超高效液相色譜法測(cè)定不同配伍比黃芪—葛根藥對(duì)中葛根素的含量

林靜瑜， 李東曉， 戴雅彬， 黃可兒

（1.福建省中醫(yī)藥研究院，福建福州 350003；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405；3.福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建福州 350101）

黃芪—葛根藥對(duì)出自于《證治匯補(bǔ)》卷三之黃芪葛根湯，方中著有“黃芪一兩、葛根五錢(qián)”，用于“酒郁”，《醫(yī)略六書(shū)》將此方作為“虛人傷酒惡寒之專方”，清代張錫純玉液湯以“黃芪五錢(qián)、葛根一錢(qián)半”組方治消渴，現(xiàn)臨床多用于治療氣陰兩虛的糖尿病及其并發(fā)癥和痹癥等[1-3]。中藥是復(fù)雜化學(xué)成分的載體，藥對(duì)是研究中藥復(fù)方的最基本單位，不同配伍規(guī)律的藥對(duì)共煎煮后，其化學(xué)成分及成分的比例可能會(huì)產(chǎn)生較大的變化，從而導(dǎo)致藥理活性的改變[4-6]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃芪—葛根藥對(duì)改善胃黏膜損傷效果不錯(cuò)，且在配伍比例不變時(shí)，其胃黏膜保護(hù)作用與不同水煎工藝所得的葛根素含量有一定的相關(guān)性[7，8]。葛根素為中藥野葛的質(zhì)控成分，藥理研究證實(shí)葛根素具有一定的胃黏膜保護(hù)作用[9，10]。為進(jìn)一步探討黃芪、葛根藥對(duì)配伍規(guī)律對(duì)其胃黏膜保護(hù)藥效物質(zhì)的影響，本研究以葛根素含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用超高效液相色譜—紫外（UPLC-UV）法研究不同配伍比例的黃芪、葛根水煎后葛根素含量的影響，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料

1.1儀器ACQUITY H-Class超高效液相色譜儀（包括四元高壓梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器、EmpowerⅢ色譜工作站，Waters公司）；ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱（美國(guó)Waters公司）；SB-5200DT超聲清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；AEG-220電子分析天平（日本島津公司）；Direct-Q3型高純水制備儀（美國(guó)Milipore公司）；DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2藥品與試劑黃芪（產(chǎn)地甘肅，南京同仁堂中藥飲片有限公司，批號(hào)：20180908），葛根（南京同仁堂中藥飲片有限責(zé)任公司，批號(hào)：20170701），黃芪、葛根飲片由福建中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室車蘇容副教授鑒定，分別為豆科植物 蒙 古 黃 芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao的根、豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwir的根；葛根素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110752-201514，純度95.5%）；甲醇（德國(guó)Merck公司，色譜純）；其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1對(duì)照品溶液和供試品溶液的制備

2.1.1 葛根素對(duì)照品溶液的制備 取葛根素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成濃度1.021 mg·mL-1的葛根素對(duì)照品液，4℃貯存，備用。

2.1.2 黃芪—葛根藥對(duì)供試品溶液的制備 參照文獻(xiàn)[6]水煎工藝，取黃芪、葛根藥材各適量，制備8個(gè)不同配伍比黃芪—葛根藥對(duì)水煎液（0∶1、1∶1、2∶1、3∶1、5∶1、1∶2、1∶3、1∶5），總藥材量固定為100 g，水煎濃縮為1 g·mL-1。取水煎液1 mL，加4 mL蒸餾水稀釋，混合均勻。精密吸取水煎稀釋液5 mL置于錐形瓶中，加入甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷；加甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)；精密吸取續(xù)濾液5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得各配伍比供試品溶液。

2.1.3 陰性供試品溶液的制備 取黃芪藥材適量，按“2.1.2”供試品溶液制備方法制備不含葛根的黃芪水煎液，作為陰性供試品溶液。

表1 不同配伍比黃芪—葛根藥對(duì)組成Table 1 Different compatibility ratios of Radix Astragali-Radix Puerariae herb pair

2.2方法學(xué)考察

2.2.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：甲醇—0.1%冰醋酸水溶液（29∶71）；流速：0.2 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：2 μL，理論塔板數(shù)按所測(cè)葛根素色譜峰計(jì)算不低于6 000。

