華東地區(qū)豬A群輪狀病毒的VP7和VP4基因序列分析

常新見，周金柱，魯天弈，范寶超，郭容利，朱 琳，李 彬，牛家強(qiáng)，何孔旺

(1.西藏農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，西藏林芝860000 ； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，江蘇南京210014 ；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京210014)

豬輪狀病毒(Porcine rotavirus，PRV)屬呼腸孤病毒科輪狀病毒屬成員，是引發(fā)幼畜腹瀉的主要病原之一[1]。A 群豬輪狀病毒除了是豬的重要腸道病原之一，其也被發(fā)現(xiàn)是人獸共患病原的一種[2]。根據(jù)VP7和VP4序列的差異，A群輪狀病毒被進(jìn)一步分類為不同的基因型，從而區(qū)分糖蛋白(G或VP7)和蛋白酶解蛋白(P或VP4)亞型，在此基礎(chǔ)上，構(gòu)成了A群輪狀病毒株雙重命名系統(tǒng)[3-4]。輪狀病毒基因組為由 11個(gè)片段組成的雙鏈RNA，分別編碼6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白( VP1～VP4、VP6、VP7) 和 5 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白( NSP1～NSP5) 。外部衣殼由VP4和VP7組成，VP7和VP4的特異性可將輪狀病毒分為2個(gè)血清型，分別是G型(VP7)和P型(VP4)[5-6]。VP7 是一種鈣調(diào)蛋白，與病毒粒子形態(tài)形成及穩(wěn)定性有關(guān)[7]。VP7基因存在高變區(qū)，不同型的輪狀病毒間交叉保護(hù)性較差，并且不同血清型毒株混合感染同一宿主時(shí)，可能發(fā)生基因交換、交叉或重排，VP7 是由326 個(gè)氨基酸組成，與 VP4 蛋白共同構(gòu)成病毒粒子的最外層核衣殼，都是病毒的主要中和抗原。VP4 在胰酶的作用下可以裂解為帶氨基末端的 VP8(aa1～240)與帶羧基末端的 VP5(aa248～775) 兩個(gè)片段，在病毒檢測(cè)、分型、產(chǎn)生中和抗體及免疫性保護(hù)過(guò)程中具有重要意義[1]。本研究可以為華東地區(qū)的豬輪狀病毒的流行病學(xué)調(diào)查提供數(shù)據(jù)支持，同時(shí)對(duì)該基因的分析對(duì)于華東地區(qū)的臨床病原的監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查具有一定的參考意義。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源 病料采集于華東地區(qū)的腹瀉豬場(chǎng)，1號(hào)樣品為來(lái)源于2017年中國(guó)上海的ChinaShangHai1701；2號(hào)樣品為來(lái)源于2017年中國(guó)安徽的ChianAnHui1702；3號(hào)樣品為來(lái)源于2017年中國(guó)山東的ChinaShanDong1703；4號(hào)樣品為來(lái)源于2018年中國(guó)江蘇的ChinaJiangSu1801；5號(hào)樣品為來(lái)源于2018年中國(guó)浙江ChinaZheJiang1802。

1.2 主要試劑及儀器 總RNA提取試劑盒,購(gòu)自Magen公司;用于PCR擴(kuò)增的酶、載體以及膠回收試劑盒,均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;DYY-11型電泳儀,購(gòu)自北京市六一儀器廠；TaKaRa PCR thermal cycler； PCR儀,購(gòu)自TaKaRa公司；凝膠成像儀,購(gòu)自上海天能科技有限公司；二級(jí)生物安全柜,購(gòu)自南京新飛達(dá)光電科學(xué)技術(shù)有限公司；DK-8D型電熱恒溫水槽,購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì) 依據(jù)GenBank獲得的豬輪狀毒株VP7和VP4全基因序列設(shè)計(jì)2對(duì)引物。VP7引物，引物VP7-F：5′-GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCT-3′,VP7-R:5′-TCTAAATTCTGTAGTAAAAA GCAGCTG-3′，退火溫度為55 ℃，片段長(zhǎng)度為1 062 bp。VP4引物，引物名稱為VP4-F：5′-GGCTATAAAATGGCTTCGCTCA-3′，VP4-R:5′-GGTCACAACCTCTAGACACTACT-3′,退火溫度為55 ℃，片段長(zhǎng)度為2 362 bp。引物由南京思普金生物科技有限公司合成。

