實(shí)驗(yàn)室檢測在羊病防控中的應(yīng)用

郭 銳,田永祥,周丹娜,劉 威,段正贏,楊克禮,劉澤文,袁芳艷,高 婷

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,湖北 武漢 430064；2.農(nóng)業(yè)部畜禽細(xì)菌病防治制劑創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430064；3.動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430064)

近年來,隨著我國養(yǎng)羊業(yè)的快速發(fā)展,養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大。但筆者發(fā)現(xiàn)養(yǎng)羊業(yè)的集約化養(yǎng)殖管理水平和疫病防控技術(shù),與養(yǎng)豬業(yè)相比差距較大,呈現(xiàn)規(guī)模化粗放式管理現(xiàn)象,導(dǎo)致羊病的種類越來越多,老病新發(fā)或新的疾病不斷暴發(fā)流行,隱性感染、非典型癥狀和混合感染無處不在,僅靠流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化難以確診,不能及時(shí)準(zhǔn)確制定防控措施,往往貽誤疾病治療的最佳時(shí)機(jī),導(dǎo)致羊群大量死亡。因此,我國養(yǎng)羊業(yè)在提高飼養(yǎng)管理水平的同時(shí),一定要重視實(shí)驗(yàn)室檢測在羊病防控中的應(yīng)用,筆者結(jié)合自身多年在家畜傳染病實(shí)驗(yàn)室檢測和臨床技術(shù)服務(wù)積累的經(jīng)驗(yàn),總結(jié)了以下幾點(diǎn)內(nèi)容供廣大獸醫(yī)工作者參考。

1 實(shí)驗(yàn)室主要開展的工作

實(shí)驗(yàn)室檢測內(nèi)容主要包括：抗體檢測、病原檢測、藥敏實(shí)驗(yàn)。養(yǎng)殖戶可根據(jù)不同的檢測目的,選擇不同的檢測項(xiàng)目。

1.1 抗體檢測 抗體檢測方法一般用于羊群免疫疫苗后進(jìn)行保護(hù)效果評(píng)價(jià),常用酶鏈免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測羊群的血清,該法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單、時(shí)間短、可同時(shí)檢測大量樣本,對(duì)人員要求不高。但目前抗體檢測試劑盒還不能區(qū)分抗體是由疫苗株還是野毒株產(chǎn)生的,只有通過有沒有免疫過疫苗進(jìn)行區(qū)分。實(shí)驗(yàn)室目前主要使用的是已經(jīng)商品化的試劑盒。

1.2 病原檢測 病原檢測主要有兩種方法：一種是病原分離鑒定,如細(xì)菌培養(yǎng)、動(dòng)物接種等直接檢測某種病原微生物是否存在,通過微生物的形態(tài)、生化特性來進(jìn)行定型；另一種是采用熒光定量PCR、膠體金等方法,檢測樣品中某種病原微生物的核酸是否存在。第一種方法做起來費(fèi)時(shí)費(fèi)力,第二種方法便利快捷,在較短時(shí)間就能得到結(jié)果,所以目前病原檢測主要采用的是第二種方法。熒光定量PCR檢測針對(duì)的是病原,針對(duì)性強(qiáng)、可確診,可確定病毒載量,確定發(fā)病的主要原因,但該方法對(duì)人員和儀器有一定的要求,需專業(yè)人員操作,專業(yè)人員需要有一定的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。目前很多科研院所正在研發(fā)一種膠體金免疫層析定量分析儀,體積小可隨身攜帶,可以插入不同的抗原抗體膠體金試紙條,進(jìn)行定性和定量檢測,未來幾年必將大量運(yùn)作到在羊病現(xiàn)在的檢測中[1]。

1.3 藥敏試驗(yàn) 通過病原檢測確定致病的主要致病細(xì)菌,對(duì)其進(jìn)行藥敏試驗(yàn)篩選敏感抗生素,一旦發(fā)生疫情就能及時(shí)使用敏感藥物進(jìn)行治療。如羊鏈球菌、羊大腸桿菌、羊巴氏桿菌、羊表皮膿包(金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌)等病,通過藥敏試驗(yàn)治療效果很好。

