動物性食品中阿維菌素類藥物殘留檢測高效液相色譜法的優(yōu)化

譚 梅， 李燕君，李 然，吳曉嵐，岳秀英，呂曉華

(1.四川大學華西公共衛(wèi)生學院 華西第四醫(yī)院，四川成都610041 ； 2.四川省獸藥監(jiān)察所，四川成都610041)

阿維菌素類藥物是目前應用最廣泛的獸用驅(qū)蟲藥，包括愛普菌素、阿維菌素、多拉菌素、伊維菌素等品種。阿維菌素類藥物雖然作用劑量小，但脂溶性較高，殘留時間長，世界衛(wèi)生組織將其列為高毒化合物[1]。目前動物性食品中阿維菌素類藥物殘留檢測多采用酶聯(lián)免疫吸附法[2-3]、免疫親和色譜法[4]、高效液相色譜法[5-6]、超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7-8]等方法，本試驗對農(nóng)業(yè)部1025號公告-5-2008動物性食品中阿維菌素類藥物殘留檢測-酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法中的高效液相色譜法進行優(yōu)化，探索一種操作方便、耗時短且符合獸藥殘留試驗技術規(guī)范要求的阿維菌素類藥物殘留檢測方法。

1 材料與方法

1.1 樣品 牛肝，購自四川省成都市武侯區(qū)玉林菜市場，經(jīng)檢測無阿維菌素類藥物殘留。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 主要儀器 Waters 2695型高效液相色譜儀(費爾伯恩精密儀器有限公司)，474熒光檢測器(北京京科瑞達科技有限公司)，UNIVERSAL 32R型離心機(上海素爾生物科技有限公司)，HEIDOLPH LABOROTA 4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(北京康高特科技有限公司)，Bond Elut 200 mg/3 mL C18固相萃取柱(北京吉瑞森科技有限公司)。

1.2.2 標準物質(zhì)和主要試劑 愛普菌素標準物質(zhì)(純度92%)、阿維菌素標準物質(zhì)(純度92%)、多拉菌素標準物質(zhì)(純度94%)、伊維菌素標準物質(zhì)(純度92%)，由中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院提供。色譜純甲醇、乙腈，分析純?nèi)宜狒?、冰乙酸、三乙胺?-N-甲基咪唑(純度>99%)，由塞默飛世爾科技(中國)有限公司提供。衍生化試劑A液∶1-甲基咪唑-乙腈(1∶1，V/V)，衍生化試劑B液∶三氟乙酸酐-乙腈(1∶2，V/V)。

1.3 標準溶液配制 分別稱取4種標準物質(zhì)10 mg，置于100 mL容量瓶中溶于乙腈，定容至刻度線，分別配置成100 μg/mL標準貯備液。分別量取4種標準貯備液1 mL，置于100 mL容量瓶中用乙腈定容至刻度線，配制成1 μg/mL的混合標準工作液。

1.4 檢測方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱：Waters symmetry C18 5 μm，250 mm×4.6 mm(內(nèi)徑)；流動相：乙腈+水(96∶4，V/V)；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；激發(fā)波長：365 nm；發(fā)射波長：475 nm；進樣量：20 μL。

1.4.2 標準曲線繪制 準確量取混合標準工作液適量，按照樣品提取液的衍生化程序衍生化，甲醇定容，配制成濃度為2、5、10、20、50、100 μg/L和200 μg/L標準溶液，上機測定，以各組分的色譜峰面積對濃度作線性回歸，繪制定量標準曲線。

1.4.3 樣品前處理 牛肝在室溫下勻漿，準確稱取5.0 g，置于50 mL離心管，加入8 mL乙腈，渦動0.5 min，2 000 r/min離心5 min。殘留組織用8 mL乙腈重復提取1次。合并2次上清液于雞心瓶在60 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸干，4 mL乙腈-水-三乙胺(40∶60∶0.1,V/V)溶解殘留物備用。先用4 mL乙腈、4 mL乙腈-水-三乙胺(40∶60∶0.1,V/V)活化和平衡C18 SPE柱，再將牛肝提取液上柱，待濾液將近流盡，用5 mL乙腈-水-三乙胺(40∶60∶0.1,V/V)洗滌C18 SPE柱，吹干，再用3 mL正己烷洗滌，吹干。用4 mL乙腈洗脫，收集所有流出液，氮氣吹干。加入100 μL衍生化試劑A液，渦動0.5 min，加入150 μL衍生化試劑B液，渦動0.5 min，再加入50 μL冰乙酸和50 μL三乙胺密閉，于65 ℃衍生化反應30 min，加入甲醇定容至1.0 mL，0.45 μm針筒濾膜過濾，上機檢測。