1.4 病毒RNA的制備 采用 PBS 將糞便以 1∶5 比例稀釋，混勻后反復(fù)凍融 3 次，8 000 r/min 離心10 min， 加入細(xì)胞裂解劑，根據(jù)Magen公司總RNA提取試劑盒說(shuō)明書,按照要求及步驟提取總RNA，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用于PCR反應(yīng)。

1.5 PCR反應(yīng) 按常規(guī)方法提取病毒總RNA， 完成 cDNA 逆轉(zhuǎn)錄程序， 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。一般的反轉(zhuǎn)錄體系為水14 μL，反轉(zhuǎn)錄酶 4 μL、RNA 2 μL。反應(yīng)的程序如下：25 ℃ 10 min;42 ℃，30 min; 85 ℃ 5 min,4 ℃保存。PCR 反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s、72 ℃延伸3 min,30 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 延伸10 min，4 ℃ 保存。

1.6 目的基因的克隆與鑒定及序列分析 取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行核酸電泳，凝膠成像儀掃描成像。 取與目的基因大小一致的片段進(jìn)行膠回收，克隆到 pMD-19T 載體中，16 ℃連接過(guò)夜，再轉(zhuǎn)化到 Trans-5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，12 h后挑菌，置于含有100 μg/mL的氨芐青霉素的 LB 培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，菌液 PCR鑒定，挑選陽(yáng)性菌液，提取質(zhì)粒，最后由南京思普金生物科技有限公司完成測(cè)序工作。應(yīng)用DNASTAR、利用 Meg Align 對(duì)獲得的VP7、VP4基因序列與 GenBank 上部分PRV 的VP7、VP4基因序列進(jìn)行比較分析，找出該毒株基因組序列變異情況用Mega 6.0 軟件來(lái)繪制進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 序列擴(kuò)增結(jié)果 對(duì)5份陽(yáng)性臨床樣品VP7和VP4基因進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)核酸電泳，結(jié)果顯示，VP7基因可擴(kuò)增出大小約1 100 bp的條帶，VP4基因可擴(kuò)增出大小約2 300 bp的條帶(圖1)，與目的片段大小相一致。

2.2VP7序列分析及基因型的鑒定 經(jīng)測(cè)序證實(shí)獲得了陽(yáng)性樣品VP7的基因全長(zhǎng)序列為1 062 bp,包括5′端非編碼區(qū)48 bp，3′端非編碼區(qū)33 bp,中間為一個(gè)完整的開放閱讀框(ORF)，共981 bp，編碼326個(gè)氨基酸。這5株毒株的同源性彼此為96.3%～100%，如圖2，按照輪狀病毒分類工作組(RCWG)公布的豬輪狀病毒基因分型方法，與GenBank上的G9型參考毒株NMTL、A2、JP16-3、JP32-4、B3458同源性較高，均在95%以上；其中與2008年分離的NMTL毒株的核苷酸同源性最高為97.5%，另外與NMTL氨基酸的同源性也高達(dá)97.2%～97.5%，而與G5型代表毒株OSU的核苷酸同源性較低，僅為77.3%～77.6%。而其他血清型的核苷酸序列和氨基酸序列均較低，由此推斷，這5個(gè)毒株的基因型為G9。核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，如圖3，可見5個(gè)毒株與NMTL同屬一個(gè)分支，并與G9型毒株在一個(gè)群，進(jìn)一步證實(shí)，這5個(gè)毒株血清型為G9型。

圖1 PRV VP7和VP4基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

M：DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL 5 000 bp)； A圖為VP7基因擴(kuò)增結(jié)果: 1～5：樣品CHSH1701、CHAH1702、CHSD1703、CHJS1801、CHZJ1802； +:陽(yáng)性對(duì)照;-: 陰性對(duì)照； B圖為VP4基因擴(kuò)增結(jié)果: 1～5：樣品CHSH1701、CHAH1702、CHSD1703、CHJS1801、CHZJ1802；+:陽(yáng)性對(duì)照;-: 陰性對(duì)照

2.3VP4序列分析及基因型的鑒定 經(jīng)測(cè)序證實(shí)獲得了陽(yáng)性樣品VP4的基因全長(zhǎng)序列為2 362 bp,包括5’端非編碼區(qū)和3’端非編碼區(qū)共31 bp,中間為一個(gè)完整的ORF，共2 331 bp，編碼777個(gè)氨基酸。如圖4，可見5個(gè)毒株與GenBank上的P7型參考毒株YM和OSU同源性較高，與YM同源性為96.3%～96.4%；與目前流行豬源毒株OSU的同源性為98.5%～98.7%。通過(guò)核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，如圖5，這5個(gè)毒株與OSU在同一個(gè)分支，并與P7型毒株在一個(gè)群，進(jìn)一步證實(shí)，這5個(gè)豬輪狀病毒的基因型鑒定為P7。

