腹瀉犬腸道分離菌的鑒定及耐藥性分析

張傳美，徐塵楓，鄒 玲，賀西軍，楊海燕，單 虎

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，山東青島266109 ； 2.山東省日照市畜牧開發(fā)服務(wù)站，山東日照276800)

腹瀉(Diarrhea)是一種常見癥狀，在犬上最常發(fā)生，引起犬腹瀉的原因很多，如病毒、細菌或寄生蟲，還有食物中毒、藥物中毒、營養(yǎng)性原因等都可引起腹瀉。其中細菌性感染引起的犬腹瀉較常見，占所有腹瀉病例數(shù)的30%以上[1-2]。引起犬腹瀉的致病菌包活大腸桿菌、沙門菌、彎曲桿菌、志賀菌等[3]。犬與人朝夕相處，關(guān)系密切，在人和動物之間細菌耐藥性傳播中起到重要的作用，因為它們使用的治療藥物也與人類相似，所以，犬源耐藥菌很容易轉(zhuǎn)移到人源細菌中，犬作為耐藥菌貯存宿主的問題需要得到更多關(guān)注。隨著各類抗菌藥在臨床治療上的廣泛應(yīng)用，耐藥性的問題愈來愈嚴重，研究表明，犬攜帶的人獸共患病病原菌呈現(xiàn)耐藥性升高的趨勢，且耐藥譜也越來越廣[4]。本試驗對腹瀉病犬的腸道菌進行分離鑒定、藥敏試驗及耐藥性分析，了解犬源分離菌株的耐藥情況，以期為臨床合理用藥和耐藥情況監(jiān)測提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)、LB肉湯、革蘭染色劑等,均購自北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司；符合YY/T1191-2011標準的藥敏紙片，購自杭州濱和微生物試劑有限公司；DNA Marker、Mixture PCR(酶)，均購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；細菌DNA提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 細菌的分離、純化 無菌采集臨床上9例患有腹瀉癥狀的病犬的肛門拭子，將肛拭子劃線接種于TSA培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察細菌生長情況及菌落特征。將具有不同典型特征的單個菌落進行純化培養(yǎng)，并革蘭染色鏡檢。

1.3 16S rDNA鑒定 經(jīng)純培養(yǎng)的細菌，使用細菌DNA柱式提取試劑盒提取DNA，合成16S rDNA通用引物，上游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。目的片段為1 428 bp。PCR反應(yīng)體系為25 μL，Mix PCR(2×)酶12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，超純水8.5 μL。PCR的反應(yīng)條件94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物，1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，鑒定陽性后送青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進行測序，結(jié)果提交GenBank數(shù)據(jù)庫比對，確定其所屬菌種。

1.4 藥敏試驗 選用3大類抗菌藥物，包括β-內(nèi)酰胺類：頭孢曲松、頭孢他啶、氨芐西林；氨基糖苷類：阿米卡星、慶大霉素；氟喹諾酮類：恩諾沙星、環(huán)丙沙星共7種藥敏紙片進行藥敏試驗，游標卡尺測量抑菌圈直徑，平行試驗3次，計算其平均值，結(jié)果按臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)標準判定。

1.5 耐藥基因檢測 根據(jù)文獻發(fā)表序列(表1)，使用PCR方法檢測耐藥基因，引物合成和測序均由青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司完成。

表1 耐藥基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 細菌分離鑒定結(jié)果 從9例臨床病例中分離出12株典型的菌株，其中8株具有腸桿菌特征，3株具有假單胞菌特征，1株具有腸球菌特征。12株分離菌純培養(yǎng)菌落使用16S rDNA通用引物經(jīng)PCR擴增后，均得到大小為1 428 bp的目的條帶，與預(yù)期的結(jié)果相同。測序?qū)Ρ冉Y(jié)果表明：菌株1～8為大腸桿菌，菌株9～11為銅綠假單胞菌，菌株12為糞腸球菌。

2.2 藥敏試驗結(jié)果 藥敏試驗結(jié)果見表2。β-內(nèi)酰胺類3種藥物中，除1株大腸桿菌對頭孢他啶耐藥外，其余菌株對頭孢曲松和頭孢他啶均敏感，但對氨芐西林耐藥率高，達91.7%。氨基糖苷類2種藥物中，對阿米卡星耐藥率低，對慶大霉素耐藥率高，達83.3%。氟喹諾酮類2種藥物中，對環(huán)丙沙星耐藥率低，對恩諾沙星耐藥率較高，為41.7%。

圖1 分離株16S rDNA基因PCR結(jié)果

M：DL-2 000 DNA Marker ；-：陰性對照 ； 1～12：分離菌株

表2 分離菌株的藥敏試驗結(jié)果

S： 敏感 ； I： 中度敏感 ； R： 耐藥

2.3 耐藥基因檢測結(jié)果

2.3.1 β-內(nèi)酰胺酶基因和ESBL-抗生素耐藥基因檢測結(jié)果 β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因blaTEM和blaSHV檢出率均為100%。ESBL-抗生素耐藥基因blaCTX-M-8的檢出率為83.3%，2號大腸桿菌與12號糞腸球菌未檢測到ESBL-抗生素耐藥基因blaCTX-M-8(圖2，表3)。