1.4.4 加標回收試驗 牛肝勻漿中添加愛普菌素、阿維菌素、多拉菌素、伊維菌素混合標準工作液，添加后的終濃度為5 μg/kg、10 μg/kg和50 μg/kg。每批各濃度樣品分別制備5份，共3批。肝勻漿添加混合標準工作液后，渦動0.5 min，靜置15 min，按上述樣品的前處理方法步驟測定各藥物含量，分別計算批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)。

1.4.5 確定檢測限 牛肝勻漿按照樣品前處理步驟，上機測定噪音信號，計算平均值。信噪比≥3為檢測限，信噪比≥10為定量限。

2 結(jié)果

2.1 阿維菌素類藥物衍生化產(chǎn)物的保留時間 如圖1所示，在上述色譜條件下，愛普菌素、阿維菌素、多拉菌素和伊維菌素的衍生化產(chǎn)物相應保留時間分別為10、12、15 min和20 min。

圖1 10 μg/L阿維菌素類藥物標準溶液色譜圖

2.2 標準曲線 如表1和圖2所示，標準溶液濃度在2～200 μg/L范圍時，愛普菌素、阿維菌素、多拉菌素和伊維菌素的標準曲線線性關系良好，回歸系數(shù)分別為0.999 2、0.999 5、0.999 4、0.999 4。

2.3 檢測限和定量限 愛普菌素、阿維菌素、伊維菌素和多拉菌素的檢測限均為2 μg/kg，定量限均為5 μg/kg。

圖2 阿維菌素類藥物標準曲線

表1 標準曲線線性回歸方程

2.4 加標回收試驗結(jié)果 如表2所示，愛普菌素、阿維菌素、伊維菌素和多拉菌素的加標回收率在83%～93%，批內(nèi)變異系數(shù)均<14%，批間變異系數(shù)<11%。

表2 加標回收試驗結(jié)果

3 討論

阿維菌素類藥物是由阿維鏈霉菌產(chǎn)生的新型大環(huán)內(nèi)酯類抗寄生蟲藥物，具有殺蟲活性強和蟲譜廣的特點[1,9]，廣泛應用于農(nóng)牧業(yè)。研究發(fā)現(xiàn)，阿維菌素類藥物正常使用殘留于環(huán)境或過度使用可引起禽類、水生生物和哺乳動物等多種動物神經(jīng)毒性、免疫毒性、生殖毒性等，甚至導致死亡[10]。含有阿維菌素類藥物的動物性食品對人類健康亦存在威脅[11]，因此阿維菌素類藥物殘留的檢測方法備受關注。目前動物性食品阿維菌素類藥物殘留的檢測方法中，酶聯(lián)免疫吸附法檢測限低，但重復性差，應用范圍受限；免疫親和色譜技術精密度高，可快速自動分析，但成本昂貴；超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是確證方法，但其儀器昂貴，難以推廣；高效液相色譜法應用最為廣泛，且靈敏度高、可靠性強[12-14]，但農(nóng)業(yè)部1025號公告-5-2008標準中的高效液相色譜法耗時長，操作復雜。

本文對農(nóng)業(yè)部1025號公告-5-2008標準中的高效液相色譜法進行優(yōu)化，改進了樣品提取后儲存條件、凈化條件和衍生化條件，如表3所示。優(yōu)化法試驗結(jié)果表明，愛普菌素、阿維菌素、伊維菌素和多拉菌素等4種阿維菌素類藥物的保留時間合理；檢測限2 μg/kg，定量限5 μg/kg；在2～200 μg/L的濃度范圍內(nèi)，標準曲線線性良好，相關系數(shù)均大于0.999 2；加標回收率在83%～93%，批內(nèi)變異系數(shù)小于14%，批間變異系數(shù)小于11%。與農(nóng)業(yè)部1025號公告-5-2008標準中的高效液相色譜法比較，其準確度和精密度較好，如表4所示。