2 實(shí)驗(yàn)室檢測對(duì)羊病防控的意義

2.1 掌握羊群的健康狀況,找到早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防、早診斷、早治療。隨著高科技手段在獸醫(yī)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用,動(dòng)物疫病檢測技術(shù)也得到了普及推廣和提升,實(shí)驗(yàn)室檢測、診斷水平的提高,為防控動(dòng)物疫病提供了重要依據(jù)。通過病原學(xué)檢測,可以了解羊群是否攜帶或感染某種病原,定期檢測血清學(xué)的變化就可以做到防患于未然,及早發(fā)現(xiàn)問題,及早采取措施,起到一種預(yù)警的作用；通過抗體檢測可以了解羊群的整體免疫狀況,從而為相應(yīng)措施的采取提供依據(jù)。

2.2 免疫程序制定和評(píng)估疫苗效果 在動(dòng)物免疫中,通過實(shí)驗(yàn)室檢測分析各地區(qū)流行病原種類、飼養(yǎng)模式、營養(yǎng)水平、品種等差異導(dǎo)致疫苗抗體水平不同,以及結(jié)合比較不同廠家疫苗產(chǎn)生保護(hù)性抗體最早時(shí)間、維持時(shí)間、離散度和最高滴度等指標(biāo),制定適合本場的最佳疫苗免疫程序是十分必要的。特別是在使用疫苗尤其是活苗的時(shí)候,一定要考慮母源抗體的影響,最可靠和可行的方法就是通過血清學(xué)檢測來測定母源抗體的消長,來確定免疫接種的最佳時(shí)機(jī)。

2.3 確定發(fā)病“元兇”,實(shí)現(xiàn)疫病凈化 對(duì)規(guī)模養(yǎng)羊場來說,通過1年左右時(shí)間的定期實(shí)驗(yàn)室檢測,基本就能掌握該羊場主要發(fā)病的病原種類,那個(gè)階段羊群容易發(fā)病,然后通過采取免疫、淘汰和檢測三方面結(jié)合對(duì)該病原實(shí)現(xiàn)凈化,如：布魯菌病、小反芻獸疫等疾病。

3 實(shí)驗(yàn)室樣品的采集和送檢工作

3.1 樣品采集前的準(zhǔn)備工作

3.1.1 明確采樣目的 要做疫病監(jiān)測還是疫病診斷,目的不同采樣的方案也會(huì)不同。監(jiān)測以采集正常羊群血樣為主、病料為輔,樣品數(shù)量大；診斷以采集發(fā)病羊群病料為主。

3.1.2 做好詳細(xì)的記錄 畜主姓名和地址、品種、性別、年齡、臨床癥狀、眼觀病變表現(xiàn)(包括大小和位置)、已經(jīng)采取的措施(如有)、上次治療后復(fù)發(fā)的時(shí)間以及該群動(dòng)物的發(fā)病率/死亡率、相關(guān)疫苗免疫情況。如果懷疑為人獸共患病,應(yīng)在送檢單中明確標(biāo)注,提醒實(shí)驗(yàn)室檢測人員注意。

3.1.3 采樣物品的準(zhǔn)備 器械：包括采樣箱、保溫箱、酒精燈、酒精或者碘酒棉球、各規(guī)格的一次性獸用注射器和采血管等,滅菌好的大小解剖取樣器械、各種規(guī)格的離心管、玻璃瓶子、平皿、載玻片等,試管架,無菌棉球,膠帶,密封袋和冰袋等。記錄用具：包括記號(hào)筆、登記表、標(biāo)簽紙等,務(wù)必和器械類分開放置。樣品保護(hù)液：病料保存液(蒸餾水、生理鹽水、30%甘油緩沖液等)、固定液(95%酒精、10%福爾馬林溶液)。防護(hù)用品：根據(jù)需要應(yīng)包括：口罩、防護(hù)眼睛、膠靴、乳膠手套、連體服、防護(hù)帽、消毒液和噴壺、肥皂或者洗手液、手盆等。

3.2 樣品采集操作技術(shù) 尿：排尿時(shí),用1次性消毒塑料杯接取20～30 mL。糞：用棉拭子從直腸采集。膿汁、膽汁：用注射器吸取放入滅菌試管中。淋巴結(jié)、肺、肝、脾、腎等有典型病變部位采集1～2 cm3的組織塊,置滅菌容器中。血液：羊前腔靜脈采血。無菌采取10 mL,分別置于無抗凝劑和有抗凝劑的采血管中。腸：用線扎緊一段腸道的兩端,然后將兩端切斷,放入滅菌容器中?？诏彙⑺捫约膊悠穭t采取水皰皮、水皰液放入50%甘油緩沖鹽水中。流產(chǎn)胎兒整個(gè)裝入不透水的容器內(nèi)。