2.2.2 專屬性試驗(yàn) 精密吸取“2.1.1”制備的葛根素對(duì)照品溶液、陰性供試品溶液及黃芪—葛根藥對(duì)水煎液（2∶1，批號(hào)：20181022）供試品溶液各2 μL，注入色譜儀，按“2.2.1”色譜條件分析，記錄葛根素對(duì)照品、供試品的色譜圖及保留時(shí)間。結(jié)果顯示：葛根素的保留時(shí)間約為8.6 min，此色譜條件下黃芪—葛根藥對(duì)水煎液中葛根素峰形良好，出峰時(shí)間穩(wěn)定，具有良好的專屬性，葛根素對(duì)照品溶液和供試品溶液在同一保留時(shí)間處出峰，陰性供試品溶液沒(méi)有色譜峰出現(xiàn)，見(jiàn)圖1。

2.2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取葛根素對(duì)照品液，加甲醇分別配制成0.816 8 mg·mL-1、0.510 5 mg·mL-1、0.255 3 mg·mL-1、0.127 6 mg·mL-1、0.063 8 mg·mL-1、0.031 9 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行分析，記錄保留時(shí)間和峰面積。以對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程Y＝5.989 5×107X-1.832 7×106（r＝0.999 7），結(jié)果表明葛根素在濃度0.031 9～0.816 8 mg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取葛根素對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，并計(jì)算其峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，sR）為0.85%，結(jié)果表明儀器精密度符合要求。

2.2.5 重復(fù)性考察 精密吸取黃芪—葛根藥對(duì)水煎液（2∶1，批號(hào)：20181022）1 mL，按“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法平行操作6次，按“2.2.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定并記錄色譜圖，計(jì)算葛根素含量，結(jié)果其sR為2.62%，表明該方法重復(fù)性符合要求。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一黃芪—葛根藥對(duì)水煎液，按“2.1.2”供試品溶液制備方法制得供試品溶液，于制備后0、2、6、8、10、12、24 h分別取同一供試品溶液2 μL進(jìn)樣，在“2.2.1”同一色譜條件測(cè)定葛根素峰面積，計(jì)算葛根素峰面積sR為0.25%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 加樣回收率 吸取上述已知葛根素含量的黃芪—葛根藥對(duì)水煎稀釋液（2∶1，批號(hào)：20181022）適量（含葛根素1.401 3 mg）， 共6份，置于錐形瓶中。按1∶1比例加入葛根素對(duì)照品溶液，搖勻，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，按“2.2.1”色譜條件方法進(jìn)樣2 μL。計(jì)算加樣回收率，結(jié)果平均回收率為96.11%，sR為1.28%，見(jiàn)表2。

圖1 葛根素對(duì)照品及黃芪—葛根藥對(duì)水煎液色譜圖Figure 1 UPLC.Results of puerarin reference and the decoction of Radix Astragali-Radix Puerariae herb pair

2.2.8 含量測(cè)定 按“2.1.2”項(xiàng)下方法，平行制備5份8個(gè)不同配伍比黃芪—葛根藥對(duì)（0∶1、1∶1、2∶1、3∶1、5∶1、1∶2、1∶3、1∶5）供試品溶液。按“2.2.1”項(xiàng)下葛根素的色譜條件方法進(jìn)樣2 μL，測(cè)定葛根素峰面積，代入“2.2.3”線性方程中，計(jì)算各藥對(duì)水煎液中葛根素的平均質(zhì)量濃度及平均含量。葛根素質(zhì)量濃度及含量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組資料若符合正態(tài)分布，組間比較采用單因素方差分析，方差齊性，采用Dunnett-t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)，采用Dunnett'sT3檢驗(yàn)。結(jié)果顯示：與黃芪—葛根藥對(duì)0∶1配伍比組（葛根單煎液）相比，加入黃芪的各配伍比組葛根素含量均有增加的趨勢(shì)，并隨黃芪在藥對(duì)中比例的增高而上升，但非倍增關(guān)系。其中，藥對(duì)以5∶1配伍時(shí)，葛根素含量最高，配伍比為3∶1、2∶1、1∶1時(shí)次之（與0∶1配伍比組比較，均P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表2 葛根素加樣回收率試驗(yàn)Table 2 The recovery.Results of puerarin

