藍狐腦炎原蟲病的診斷與鑒定

李 志，劉麗凡，穆國冬，章悟善，張媛媛，黃巧蓉，馬澳琳，謝路遙，王 好

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，吉林長春130118 ； 2.長春科技學院，吉林長春130600 ；3.吉林省動物疫病預防控制中心，吉林長春130000 ； 4.吉林大學人獸共患病研究教育部重點實驗室，吉林長春130062)

2017年5月初，吉林省九臺市某藍狐養(yǎng)殖場養(yǎng)殖的1-4月齡藍狐出現(xiàn)不同程度脫水、生長停滯，眼睛失明，腹部觸摸可以摸到腫大的腎臟，被當?shù)厝朔Q之為“大腎病”。盡管藍狐大腎病的流行已有報道，但由于該病發(fā)生原因復雜，病毒、血液附紅細胞體檢測未出現(xiàn)異常，并未檢測出病原[1]。本實驗室懷疑藍狐發(fā)病為狐腦炎原蟲病，并去當?shù)厥占『M行臨床診斷和實驗室診斷。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 革蘭染色液、改良馬松三色染色液、質(zhì)粒小量提取試劑盒,購自北京索萊寶科技有限公司；ExTaqDNA聚合酶、pMD18-T 載體和限制性內(nèi)切酶EcoR I、HindIII，購自TaKaRa 公司；E.coliDH5α，購自北京全式金生物技術有限公司；DNA 膠回收試劑盒，購自天根生化科技有限公司。

1.2 病料樣品的采集和處理 5例病料樣品采集于吉林省九臺地區(qū)某農(nóng)場，為發(fā)病藍狐的腎臟、腦組織，-20 ℃冰箱冷凍保存；部分新鮮腎臟組織10%甲醛固定用于制備石蠟切片。

1.3 腦炎原蟲的純化和電鏡觀察 無菌條件下取5例典型病變的腎臟組織研磨，加入磷酸鹽緩沖液稀釋，并使用200 μm篩網(wǎng)過濾。濾液差速離心，操作如下：300 r/min離心5 min，收集上清液；將上清液4 000 r/min離心10 min，多次重復操作，收集底部沉淀，加少量磷酸鹽緩沖液，透射電子顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 病理切片染色 將10%甲醛固定的組織室溫放置1周；經(jīng)過脫水、包埋、修塊、切片、革蘭染色和改良馬松三色染色等步驟后，蓋玻片固定保存，觀察病理變化。

1.5 PCR鑒定及序列分析

1.5.1 引物設計與合成 參考GenBank 登錄的腦炎原蟲基因組序列，選取ITS1、PTP1基因序列保守區(qū)域，應用Primer 5.0軟件設計引物。PITS1F:5′-TTGACGGAAGGACACCACAAGGAGT-3′，PITS1R: 5′-CC-CGCCAAACGCAGTTACCA-3′；PPTP1F：5′-CCGGAATTCATGTATTCAGCAACCGCA-3′ ，PPTP1R：5′-CCGCTC GAGTTACTAGCAGCATTGG-3′。PCR 擴增產(chǎn)物預期為762 bp、1 128 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5.2 DNA的提取與PCR 鑒定 將腎臟、腦組織研磨液分別處理。反復凍融3次，堿裂解法提取DNA，并進行PCR 擴增。ITS1基因的PCR 反應條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、62.3℃ 30 s、72 ℃ 30 min， 30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PTP1基因的PCR 反應條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、60.4 ℃ 30 s、72 ℃ 30 min， 30個循環(huán)；擴增產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.5.3 目的基因的回收與連接 PTP1基因PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后連接于pMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞，在含有氨芐青霉素終濃度100 μg/mL的LB 瓊脂平板上篩選單菌落，LB培養(yǎng)基中180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，提取重組質(zhì)粒，并使用限制性內(nèi)切酶EcoR I和HindIII進行雙酶切驗證。

1.5.4 序列比較及進化樹繪制 陽性重組質(zhì)粒由北京六合華大基因科技股份有限公司進行序列測定。利用DNASTAR軟件將基因測序結(jié)果與GenBank 登錄的參考病毒株進行序列同源性分析并采用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果

2.1 臨床診斷結(jié)果 受感染的農(nóng)場主要以藍狐養(yǎng)殖為產(chǎn)業(yè)，典型癥狀為食欲不振、生長停滯、失明、痙攣，并且該疾病可經(jīng)垂直傳播(見中插彩版圖1)。大多數(shù)受感染的狐貍，經(jīng)剖檢可觀察腎臟蒼白、腫大(見中插彩版圖2)。

圖1 生長停滯的4月齡藍狐

圖2 病狐腎臟腫大蒼白癥狀

2.2 病原的純化結(jié)果 取初步純化的菌株經(jīng)革蘭染色、改良馬松三色染色，油鏡觀察。革蘭染色觀察，在細胞碎片凝集物周邊有大量深藍色圓形或橢圓形類似假囊的結(jié)構(gòu)；改良馬松三色染色呈粉紅色，大小在1～2 μm左右(見中插彩版圖3)。