3.3 采樣過程中的注意事項(xiàng)

3.3.1 做好人員防護(hù) 采樣人員必須戴好手套、口罩、帽子,穿好工作服等防護(hù)用品后,才能進(jìn)行采樣操作,以減少被感染的機(jī)會(huì)(炭疽、布魯菌病、口蹄疫等)。死因不明的動(dòng)物尸體在解剖前應(yīng)先對(duì)病情、病史加以了解、詳細(xì)進(jìn)行檢查,如疑為炭疽(急性死亡、天然孔出血),切不可解剖,經(jīng)取末梢血液檢查排除炭疽后,方可解剖檢查,并采集病料。

3.3.2 選擇好最佳采樣時(shí)機(jī) 采集的病料力求新鮮。能進(jìn)行活體采集的病料盡量進(jìn)行活體采集,如采集血液、乳汁、尿液以及鼻拭子等?；疾?dòng)物死亡后,隨著時(shí)間的延長,尸體腐敗,組織器官的病理變化會(huì)發(fā)生一定程度的改變,病原體種類也可能增加,有礙于病原體的檢查。因此內(nèi)臟病料的采集,須于患病動(dòng)物死亡后立即進(jìn)行,一般不超過6 h,夏季最好不要超過4 h,冬季北方可適當(dāng)延長至24 h。

采集全血液樣品時(shí),被采羊群一般最好先禁食8 h。如果檢測病毒,最好在體溫升高,發(fā)病初期采集,對(duì)于懷疑帶毒而沒癥狀的動(dòng)物,最好被隔離7 d以前采樣。在平時(shí)做抗體檢測時(shí),應(yīng)采集兩次,第一次是在理論上抗體最先出現(xiàn)的時(shí)期采集,第二次是在理論上抗體快要達(dá)到消長的末期時(shí)采集。

用作寄生蟲檢測時(shí),要根據(jù)被檢測寄生蟲的特點(diǎn),決定相應(yīng)的時(shí)間和采血的部位,制成血涂片等。

3.3.3 采集有典型性針對(duì)性的適量樣品 診斷時(shí)一樣本最好發(fā)病初期(未用藥),臨床癥狀明顯期采集5只以上病死和發(fā)病動(dòng)物的有病變的器官組織、血清和抗凝血各10份。

免疫效果監(jiān)測時(shí)--動(dòng)物免疫后14～20 d,隨機(jī)采集同群動(dòng)物血清樣品30份。

3.3.4 病料采集 全過程要求無菌操作,做到一畜一套器械,防止樣品交叉污染。

3.4 樣品的處理 病理組織學(xué)檢測樣品：要想使試驗(yàn)診斷得出正確結(jié)果,除采取適當(dāng)?shù)牟×贤?需使病料保持或接近新鮮狀態(tài),為此需對(duì)病料進(jìn)行處理。采用10%福爾馬林液(10%甲醛溶液)或95%酒精等固定。固定液體積應(yīng)為病料的10倍。如用10%福爾馬林固定組織,經(jīng)24 h必須更換1次新鮮溶液。神經(jīng)系統(tǒng)組織需使用10%福爾馬林,并且加入5%～10%的碳酸鎂。

細(xì)菌學(xué)檢測樣品：一般用滅菌的液體石蠟、30%甘油緩沖鹽水或飽和氯化鈉溶液來保存病料。

病毒學(xué)檢測樣品：一般使用50%甘油緩沖鹽水,需作組織學(xué)檢查的材料最好使用包音氏固定液或岑克氏固定液。

血清學(xué)檢驗(yàn)材料：從發(fā)病羊無菌采取血液,注入滅菌試管中,室溫或37℃放置0.5～1 h(有利血清自然分離),然后4℃冷藏[2]。

3.5 樣品送檢 一般采集樣品后必須24 h內(nèi)送抵實(shí)驗(yàn)室,放在4℃左右的容器中運(yùn)送。送檢病料的容器一般采用保溫箱或泡沫盒,內(nèi)置冰塊進(jìn)行運(yùn)輸。送檢越快越好,避免病料接觸高溫和陽光,以免病料腐敗或病原體死亡。送檢過程中要防止傾倒、破碎、避免樣品泄漏,要注意有的樣品不能劇烈震蕩,要注意緩沖放置,所有樣品都要貼上能標(biāo)示采樣羊的詳細(xì)標(biāo)簽[3]。