表3 不同配伍比黃芪—葛根藥對(duì)水煎液中葛根素的含量測(cè)定Table 3 Comparison of the puerarin content of Radix Astragali-Radix Puerariae herb pair with different compatibility ratios（n=5）(-x ± s)

3 討論

3.1色譜條件的選擇《中國(guó)人民共和國(guó)藥典》（2015）規(guī)定野葛藥材中葛根素含量不低于質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.4%。本研究采用超高效液相色譜—紫外法檢測(cè)葛根素，通過(guò)分析供試品特征圖譜，發(fā)現(xiàn)黃芪—葛根藥對(duì)水煎液的相關(guān)成分紫外吸收主要集中在220～350 nm處，且葛根素在250 nm處有最大吸收。同時(shí)考察了甲醇—水，甲醇—0.1%醋酸水溶液、乙腈—水和乙腈—0.1%醋酸水溶液等流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果顯示：以甲醇—水為流動(dòng)相時(shí)，葛根素色譜峰拖尾嚴(yán)重，而以乙腈代替甲醇，葛根素色譜峰峰型較好，但與其他成分色譜峰分離度差。若以0.1%的醋酸代替水，葛根素峰型較好且分離度好，最終確定“2.2.1項(xiàng)”下色譜條件。

3.2黃芪—葛根藥對(duì)的不同比例配伍對(duì)葛根素濃度、煎出量的影響劑量與配伍比是中藥組方的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，其合理性也逐漸得到現(xiàn)代科學(xué)的驗(yàn)證。黃芪—葛根藥對(duì)常見(jiàn)配伍比主要有1∶1、2∶1、3∶1或其近似值，葛根比例高于黃芪則較少見(jiàn)。研究報(bào)道：黃芪和葛根配伍時(shí)，大多數(shù)成分的溶出量較單煎時(shí)高[11]。本研究側(cè)重考察黃芪—葛根藥對(duì)配伍比例對(duì)葛根素煎出量的影響，研究結(jié)果（表3）顯示：①黃芪—葛根藥對(duì)中葛根素的濃度隨著葛根比例的增高而上升，但無(wú)倍增關(guān)系，以0∶1配伍比組（葛根單煎液，葛根比例為100%）最高，5∶1配伍比組（葛根比例為16.7%）最低；②黃芪—葛根藥對(duì)中黃芪對(duì)葛根素的煎出量有明顯的促進(jìn)作用，葛根素的煎出量隨著黃芪在藥對(duì)中比例的增高而呈波段式上升，以5∶1配伍時(shí)（黃芪比例為83.3%）葛根素煎出量最高，3∶1、2∶1次之，1∶1居中，1∶2、1∶3、1∶5 3個(gè)配伍比組中葛根素的煎出量較低，但仍呈高于葛根單煎液的趨勢(shì)，說(shuō)明黃芪對(duì)葛根素的煎出量影響明顯；③黃芪—葛根藥對(duì)水煎液中葛根素濃度同時(shí)受藥對(duì)中葛根的比例及黃芪的配伍的影響。該部分結(jié)果與佟志斌等[12]的研究結(jié)果稍有不同，可能與本研究所采用的葛根來(lái)源、水煎工藝及處理方法等不同有關(guān)。

黃芪葛根湯中黃芪為“君”，葛根為“臣”，屬“七情”中“相須”、“相使”配伍，不同的配伍比例對(duì)黃芪—葛根藥對(duì)葛根素的含量存在明顯的影響，說(shuō)明臨床黃芪—葛根藥對(duì)的配伍應(yīng)用確有其合理性。本研究?jī)H就不同配伍比黃芪—葛根藥對(duì)中葛根素的含量變化進(jìn)行探討。黃芪、葛根及其指標(biāo)成分的配伍在藥理和化學(xué)層次上是否存在相似的協(xié)同作用？我們將在后續(xù)工作中繼續(xù)考察黃芪—葛根藥對(duì)的配伍關(guān)系對(duì)其他指標(biāo)成分的影響，并結(jié)合藥效實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)黃芪—葛根藥對(duì)保護(hù)胃黏膜的作用基礎(chǔ)。