圖3 經(jīng)初步純化的微孢子蟲的染色

2.3 病理觀察結(jié)果 為了進一步鑒定腦炎原蟲病，將固定的組織做石蠟病理切片并染色，400倍顯微鏡下觀察，在腎臟間質(zhì)和腎髓質(zhì)明顯觀察到孢子存在。革蘭染色觀察到腎上皮內(nèi)和腔內(nèi)以及脾臟小梁的孢子顯示為粉紅色背景下可見的深藍色圓形結(jié)構(gòu)(見中插彩版圖4A和4C箭頭所指)。改良馬松三色染色可觀察到腎小管上皮內(nèi)藍色背景下大量粉紅色卵圓形結(jié)構(gòu)(見中插彩版圖4B箭頭所指)。

圖4 藍狐組織染色觀察

2.4 PCR鑒定與序列分析結(jié)果

2.4.1 PCR鑒定結(jié)果 將ITS1 基因、PTP1基因進行PCR 擴增，產(chǎn)物凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，擴增出約831 bp、1 071 bp的特異性片段(圖5)。將其連接至pMD18-T載體中，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

圖5 分離株PTP1、ITS1基因PCR擴增產(chǎn)物

M：.DL-2 000 DNA Marker ； 1：陰性對照 ；2：ITS1擴增產(chǎn)物 ； 3：PTP1-pMD-18T酶切產(chǎn)物

2.4.2 基因序列分析結(jié)果 對測序結(jié)果進行分析，PTP1、ITS1基因在GenBank上進行比對。結(jié)果表明，ITS1基因與參考株GB-M1的同源性為99.7%，并且ITS1基因5′-GTTT-3′重復4次，與LN-1株同屬一個基因III型，將分離株命名為JL-1。同時，PTP1基因進化樹分析也表明該分離株與遼寧株(LN-1) 及美國株(CDC)親緣關系最近(圖6)。其中NM001041403、AJ005666、AF310678基因分離自小鼠，EU282236、EU282237和AB182700分離自猴子，AF310679分離自人。

圖6 基于Neighbor-Joining 法構(gòu)建立 PTP1基因核苷酸序列遺傳進化樹

3 討論

經(jīng)實驗室診斷分析，確定該藍狐養(yǎng)殖場暴發(fā)的疾病為腦炎原蟲病。

在實驗室診斷的多個腎臟、腦組織石蠟切片染色、研磨液中檢測到大量腦炎原蟲，證明腦炎原蟲極有可能寄生在藍狐腎臟并排出具有感染性的孢子，經(jīng)口腔感染給同群藍狐。同時，藍狐發(fā)病的窩發(fā)性和母狐的發(fā)病史也證明了該病傳播與遺傳有關，腦炎原蟲可能經(jīng)胎盤傳播給子代。腎臟、腦組織DNA的PCR鑒定，經(jīng)ITS1基因序列分析證明了藍狐腦炎原蟲基因Ⅲ型感染。2012年初，中國首次出現(xiàn)藍狐腦炎原蟲基因Ⅲ型，但傳染來源無從知曉。在歐洲，只有腦炎原蟲基因Ⅲ型感染犬、猴、免疫缺陷病人和腎臟移植患者[2-4]。因此此次藍狐腦炎原蟲病的暴發(fā)有潛在的人獸共患風險，特別是對免疫能力較弱的老人和兒童。

目前腦炎原蟲病尚未有特效治療藥物。僅發(fā)現(xiàn)某些抗生素(例如：煙曲霉素，司帕沙星，土霉素)，特別是苯并咪唑?qū)δX炎原蟲感染能夠起到一定抑制作用[5]。但在治療中斷幾個月后，往往會在宿主體內(nèi)再次檢測到腦炎原蟲[6]。因此感染腦炎原蟲病的藍狐特別是母狐必須淘汰，并使用濃度為1.0%甲醛、1.0%過氧化氫、1.0%氫氧化鈉、70%乙醇、10%次氯酸鈉等常規(guī)消毒劑對養(yǎng)殖區(qū)域進行定期徹底的清潔，減少病原傳播。

東北地區(qū)是毛皮動物養(yǎng)殖的主要分布地區(qū)之一，占有非常重要的地位。藍狐對腦炎原蟲病高度易感，但在國內(nèi)僅有1例藍狐感染報道。并且腦原蟲病可能已在狐場肆虐幾年，在最初只有數(shù)只幼狐感染，后來50%幼狐死亡，由于不能有效控制疫情，養(yǎng)殖戶不得不處死母狐。在2002年，腦炎原蟲病造成了芬蘭藍狐的高死亡率和巨大的經(jīng)濟損失[7]。因此，此次狐場的兔腦原蟲調(diào)查極為重要。