微波協(xié)同酶法提取甜地丁槲皮素的工藝研究

寧 娜 , 韓建軍 , 胡宇莉

(1.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，貴州銅仁554300 ； 2.貴州省中獸藥工程研究中心 ，貴州銅仁554300 ； 3.重慶市動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，重慶渝北401120)

甜地丁為豆科植物米口袋Gueldenstaedtiaverna(Georgi.) A.Bor. 的干燥全草，其性寒味甘、苦，具清熱解毒的功效，主治癰腫疔瘡、外耳道癤腫、闌尾炎等[1]。甜地丁主要含有槲皮素、木犀草素、芹菜素等黃酮類成分[2-3]。研究表明，槲皮素作為飼料添加劑可以提高雞生產(chǎn)性能及改善脂肪粗脂肪含量[4]、改善產(chǎn)蛋后期蛋殼品質(zhì)[5]、促進(jìn)吉富羅非魚幼魚生長及增強(qiáng)非特異性免疫能力[6]等。

微波協(xié)同酶法是將微波法和生物酶結(jié)合起來進(jìn)行中藥有效成分提取的一種聯(lián)用技術(shù)，即先利用酶解法充分破壞植物細(xì)胞壁，再利用微波法促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)有效成分溶出[7]。目前微波協(xié)同酶法已被應(yīng)用于艾葉[8]、金櫻子[9]、生姜[10]等天然植物有效成分的提取中。微波協(xié)同酶法在甜地丁槲皮素提取中的應(yīng)用尚未見報(bào)道。本文探究了甜地丁槲皮素的微波協(xié)同酶法提取工藝，以期為該資源的進(jìn)一步開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Agilent1200型高效液相色譜儀(美國Agiletn公司)；KQ-500DE臺式數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；CPA225D型十萬分之一電子天平(德國Sartorius公司)；PHS-25型數(shù)字式顯示酸度計(jì)(上海偉業(yè)儀器廠)；甲醇為色譜純，水為重蒸水，其余試劑為分析純；槲皮素對照品(中國食品藥品檢定研究院，含量為99.10%)；纖維素酶(寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司，酶活力為20 000 U/g)；果膠酶(寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司，酶活力為30 000 U/g)。

1.2 藥材 甜地丁藥材，購自安徽亳州中藥材市場，產(chǎn)地為安徽，經(jīng)銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院梁玉勇教授鑒定為豆科植物米口袋Gueldenstaedtiaverna(Georgi) A. Bor.的干燥全草。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 槲皮素的HPLC測定 參照《中華人民共和國獸藥典》[11]進(jìn)行槲皮素含量測定。采用 Diamonsil C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸溶液(50 ∶50)；流速為1.0 mL/min；檢視波長為360 nm；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2 微波協(xié)同酶法提取槲皮素的工藝設(shè)計(jì) 甜地丁的提取按照以下流程進(jìn)行：甜地丁→干燥、粉碎過40目篩→酶解→微波提取→減壓濃縮至100 mL→槲皮素提取液。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[12]及前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，確定微波提取條件為：加入20倍量70%乙醇，在微波功率為400 W條件下微波提取5 min。

1.3.3 槲皮素得率的計(jì)算 精密吸取槲皮素提取液0.2 mL至50 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，參照1.3.1的色譜條件對提取液中槲皮素含量進(jìn)行測定，并根據(jù)峰面積計(jì)算槲皮素得率。槲皮素得率按照如下公式進(jìn)行計(jì)算：槲皮素得率(mg/g)=提取液中槲皮素含量(mg)/甜地丁藥材質(zhì)量(g)。

1.3.4 微波協(xié)同酶法提取槲皮素的工藝優(yōu)化 通過單因素試驗(yàn)分別考察酶種類、酶解pH值、酶解溫度、酶解時(shí)間及酶用量對槲皮素得率的影響。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)來優(yōu)化微波協(xié)同酶法提取槲皮素的工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 槲皮素的HPLC測定結(jié)果 按照1.3.1的色譜條件，分別對槲皮素對照品及甜地丁藥材進(jìn)行測定，得到色譜圖如圖1所示。峰面積Y與槲皮素濃度X(μg/mL)之間的回歸方程為：Y=424 750.49X-343 791.41, R2=0.999 9。結(jié)果表明，槲皮素濃度在5～160 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

圖1 槲皮素對照品(A)和甜地丁藥材(B)的高效液相色譜圖

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 酶的種類 稱取甜地丁藥材粉末(過40目篩)15 g，加入10倍量蒸餾水，在酶解pH值4.5、酶解溫度45 ℃、酶解時(shí)間70 min，酶用量0.8%條件下，考察酶種類(纖維素酶、果膠酶、纖維素酶 ∶果膠酶=2 ∶1、纖維素酶 ∶果膠酶=1∶1、纖維素酶∶果膠酶=1∶2)對槲皮素得率的影響。試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

由圖2可知，復(fù)合酶較單一酶組的槲皮素得率高，復(fù)合酶中當(dāng)纖維素酶與果膠酶按照2 ∶1的比例組合時(shí)，槲皮素得率最高。因此后續(xù)試驗(yàn)選用復(fù)合酶(纖維素酶 ∶果膠酶=2 ∶1)對甜地丁藥材進(jìn)行酶解處理。

