duì)照細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有綠色熒光(見(jiàn)封三彩版圖4)。該結(jié)果表明,制備的4株單抗均能夠與PEDV發(fā)生良好的特異性免疫反應(yīng)。

圖4 單克隆抗體與PEDV反應(yīng)的間接免疫熒光試驗(yàn)

2.6 單克隆抗體的初步應(yīng)用

2.6.1 用于體外感染的PEDV鑒定 通過(guò)IPMA,用獲取的單抗4A7檢測(cè)PEDV感染Vero細(xì)胞內(nèi)的病毒抗原,結(jié)果在感染細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕色信號(hào),而在陰性對(duì)照細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)棕色信號(hào)(見(jiàn)封三彩版圖5)。該結(jié)果表明,制備的單抗能夠特異地檢測(cè)到感染細(xì)胞內(nèi)的特異性病毒抗原,可通過(guò)IPMA試驗(yàn)用于PEDV鑒定及細(xì)胞感染情況分析。

圖5 用單抗4A7通過(guò)IPMA鑒定Vero細(xì)胞內(nèi)的PEDV (×200)

2.6.2 用于體內(nèi)感染的PEDV檢測(cè)與定位 通過(guò)免疫組化技術(shù),用制備的單抗4A7檢測(cè)PEDV感染豬的小腸內(nèi)的病毒抗原,結(jié)果在小腸上皮細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的棕色信號(hào)(見(jiàn)封三彩版圖6),表明4A7能夠與感染豬小腸內(nèi)的PEDV抗原發(fā)生特異性結(jié)合,單抗可用于感染組織內(nèi)PEDV檢測(cè)與定位分析。

圖6 用單抗4A7通過(guò)免疫組化試驗(yàn)檢測(cè)PEDV感染豬小腸中的病毒 (×100)

3 討論

豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、δ-冠狀病毒及輪狀病毒是引起仔豬腹瀉的常見(jiàn)病毒,臨床上這些病毒可單獨(dú)或混合感染引起腹瀉,臨床癥狀類似,需要實(shí)驗(yàn)室診斷才能夠確診[5-6,11]。對(duì)采集的仔豬腹瀉樣本的流行病學(xué)調(diào)查顯示,近年來(lái)PEDV的檢出率最高,是導(dǎo)致初生仔豬腹瀉、死亡的最主要原因[5,6]。研制快速、準(zhǔn)確診斷PED的檢測(cè)試劑,對(duì)有效防治該病、降低經(jīng)濟(jì)損失具有重要意義。

由于病毒的體外培養(yǎng)、提取和純化困難,花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)、成本高,所以通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù),在體外表達(dá)重組蛋白,以該重組蛋白作為抗原在單克隆抗體和其他檢測(cè)技術(shù)的研究中應(yīng)用十分廣泛。本研究首次表達(dá)、提取和純化了PEDV重組N蛋白,以其作為免疫原免疫小鼠,制備免疫脾細(xì)胞。此方案顯著降低了抗原制備成本,縮短了單克隆抗體的制備周期。考慮到抗體的抗原結(jié)合活性與特異性,本試驗(yàn)在篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞時(shí),用PEDV作為包被抗原,以確保篩選到的克隆為分泌PEDV特異單克隆抗體的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。

病毒、細(xì)菌、大分子蛋白等抗原可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng),引起B(yǎng)細(xì)胞活化?；罨腂細(xì)胞分化為不同漿細(xì)胞克隆,產(chǎn)生與抗原有特異性結(jié)合能力的不同類別的抗體,如IgG、IgM、IgA和gE等。當(dāng)抗原初次免疫小鼠后,體內(nèi)特異性抗體含量較低,主要成分為IgM；二次免疫后,抗體含量升高,此時(shí)抗體的主要成分為IgG,同時(shí)還會(huì)有少量的IgM?？贵w類別發(fā)生轉(zhuǎn)換受到多種因素的影響,如抗原性質(zhì)、免疫途徑與免疫佐劑、激活的Th細(xì)胞以及細(xì)胞因子等[12]。本試驗(yàn)中,用重組N蛋白共免疫了小鼠3次,在細(xì)胞融合前3 d,給小鼠進(jìn)行了沖擊免疫,此時(shí)體內(nèi)漿細(xì)胞分泌的抗體應(yīng)該以IgG類為主,但是本試驗(yàn)篩選出來(lái)的4株單克隆抗體均為IgMκ。此抗體類別與王隆柏等(2017)[13]報(bào)道的結(jié)果一致,其制備了兩株單克隆抗體,其中識(shí)別PEDV N蛋白的為IgM,識(shí)別M蛋白的為IgG2a。該結(jié)果提示,N蛋白可能更容易誘導(dǎo)IgM的產(chǎn)生,此現(xiàn)象很可能與蛋白本身的抗原性質(zhì)有關(guān)。至于這4株單抗識(shí)別的抗原表位是否相同以及表位序列,有待進(jìn)一步鑒定。

ELISA、Western Blot和免疫熒光鑒定結(jié)果表明,制備的4株單抗能夠與PEDV-N蛋白和細(xì)胞內(nèi)病毒發(fā)生特異性結(jié)合,說(shuō)明4株抗體具有良好的抗原結(jié)合活性。進(jìn)一步通過(guò)免疫組化技術(shù)和IPMA證明,單克隆抗體(4A7)能夠特異地識(shí)別PEDV人工感染豬小腸組織和感染Vero細(xì)胞內(nèi)的病毒。這些試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明,本試驗(yàn)制備的單抗能夠用于PEDV抗原檢測(cè)及感染病毒的組織定位分析,并可為ELISA、免疫層析試紙條以及化學(xué)發(fā)光免疫分析等PEDV診斷或檢測(cè)技術(shù)的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。