腸道中藥對實驗小鼠腸道乳酸菌和抗病能力的影響

陸英杰，傅禹銘，方煥新，湯詩婷，李文峰，黃淑堅

(佛山科學技術(shù)學院生命科學與工程學院，廣東南海528231)

中藥逐漸替代抗生素在飼料中的使用和添加，為抗生素逐漸減少使用奠定基礎(chǔ)，同時隨著科學家不斷地對中藥的深入研究，中藥調(diào)節(jié)正常菌群，提高機體自身免疫能力及抗病能力是未來畜牧業(yè)養(yǎng)殖及防控疾病的關(guān)鍵技術(shù)手段和科學進行生態(tài)養(yǎng)殖的方向，而腸道中藥對腸道菌群的影響如何，能否單獨使用不需與益生菌協(xié)同，由此，本課題組根據(jù)中藥法典配方，進行藥物配伍方面的更改，研究以大黃、黃芩、黃柏和黃連為主要成分的腸道復方中藥即腸痢康對動物機體腸道功能及抗病能力等方面的影響，盡而為臨床找尋可靠、可行的防控疾病的方法提供有價值的參考資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級BALB/c雄性小鼠20只，體重(13±2)g，每組10只，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，許可證號：SCXK(粵)2013-0002。

1.2 試驗試劑 磷酸二氫鉀、十二水合磷酸氫二鈉、副品紅、2N鹽酸、亞硝酸鈉、醋酸α-奈脂、無水丙酮、孔雀石綠、氯仿、冰乙酸、生理鹽水、蒸餾水、枸緣酸鈉(以上試劑均為國產(chǎn)分析純)；腸道中藥即腸痢康(根據(jù)藥典方劑自行研制)；ELISA檢測IgM和C3試劑盒(南京建成生物工程研究所)；AST 和ALT試劑盒(上?？苹锕こ坦煞萦邢薰?。

1.3 主要儀器 B203LED生物顯微鏡 (重慶奧特光學儀器有限公司)；SPX-250C型恒溫恒濕箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；HWS12型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)；微量移液槍(德國艾本德股份公司)；EG1160石蠟包埋機(德國LEICA公司)；RM2135石蠟切片機(德國LEICA公司)；多媒體圖像分析儀Image-pro plus(Media Cybernetics公司)；日立7020型全自動生化分析儀(日本株式會社日立高新技術(shù))；Multiskan GO全波長酶標儀(Thermo Scientific公司)。

1.4 方法

1.4.1 動物分組與飼喂 SPF級BALB/c雄性小鼠32只，體重(13±2) g，經(jīng)3 d的適應性飼養(yǎng)后，隨機均分為2組：對照組、腸痢康試驗組。飼喂小鼠普通全價飼料，每天更換補充。按參考文獻[1]方法計算小鼠飲水飼喂腸痢康預防劑量加入100 mL水中，對照組給予100 mL水，每2 d更換飲水。試驗期間小鼠自由采食飲水，每3 d更換墊料，試驗期30 d。

1.4.2 生長性能測定 按參考文獻[2]方法記錄小鼠每天采食量、體重，試驗結(jié)束后計算日均增重量、日均采食量和料重比。料重比=消耗飼料量/增重量。

1.4.3 T、B淋巴細胞動態(tài)比測定 按參考文獻[3]方法，在試驗第1、2、3、4周用斷尾法采集小鼠血液，涂片，用酸性α-醋酸荼酯酶(ANAE)反應方法進行染色,顯微鏡油鏡下檢測計算T、B淋巴細胞比值。

1.4.4 常規(guī)病理學方法觀察抗病能力 試驗進行1個月，將對照組隨機分為2組，即對照組和對照攻毒組；試驗組分為試驗組和試驗攻毒組。觀察攻毒組有異常及發(fā)病癥狀，即結(jié)束試驗。眼球采血，離心取血清，-20 ℃保存?zhèn)溆?；無菌狀態(tài)下進行盲腸分離、備用 。然后對4個組中小鼠進行肝臟和脾臟組織的采集并用中性甲醛固定。然后進行石蠟切片制作，H.E.染色法觀察肝臟及脾臟的病理變化。

1.4.5 ELISA檢測IgM和C3 應用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法對小鼠血清進行IgM和C3檢測，試驗方法參考南京建成生物工程研究所檢測試劑盒使用說明書進行。

1.4.6 生化分析儀檢測AST和ALT 應用生化分析儀對攻毒后的小鼠進行丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)進行檢測，檢測方法參考試劑盒說明指南進行。