2.2.2 酶解pH值 稱取甜地丁藥材粉末(過40目篩)15 g，加入10倍量蒸餾水，在酶解溫度45 ℃、酶解時(shí)間70 min，復(fù)合酶(纖維素酶∶果膠酶=2∶1)用量0.8%條件下，考察酶解pH值(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5)對槲皮素得率的影響。試驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖2 酶種類對槲皮素得率的影響

圖3 酶解pH值對槲皮素得率的影響

由圖3可知，當(dāng)pH值為4.5時(shí)，槲皮素得率最高。當(dāng)pH值高于4.5時(shí)或低于4.5時(shí)，均影響復(fù)合酶的活性。因此，選擇酶解pH值4.5左右。

2.2.3 酶解溫度 稱取甜地丁藥材粉末(過40目篩)15 g，加入10倍量蒸餾水，在酶解pH值4.5、酶解時(shí)間70 min，復(fù)合酶(纖維素酶 ∶果膠酶=2 ∶1)用量0.8%條件下，考察酶解溫度(35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃)對槲皮素得率的影響。試驗(yàn)結(jié)果見圖4。

圖4 酶解溫度對槲皮素得率的影響

由圖4可知，當(dāng)溫度為45 ℃時(shí)，槲皮素得率最高。當(dāng)溫度高于45 ℃時(shí)或低于45 ℃時(shí)，均影響復(fù)合酶的活性。因此，選擇酶解溫度45 ℃左右。

2.2.4 酶解時(shí)間 稱取甜地丁藥材粉末(過40目篩)15 g，加入10倍量蒸餾水，在酶解pH值4.5、酶解溫度45 ℃，復(fù)合酶(纖維素酶 ∶果膠酶=2 ∶1)用量0.8%條件下，考察酶解時(shí)間(30 min、50 min、70 min、90 min、110 min)對槲皮素得率的影響。試驗(yàn)結(jié)果見圖5。

圖5 酶解時(shí)間對槲皮素得率的影響

由圖5可知，槲皮素得率隨著酶解時(shí)間延長而增長。當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到70 min后，繼續(xù)延長酶解時(shí)間，槲皮素得率的增長趨勢趨于平緩。因此，選擇酶解時(shí)間70 min左右。

2.2.5 復(fù)合酶用量 稱取甜地丁藥材粉末(過40目篩)15 g，加入10倍量蒸餾水，在酶解pH值4.5、酶解溫度45 ℃，酶解時(shí)間70 min條件下，考察復(fù)合酶(纖維素酶 ∶果膠酶=2 ∶1)用量(0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%)對槲皮素得率的影響。試驗(yàn)結(jié)果見圖6。

圖6 復(fù)合酶用量對槲皮素得率的影響

由圖6可知，隨著復(fù)合酶用量的增加，促進(jìn)對甜地丁植物細(xì)胞壁的破壞，槲皮素得率不斷增加，當(dāng)復(fù)合酶用量為0.8%時(shí)，槲皮素得率達(dá)到最高。隨著進(jìn)一步增加酶用量，過多的復(fù)合酶包裹于植物細(xì)胞壁外側(cè)，阻礙槲皮素的溶出，使得槲皮素得率呈下降趨勢。因此，選擇復(fù)合酶(纖維素酶 ∶果膠酶=2 ∶1)用量0.8%左右。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇酶解pH值(A)、酶解溫度(B)、酶解時(shí)間(C)、復(fù)合酶(纖維素酶 ∶果膠酶=2 ∶1)用量(D)4個(gè)因素，以槲皮素得率為考察指標(biāo)，按照L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平安排見表1，正交試驗(yàn)的結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

表2 微波協(xié)同酶法提取甜地丁槲皮素正交試驗(yàn)分析

表3 槲皮素得率方差分析

由表3可知，各因素對槲皮素得率的影響順序?yàn)锳>C>D>B，優(yōu)化得到的最佳工藝條件為：A2B3C2D2，即：酶解pH值4.5，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間70 min，復(fù)合酶(纖維素酶 ∶果膠酶=2 ∶1)用量0.8%。由表3可知，酶解pH值對槲皮素得率影響顯著，其他3個(gè)因素均無顯著性影響。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 按照上述優(yōu)化的工藝條件，平行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果槲皮素的平均得率為1.20 mg/g(RSD=0.96%)，高于正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的9組槲皮素得率數(shù)值，表明該工藝穩(wěn)定、可行，可作為微波協(xié)同酶法提甜地丁槲皮素的最佳工藝條件。

3 結(jié)論

本研究通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對微波協(xié)同酶法提取甜地丁槲皮素的工藝進(jìn)行了優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果表明：酶解pH值對槲皮素得率的影響達(dá)到顯著性水平，優(yōu)化得到的最佳工藝條件為：酶解pH值4.5，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間70 min，復(fù)合酶(纖維素酶∶果膠酶=2∶1)用量0.8%。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示：在優(yōu)化的工藝條件下，槲皮素得率達(dá)到1.20 mg/g。該工藝條件穩(wěn)定、可行，可作為微波協(xié)同酶法提取工藝條件，為甜地丁槲皮素的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的數(shù)據(jù)參考，為甜地丁資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。