圖2 PRV VP7基因氨基酸序列與參考毒株氨基酸序列同源性分析

圖3 PRV VP7核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹分析圖

注：本試驗(yàn)毒株用黑色三角形表示

圖4 PRV VP4基因氨基酸序列與參考毒株氨基酸序列同源性分析

3 討論

楊繼紅等在2006年于武漢地區(qū)第一次發(fā)現(xiàn)了G9型血清型[8]。我國(guó)及日本、泰國(guó)等東南亞國(guó)家在2005年以前均以G3、G5血清型流行為主,但目前階段我國(guó)以G5和G9血清型為主[9]。2000-2007 年，已普遍報(bào)道 G9 型 RV在豬輪狀病毒中，主要流行的是G3、G4、G5、G9血清型和G11血清型以及P6、P7、P13、P23血清型和P26血清型[10-11]。通過(guò)王璐在2011-2012 年 G9 型豬輪狀病毒流行病學(xué)調(diào)查可知病料陽(yáng)性率為7.34 %；豬場(chǎng)陽(yáng)性率為19 %[12]。張佩華等對(duì)2013-2014年間華東地區(qū)的病毒性腹瀉進(jìn)行檢測(cè)PRV陽(yáng)性率為3.8%[13],近年在中國(guó)地區(qū)研究人員來(lái)對(duì)G9型RV的關(guān)注度每年都會(huì)升高，可知其在豬群中的檢出率存在逐年增多的趨勢(shì)[14]。在2016年，楊娟鑒定分離了1株VP4為P7型毒株[15]，最新的調(diào)查中，2018年山東省PRV陽(yáng)性率為65/226(28.76%),所有5種PRV都屬于A組，G5和G9基因型是主要的基因型[16]。本研究室在臨床樣品檢測(cè)到的PRV陽(yáng)性率52/201(25.9%),表明豬輪狀病毒的流行普遍起來(lái)。5個(gè)陽(yáng)性病料經(jīng)血清型和基因型鑒定為豬A群的G9P7型，說(shuō)明G9型毒株和P7型毒株在臨床上的流行性相對(duì)普遍起來(lái)。王振玲等對(duì)PRV病毒VP7基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)在我國(guó)流行的 G9型輪狀病毒存在很大程度的遺傳變異[17]。VP4蛋白上不依賴唾液酸位點(diǎn)可能位于胰蛋白酶裂解處和393位氨基酸區(qū)域[18]。通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在VP4的393位氨基酸位點(diǎn)處，5個(gè)毒株中存在兩個(gè)毒株由H→G的突變，在氨基酸位點(diǎn)19(S→P)、30(S→P)、79(S→G)、98(N→S)、137(H→Q)、178(N→S)、384(S→D)、393(H→G)、479(D→N)、521(A→V)、627(T→A)、686(V→A)、774(M→L)發(fā)生變異，抗原表位的預(yù)測(cè)并沒有出現(xiàn)有意義的變化，未發(fā)現(xiàn)缺失和插入，由于VP7比較復(fù)雜的空間構(gòu)象性，給臨床疫苗的研制帶來(lái)較多障礙，減緩了RV的防控進(jìn)程。本文對(duì)5個(gè)毒株的核苷酸序列和生物信息學(xué)分析，為今后對(duì)豬輪狀病毒的蛋白功能研究提供了理論依據(jù)。從華東地區(qū)豬病毒性腹瀉感染狀況調(diào)查可知，部分豬場(chǎng)仍存在PRV感染[13]。我們應(yīng)加強(qiáng)臨床病料的檢測(cè)，進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)豬輪狀流行毒株的了解，在一定程度指導(dǎo)臨床生產(chǎn)。這5個(gè)毒株與我國(guó)近年來(lái)分離到的G9型豬輪狀病毒的VP7和P7型豬輪狀病毒的VP4的抗原表位上存在一定數(shù)量的氨基酸變異和抗原表位的突變，這些研究能為目前的研究數(shù)據(jù)提供了有價(jià)值的信息，將有助于闡明輪狀病毒疾病的機(jī)制和未來(lái)疫苗的設(shè)計(jì)。

圖5 PRV VP4核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

注：本試驗(yàn)毒株用黑色三角形表示