1.4.7 腸道菌群中乳酸菌群的檢測 無菌條件下，取剖檢分離到的盲腸，進行乳酸菌群的培養(yǎng)，計算乳酸菌群的變化。

1.4.8 統(tǒng)計學分析 采用DPS、EXCEL軟件進行統(tǒng)計分析，差異顯著性檢驗(t檢驗)，數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標準差表示。

2 試驗結(jié)果

2.1 小鼠生長性能結(jié)果 腸痢康對小鼠生長性能影響的結(jié)果見表1。由表1可知，腸痢康的日增重和料重比與空白對照組有顯著差異(P<0.05)，結(jié)果表明，腸痢康對小鼠生長性能有影響。

組別日增重/g日采食量/g料重比對照組0.20±0.026a5.43±0.3125.31±2.03b腸痢康組0.23±0.087a5.29±0.2521.92±2.16b

注：兩組間肩標字母相同或有相同字母的表示差異顯著(P<0.05);下表同

2.2 小鼠T、B淋巴細胞的動態(tài)測定結(jié)果 如表2所示，從第1-3周，腸痢康組的T、B淋巴細胞比值均大于對照組，在第3周顯著差異(P<0.05)，第4周時T、B淋巴細胞比值相差不顯著，顯示腸痢康對T、B淋巴細胞有影響。

組別第1周第2周第3周第4周對照組 3.21±1.89 2.55±1.19 7.32±8.04c 9.91±8.87腸痢康組3.72±1.03 4.89±0.17 11.93±9.23c10.02±0.39

2.3 ELISA檢測小鼠IgM和C3結(jié)果 ELISA檢測所有試驗組小鼠血清IgM和C3結(jié)果見表3。從表3可以看出，與對照組相比，攻毒前后腸痢康組IgM含量差異顯著(P<0.05)；而C3差異不顯著(P>0.05)，提示腸道中藥腸痢康對IgM有顯著影響(P< 0.05)，但對C3影響不顯著。

表3 ELISA檢測小鼠血清IgM和C3結(jié)果

2.4 生化檢測AST和ALT的結(jié)果 生化分析儀檢測感染各組小鼠AST和ALT的檢測結(jié)果見表4。從表4可以看出，病原菌感染后，肝臟AST和ALT的變化，對照組顯著高于腸痢康組(P<0.05)，顯示腸痢康組對肝臟具有一定的保護作用。

表4 生化檢測各組AST和ALT的結(jié)果

2.5 小鼠肝臟病理觀察結(jié)果 見中插彩版圖1、2、3。從中插彩版圖1～3上可以看出，對照組肝臟肝板和肝血竇結(jié)構(gòu)清晰，有規(guī)律；而感染組肝板結(jié)構(gòu)不清楚，細胞變性、壞死嚴重；肝血竇結(jié)構(gòu)模糊；飼喂腸痢康試驗組肝臟肝細胞壞死程度顯著小于對照感染組，顯示腸痢康對抗病性有作用。

圖1 對照組肝臟(H.E.染色，400×)

圖2 腸痢康感染組(H.E.染色，400×)

圖3 對照感染組肝臟(H.E .染色，400×)

2.6 小鼠脾臟病理觀察結(jié)果 結(jié)果見中插彩版圖4、5、6。從圖可以看出，對照組脾臟脾小體結(jié)構(gòu)與紅髓邊緣界限清楚，感染組界限不清晰，有淋巴細胞變性壞死現(xiàn)象與腸痢康組比較壞死程度明顯。

圖4 脾臟對照組(H.E.染色，400×)

圖5 脾臟腸痢康感染組(H.E.染色，400×)

圖6 脾臟對照感染組(H.E.染色，400×)

2.7 腸道菌群中乳酸菌的測定結(jié)果 檢測小鼠腸道菌群中乳酸菌的結(jié)果見表5。

表5 腸道菌群中乳酸菌群的結(jié)果

從表5可知，腸痢康對感染前后的腸道乳酸菌群與對照組相比的差異很大，感染前由于乳酸菌群的添加使腸道乳酸菌群增多，但感染后由于感染細菌的作用，致使感染后的對照組的乳酸菌群增加，而飼喂腸痢康的菌群并沒增加太多乳酸菌，盡管感染前后試驗組與對照組有顯著差異(P<0.05)，但感染后的正常組與感染后的腸痢康的差異性不顯著(P>0.05),可見當細菌感染動物機體時，乳酸菌群能夠干涉有害菌的侵入方面還是比較局限的。但在未感染病原菌的情況下，腸痢康對機體有著非常重要的作用，增加了機體乳酸菌群的數(shù)量。