圖2 分離株blaTEM、blaSHV基因PCR結(jié)果

M：DL-1 000 DNA Marker ；-：陰性對照 ； 1～8：8株大腸桿菌分離株 ；9～11：3株銅綠假單胞菌分離株 ； 12：1株糞腸球菌分離株

2.3.2 氨基糖苷類耐藥基因檢測結(jié)果 12株分離株，氨基糖苷類耐藥基因中基因aac(3)-II的檢出率為100%。aac(6’)-Ib基因檢出率為66.7%，8株大腸桿菌中有4株未檢測到該基因，3株綠膿桿菌和1株糞腸球菌均檢測到該基因?；騛acC2檢出率為41.7%，8株大腸桿菌中僅有1株檢測到該基因，3株綠膿桿菌和1株糞腸球菌均檢測到該基因(圖3，表3)。

圖3 分離株aac(3)-II、aac(6’)-Ib、aacC2基因PCR結(jié)果

M：DL-1 000 DNA Marker；-：陰性對照 ； 1～8：8株大腸桿菌分離株； 9～11 ： 3株銅綠假單胞菌分離株 ; 12：1株糞腸球菌分離株

2.3.3 氟喹諾酮類耐藥基因檢測結(jié)果 12株分離菌株中，氟喹諾酮類耐藥基因qnrS的檢出率為83.3%，僅有1株大腸桿菌與1株糞腸球菌未檢測到該基因。qepA的檢出率為58.3%，1株大腸桿菌與3株綠膿桿菌、1株糞腸球菌未檢測到該基因(圖4，表3)。

3 討論

本試驗從臨床9例有腹瀉癥狀的病犬的肛拭子中分離得到12株菌株，根據(jù)菌落特征、革蘭染色和16S rDNA序列分析，鑒定出8株大腸桿菌，3株銅綠假單胞菌和1株糞腸球菌。藥敏試驗結(jié)果可知，12株分離菌株對臨床常用的3大類抗菌藥物均產(chǎn)生了耐藥性，對氨芐西林、慶大霉素和恩諾沙星耐藥率較高，且呈現(xiàn)出多重耐藥現(xiàn)象，所以在臨床治療時，要注意使用敏感的藥物，否則不僅治療失敗，而且會增加耐藥菌產(chǎn)生的風(fēng)險。

表3 12株分離菌株各耐藥基因檢出率

圖4 分離株qnrS、qepA基因PCR結(jié)果

M：DL-2 000 DNA Marker； -：陰性對照； 1～8：8株大腸桿菌分離株 ;9～11： 3株銅綠假單胞菌分離株 ; 12：1株糞腸球菌分離株

本試驗檢測的β-內(nèi)酰胺酶基因blaTEM和blaSHV會使細菌表達并生成β-內(nèi)酰胺酶，該酶能夠水解β-內(nèi)酰胺環(huán)上的酰胺鏈，從而使藥物失活[10]。氨芐西林作為臨床經(jīng)典藥物和常用藥，常用于寵物臨床，所以產(chǎn)生了較高的耐藥性，而頭孢曲松和頭孢他啶為較新型的第3代頭孢類藥物，臨床還未產(chǎn)生較高的耐藥性，這與代鵬飛等[11]所提供的動物源大腸桿菌對氨芐西林耐藥率較高，而對頭孢類藥物敏感的結(jié)果基本一致。近些年，產(chǎn)生超廣譜 β-內(nèi)酰胺酶(Extended-Spectrum β-Lactamases，ESBLs)導(dǎo)致革蘭陰性菌的耐藥性加劇[12]，本試驗也顯示12株分離菌株中，有10株檢測到ESBL-抗生素耐藥基因blaCTX-M-8，說明產(chǎn)ESBL腸桿菌的耐藥問題也要在犬上引起注意。氨基糖苷類耐藥基因aac(3)-Ⅱ，aac(6′)-Ib和aacC2 都會誘導(dǎo)細菌表達產(chǎn)生氨基糖苷類鈍化酶，編輯該酶的遺傳物質(zhì)還可在菌體中互相傳遞，使耐藥菌逐步增多[13]。氟喹諾酮類耐藥基因qnrS和qepA產(chǎn)生細菌 DNA 回旋酶保護蛋白是其具有耐藥性的重要原因。本試驗中分離菌對3大類耐藥基因的檢出率高達40%以上，說明寵物犬臨床上這幾類藥物的耐藥性的問題不容忽視。我們除了要重視犬疾病的防控外，還應(yīng)做好寵物臨床用藥的管控與監(jiān)測，以促進寵物行業(yè)健康發(fā)展。