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    玉米雜交種新科891及其親本SSR 指紋圖譜的構建

    2019-05-21 03:24:56張瑞平周聯(lián)東王文潔劉經(jīng)緯李和順王學軍
    中國種業(yè) 2019年5期
    關鍵詞:新科雜交種自交系

    張瑞平 周聯(lián)東 王文潔 孫 佩 王 蕊 劉經(jīng)緯 李和順 王學軍

    (河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學院,新鄉(xiāng)453000)

    玉米雜交種和親本遺傳真實性是種子質量的重要標志之一,直接影響著玉米生產(chǎn)的產(chǎn)量和質量[1]。新品種逐年增加,高頻率使用骨干自交系使品種的遺傳基礎趨于狹窄,加大了品種鑒定的難度[2]。同工酶和蛋白電泳多態(tài)性不夠豐富,試驗條件要求嚴格,鑒定結果穩(wěn)定性低[3],已經(jīng)不能很好地鑒定種子的真實性和純度。SSR 標記因具有快速、準確、信息含量高、呈共顯性分離、易于分析、重復可靠等優(yōu)點,在分析自交系親緣關系[4-5]和雜交種純度[6-8]等方面發(fā)揮了重要作用。趙久然等[9]建立了46 個玉米自交系和雜交種的DNA 指紋圖譜數(shù)據(jù)庫,為更好地鑒定種子的純度和真實性提供了方便。

    新科891 于2018 年通過國家農(nóng)作物品種審定委員會審定,審定編號:國審玉20186115。本文利用SSR 分子標記技術,對新科891 及其親本進行分析,構建SSR-DNA 指紋圖譜,并將SSR 引物擴增的條帶數(shù)字化,計算出現(xiàn)相同數(shù)字指紋圖譜的概率,以期為更準確地鑒定該品種提供參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料 雜交種新科891 及其父本PHA458和母本S155 均由河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學院玉米課題提供。試驗所用DNA 聚合酶、dNTP 購買于寶生物工程(大連)有限公司。用于SSR 分析的56對引物序列來自玉米基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.maizegdb.org/ssr.php),由上海生物工程股份有限公司合成。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 DNA 提取 將雜交種新科891 及其親本PHA458 和S155 種子沙培,置于30℃培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)。3 葉1 心時取葉片混樣,用CTAB 的方法提取總DNA[10],紫外分光光度計檢測DNA 的質量和濃度,加水稀釋至25ng/μL,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 擴增體系及電泳分析 反應總體積為20μL,包 括dNTPs 0.2mmol/L、引 物0.25μmol/L 和 模 板DNA 25ng,加滅菌純水補足體積。PCR 擴增程序為:94℃預變性5min;94℃40s,60℃35s,72℃45s,35個循環(huán);72℃延伸10min。PCR 擴增反應在BIOER TC-96/G/H(b)型PCR 儀上進行。在擴增產(chǎn)物中分別加入上樣緩沖液6×Loading Buffer,混勻后各取3.5μL 在8.0%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測,凝膠通過銀染顯色。然后在膠片觀測燈上觀察電泳結果,用凝膠成像系統(tǒng)掃描圖片或者用相機拍照保存圖片。

    1.2.3 指紋圖譜構建及數(shù)字化 篩選帶型清晰、穩(wěn)定的引物構建雜交種新科891 的指紋圖譜,并將指紋圖譜數(shù)字化。在相同遷移率位置(分子量相同片段)有帶記為1,無帶記為0,建立數(shù)據(jù)庫。根據(jù)公式P=1/2n計算相同指紋圖譜有可能出現(xiàn)的概率[1,11],式中“2”為相同遷移率位點上等位基因存在的“有”或“無”(數(shù)字化處理中用1 或0 表示)兩種關系;“n”為等位基因的數(shù)目;2n為檢測n 個等位基因時有可能涉及的所有自交系的個數(shù)。

    2 結果與分析

    2.1 SSR 引物篩選 從56 對分布于玉米10 條染色體上的SSR 引物中篩選出擴增帶型穩(wěn)定、重復性好的7 對引物,用于構建雜交種新科891 的指紋圖譜,這7對引物分布在玉米的7 條染色體上,共檢測出23 個等位基因,每對引物可檢測出2~4 個等位基因,平均為3.29 個,片段大小在200~400bp 之間(表1)。

    表1 用于構建新科891 指紋圖譜的引物信息

    2.2 指紋圖譜構建 雜交種新科891 的指紋圖譜如圖1 所示,雜交種891 及其父母本由引物bnlg439w1、umc2007y4、umc2015k3、bnlg2291k4、umc1705w1、bnlg1702k1 以及phi0801k15 擴增的主條帶大小在200~400bp 之間。這7 對引物所擴出的雜交種新科891 的主條帶均是父本和母本主條帶的疊加,很好地印證了SSR 分子標記共顯性的遺傳特點[12]。

    圖1 雜交種新科891 及其親本SSR 指紋圖譜

    2.3 指紋圖譜數(shù)字化 將篩選出的7 對引物擴增的片段數(shù)字化,并計算出雜交種新科891 及其親本出現(xiàn)相同數(shù)字指紋圖譜的概率(表2),以父本PHA458 為例,數(shù)字指紋由23 個順序不同的數(shù)字構成,出現(xiàn)與其完全相同數(shù)字的概率為1.19×10-7(P=1/223),即在8.4×106(223)份自交系中,只有1 份自交系與上述指紋號碼相同。由此可見,出現(xiàn)與之完全相同數(shù)字指紋的概率極低,這個數(shù)字指紋圖譜是其特有的。同理,由這7 對引物構建的雜交種新科891 及其母本S155 的數(shù)字化指紋圖譜也是特有的,可用于品種的真實性和純度鑒定。

    表2 新科891 及其親本的數(shù)字化指紋圖譜

    3 結論

    相對于其他標記,SSR 標記比較穩(wěn)定并且隨機性更強,能提供更多的遺傳信息。同時SSR 標記檢測簡便、快捷,又是共顯性標記,所以越來越多的應用在遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建、自交系系譜研究、雜交優(yōu)勢群和DNA 指紋圖譜建立上[1]。本研究針對雜交種新科891 及其父母本,利用SSR 分子標記,從56 對引物中篩選出7 對重復性及穩(wěn)定性好、帶型清晰的引物,用于構建新科891 及其親本的指紋圖譜,并且將擴出的條帶數(shù)字化,建立雜交種新科891 及其親本的數(shù)字指紋圖譜,計算出現(xiàn)相同指紋的概率均為1.19×10-7,概率極低。因此,這7 對引物構建的雜交種新科891 的指紋圖譜是特有的,在生產(chǎn)上可隨機選擇1~2 對引物用于雜交種新科891純度和真實性鑒定,可操作性強。

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