3 討論

3.1 腸痢康對小鼠生長性能及T、B淋巴細胞的動態(tài)影響 中藥自身可以增強腸道黏膜免疫功能，在試驗中腸痢康可以增強T淋巴細胞數(shù)量，提高細胞免疫功能。這與段智璇等報道的中藥可以增強CD4+T和CD8+T淋巴細胞的活性有相同的結(jié)果[4]。同時我們也發(fā)現(xiàn)腸痢康在調(diào)節(jié)T淋巴細胞活性的同時，機體也在進行著自身的調(diào)節(jié)，當T淋巴細胞活性增強到一定程度時，也自由于B淋巴細胞的作用而使彼此在一定程度上表現(xiàn)動態(tài)平衡。此外，我們購進的小鼠是4周齡左右的，當小鼠經(jīng)歷4周的試驗后，基本達到性成熟，胸腺由于性激素的作用促進其逐漸退化，這也是小鼠T/B淋巴細胞比值趨于正常的主要原因[5]。而中藥一直是人類傳統(tǒng)文化的瑰寶，很多藥均被當作食物食用，而大黃、黃柏等物質(zhì)通常用來通腸的良藥，促進腸道功能，改善消化，促進小鼠的生長，由此腸痢康可以提高生長性能，這方面與文獻報道有異同工之效。

3.2 攻毒后腸痢康對小鼠腸道菌群的影響 中藥對腸道黏膜免疫屏障有著十分重要的作用，中藥對恢復腸道功能有非常重要的作用。本試驗中腸痢康通過對腸道菌群的調(diào)節(jié)來增強機體對致病菌的抵抗力，這方面與腸痢康中某些中藥含有的成分有密切的關(guān)系?，F(xiàn)代食物中含有中藥的某些成分也有調(diào)節(jié)機體腸道菌群的功能，比如大黃和黃柏，既可入食也可入藥，而它們在調(diào)節(jié)腸道菌群方面起著重要的作用，這與文獻報道結(jié)果一致[6-7]。腸痢康中含有大黃，黃柏、黃連和黃芩等中藥成分，黃連可以調(diào)節(jié)腸道，保護胃腸黏膜，抵抗細菌入侵等作用[8]，小劑量的黃連、黃柏和黃芩復方中藥可以調(diào)整腸道，對腸道微生物隨著劑量的增加可以抑制其生長[10]，從試驗中腸痢康對腸道菌群中乳酸菌的調(diào)節(jié)來看，對腸道黏膜有保護作用；提示我們應用預防劑量的腸痢康可以對腸道微生物有調(diào)節(jié)作用，尤其對外來病原入侵時可以發(fā)揮一定的作用。

3.3 攻毒后腸痢康對IgM和C3的影響 通過ELISA的檢測，我們發(fā)現(xiàn)腸痢康對IgM有一定的促進作用，而且有中藥復方共同作用，促進體液免疫功能對機體的保護，但對C3方面未見顯著的變化的可能，一方面腸痢康本身有抑菌調(diào)節(jié)腸道菌群的作用，另一方面葡萄球菌是一種革蘭陽性菌不能啟動旁路途徑，也可能是其中原因之一，但經(jīng)典途徑可以由抗原抗體復合物進行，通過IgM的表現(xiàn)應該可以激發(fā)C3補體的經(jīng)典途徑，但從攻毒后脾臟的變化來看，紅髓區(qū)B淋巴細胞變性壞死程度比較嚴重，參與體液免疫即IgM的作用也可能由于幼稚性B淋巴細胞的作用，也可能由于腸痢康服用后對機體也有一定的刺激影響，具體如何需要我們進一步試驗研究。

3.4 攻毒后腸痢康對肝脾的影響 通過生化分析儀對AST和ALT的檢測，我們發(fā)現(xiàn)攻毒后這2個指標在對照組和腸痢康組有著顯著的差別(P<0.05)，而AST和ALT是衡量動物肝臟機能的2個重要指標，這2個指標的變化，顯示著肝臟受損傷的程度[10-11]，而試驗中這2個指標與對照組相比，均有明顯的降低，充分顯示腸痢康藥物試驗組對肝臟的保護作用；而在我們進行的肝脾病理學觀察也發(fā)現(xiàn)腸痢康對攻毒組的肝臟細胞變性、壞死情況較對照組相比明顯減輕許多，由此可見，我們的腸痢康有護肝作用，該作用可能歸因于大黃、黃連和黃芩等所含的糖苷類物質(zhì)有著很大的關(guān)系[9-10]，這些內(nèi)容均需要我們進行深入的研究探討。

4 結(jié)論

腸痢康能促進小鼠的生長發(fā)育，改善小鼠免疫功能并能提高機體抗病能力。