4 樣品采集過程中的主要事項(xiàng)

4.1 病樣要新鮮 最好采集使用抗生素前的病料,新鮮性且有一定數(shù)量,每份樣品單獨(dú)分裝好標(biāo)注好。

4.2 血樣溶血的3種原因 送檢的血樣有溶血現(xiàn)象,可能是以下3種原因造成：(1)消毒采血部位時(shí),酒精未干即行采血,有可能混進(jìn)酒精造成溶血；(2)血清未分離出,攜帶血液經(jīng)坐摩托車、拖拉機(jī)等劇烈震蕩,使血細(xì)胞破裂引起溶血；(3)血液存放的容器不潔。

4.3 病料采集順序 采集病料的順序同解剖檢查的順序,即先胸腔后腹腔、先實(shí)質(zhì)器官后管狀器官。如需要細(xì)菌分離檢測,最好是解剖與接樣同時(shí)進(jìn)行,避免外界環(huán)境中細(xì)菌污染。

4.4 結(jié)合實(shí)際情況采集 在實(shí)際采樣工作中,應(yīng)結(jié)合流行病學(xué)特點(diǎn)、臨床癥狀和剖檢變化,大致懷疑是何種疫病,根據(jù)該種疫病的特點(diǎn)和需采取的檢查方法不同,采集相關(guān)的病料(見表1)。

5 檢測報(bào)告分析及注意事項(xiàng)

5.1 分析檢測報(bào)告的人必須是最熟悉養(yǎng)殖場的人 熟悉生產(chǎn)中的各個(gè)環(huán)節(jié),知道免疫程序是什么樣子,知道各個(gè)階段羊群免疫效果、發(fā)病率、死亡率,現(xiàn)在成為一名合格的獸醫(yī),必須從傳統(tǒng)的治療獸醫(yī)或保健獸醫(yī)轉(zhuǎn)變成管理獸醫(yī),拿到檢測報(bào)告后結(jié)合之前每個(gè)季度的檢測報(bào)告,馬上就能推算出問題出在哪里,后期可能那些羊群還會(huì)出現(xiàn)什么問題?應(yīng)急措施有哪些?(不能完全依賴檢測機(jī)構(gòu)的建議,除非知道你羊場1年以上詳細(xì)的病原和抗體檢測報(bào)告,生產(chǎn)環(huán)境和管理方式非常了解)。

表1 常見羊病病原檢測推薦采集部位

5.2 關(guān)注“離散度” 抗體離散度是指所測的樣品值與所有樣品平均值的距離,距離越大,離散度越大,它是衡量一個(gè)羊群檢測值均勻度的一個(gè)重要指標(biāo),其高低可以反映羊場在免疫后抗體水平的整齊度,為評(píng)價(jià)規(guī)?；驁稣w免疫效果重要指標(biāo)。以小反芻獸疫為例：群體免疫合格率與抗體離散度成反比關(guān)系,群體免疫合格率高,則抗體離散度低；反之,群體免疫合格率低,則抗體離散度高。合格標(biāo)準(zhǔn)：群體的離散度一般≤40%,種畜的離散度要求≤20%,商品畜可以放寬到≤25%。

6 總結(jié)

羊場疫病監(jiān)測不能完全依賴抗體水平監(jiān)測,必須病原檢測和抗體檢測相結(jié)合,因?yàn)榭贵w水平的形成很復(fù)雜,有的是打疫苗引起的,有的是自然感染的野毒引起的。我們?cè)诜治鰴z測結(jié)果的時(shí)候,不能用樣本陽性率去單一分析,需要結(jié)合離散度、平均抗體水平、臨床癥狀和生產(chǎn)水平綜合分析。同時(shí)在依據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果制定防控方案之前,一定要與送檢測場獸醫(yī)負(fù)責(zé)人詳細(xì)的了解實(shí)際情況,這樣實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果才能發(fā)揮最大的指導(dǎo)作用。