表3 優(yōu)化法與標準法的試驗條件比較

表4 優(yōu)化法與標準法的靈敏度、準確度和精密度比較

3.1 樣品選擇 阿維菌素類藥物對牛的線蟲和疥螨等驅(qū)殺效果好，具有廣譜、高效和用量小等優(yōu)點。但由于超量用藥、盲目用藥和不執(zhí)行休藥期規(guī)定等濫用阿維菌素類藥物的情況，對牛肉及制品的食品安全性造成影響，有研究表明，頻繁用藥和亞劑量用藥可能是耐藥性產(chǎn)生的兩大主要因素[15]。阿維菌素類藥物的休藥期，畜禽類中以牛最長(35 d)[16]，肝臟是阿維菌素類藥物的主要代謝部位[17]，我國規(guī)定牛肝中阿維菌素、多拉菌素和伊維菌素的最高殘留限量為100 μg/kg[18]。農(nóng)業(yè)部1025號公告-5-2008標準適用于牛肝、牛肌肉等，故本文選用牛肝作為優(yōu)化阿維菌素類藥物殘留檢測高效液相色譜法的試驗樣品。

3.2 樣品提取后儲存條件的優(yōu)化 樣品提取后用乙腈-水-三乙胺儲存，增加樣品穩(wěn)定性，儲存時間更長，并經(jīng)過反復試驗確定乙腈-水-三乙胺的比例為乙腈∶水∶三乙胺=40∶60∶0.1(V/V)，與農(nóng)業(yè)部1025號公告的-5-2008標準相比，不僅增加樣品穩(wěn)定性和儲存時間，也減少了色譜圖拖尾現(xiàn)象。

3.3 凈化條件的優(yōu)化 農(nóng)業(yè)部1025號公告的-5-2008標準聯(lián)用堿性氧化鋁柱和C18 SPE柱對樣品凈化，耗時長，成本高。有研究表明，C18 SPE柱能保證藥物保留效率，縮短過柱時間[5]。本文采用C18 SPE柱，并對C18 SPE柱的過柱溶液進一步優(yōu)化，增加采用乙腈-水-三乙胺(40∶60∶0.1,V/V)活化和平衡C18 SPE柱，洗脫過程增加乙腈-水-三乙胺(40∶60∶0.1,V/V)和正己烷。結(jié)果提示，凈化條件優(yōu)化減少了過堿性氧化鋁柱、50 ℃減壓濃縮至干及再溶解的步驟，節(jié)約成本和時間，而且樣品凈化程度提高，準確度和精密度也較好。

3.4 衍生化條件的優(yōu)化 農(nóng)業(yè)部1025號公告的-5-2008標準，僅采用1-甲基咪唑-乙腈(1∶1，V/V)和三氟乙酸酐-乙腈(1∶2，V/V)進行衍生化，用乙腈定容，96 ℃條件下衍生反應100 min。有研究表明，當衍生化時間為100 min時，阿維菌素類藥物的衍生化產(chǎn)物反而略微減少[5]。綜合考慮反應效率和試驗時間，本文增加冰乙酸和三乙胺兩種衍生試劑，65 ℃條件下衍生反應30 min，不僅增加了衍生化效率，也縮短了試驗時長。產(chǎn)生的衍生化產(chǎn)物加入甲醇，使其更加穩(wěn)定。有報道顯示，動物類食物中阿維菌素類藥物殘留檢測的高效液相色譜法中，衍生化試劑增加冰乙酸和三乙胺，用甲醇定容，可使衍生化效率更高且衍生物更加穩(wěn)定，色譜峰響應時間一致性好[19]，與本文結(jié)果相似。

綜上，優(yōu)化法符合獸藥殘留試驗技術規(guī)范的要求[20]，準確度和精密度較好，檢測時間和成本低于標準法，可用于動物性食品中阿維菌素類藥物殘留的檢測。