柿葉總黃酮提取純化工藝研究

周雅陽，杜 江

(貴陽中醫(yī)學院，貴州 貴陽 550002)

柿葉為柿科柿屬植物柿(DiospyroskakiThunb.)的新鮮或干燥葉，在我國分布廣泛，作為藥用植物具有悠久的歷史，始載于《滇南本草》[1]，《本草再新》中記載其具有治療咳嗽吐血、止渴生津之功效。柿葉中含有豐富的維生素、蘆丁以及鐵、鋅、鈣等對人體健康有益的多功能營養(yǎng)成分，現(xiàn)代藥理學研究表明柿葉具有清熱解毒、潤肺強心、鎮(zhèn)咳止血、改善血管通透性等多種醫(yī)療保健功能[2]。黃酮作為柿葉的有效成分之一，具有降血糖、抗菌、抗腫瘤、止血、調(diào)血脂、改善微循環(huán)等藥理作用[3-5]，藥用價值高，開發(fā)前景樂觀。目前，國內(nèi)對柿葉中總黃酮的研究報道頗多，但提取工藝不盡相同，也沒有進行深入探討和比較。因此，本實驗對柿葉有效部位總黃酮的提取純化工藝進行系統(tǒng)研究，為柿葉的開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

島津LC-20A高效液相色譜儀(二極管陣列檢測器，LC-20A色譜工作站)；電子天平(ME204E/02梅特勒-托利多儀器有限公司)；冷凍干燥機(LGS-18，北京松源華興科技發(fā)展有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52A，上海亞榮生化儀器廠)。

山柰酚對照品(批號：110861-201310)、槲皮素對照品(批號：100081-200907)，購自中國食品藥品檢定研究院；色譜甲醇；色譜乙腈；磷酸(分析純)；純凈水等。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮含量測定

2.1.1 色譜條件 在文獻[6]基礎上調(diào)整，色譜柱：Agilent SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)和保護柱，流動相為甲醇-0.2%磷酸水溶液(55∶45)，檢測波長360 nm，柱溫35 ℃，流速1 mL/min。

圖1 對照品(A)和樣品(B)色譜(1.槲皮素；2.山柰酚)

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取適量槲皮素、山柰酚對照品，加甲醇制成每1 mL含槲皮素51.1 μg、山柰酚48.8 μg的溶液，即得。

2.1.3 標準曲線繪制 分別將對照品溶液稀釋1、1.25、2、10、25、50倍，進樣10 μL，記錄峰面積。以對照品溶液濃度(μg/mL)為橫坐標X，以峰面積為縱坐標Y進行線性回歸。槲皮素和山柰酚的回歸方程分別為：Y=42628X-11233，r=0.9999；Y=42486X-13625，r=0.9999。結(jié)果表明：槲皮素濃度在1.02～51.1 μg/mL范圍內(nèi)，山柰酚濃度在0.976～48.8 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系。見圖2、圖3。

圖2 槲皮素的標準曲線

圖3 山柰酚的標準曲線

2.1.4 供試品溶液制備 (1)藥材總黃酮含量測定。取0.5 g柿葉粉末，精密稱定，加50 mL甲醇，稱重，超聲處理60 min，放冷并補足損失的重量，離心，精密吸取上清液10 mL，加甲醇-25%鹽酸(2∶1)15 mL，加熱回流30 min，放冷，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶，加甲醇至刻度，濾過，取續(xù)濾液20 μL進樣測定，柿葉總黃酮含量為0.43%?？傸S酮含量=(A1+11233)/(42628×2000)+(A2+13625)/(42628×2000)，A1：樣品槲皮素峰面積，A2：樣品山柰酚峰面積。

(2)提取物總黃酮含量測定。精密稱定樣品0.1 g，加甲醇：25%鹽酸溶液(2∶1)15 mL，加熱回流30 min，冷卻，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。總黃酮含量計算公式同上。

2.2 柿葉總黃酮提取工藝單因素考察

2.2.1 提取溶劑考察 稱取20 g柿葉粉末5份，分別加入15倍量的0、30、50、75、95%的乙醇水溶液，加熱回流2次，每次1.5 h，合并濾液，干燥得總黃酮粗提物，75%乙醇提取的黃酮純度、得率較高，故選擇75%乙醇為提取溶劑。結(jié)果見表1。

總黃酮得率=(提取物中總黃酮的質(zhì)量/原料的質(zhì)量)×100，粗提物中總黃酮純度(提取物中總黃酮的質(zhì)量/粗提物的質(zhì)量)×100，后續(xù)實驗中柿葉總黃酮得率及粗提物總黃酮純度也按此法計算。

表1 提取溶劑考察結(jié)果 (%)

2.2.2 物料比考察 稱取20 g柿葉粉末4份，分別加入8、10、15、20倍量的75%乙醇溶液，其他操作同“2.2.1”，綜合黃酮純度、得率及提取成本考慮，選擇15倍量。結(jié)果見表2。

表2 提取溶劑考察結(jié)果

2.2.3 提取時間考察 稱取20 g柿葉粉末3份，加入15倍量的75%乙醇溶液，分別加熱回流0.5、1、1.5 h，其他操作同“2.2.1”項，提取1 h時黃酮純度、得率最高，故選擇1 h為提取時間。結(jié)果見表3。

表3 提取時間、次數(shù)的考察結(jié)果

2.2.4 提取次數(shù)考察 稱取20 g柿葉粉末，加入15倍量的75%乙醇，加熱回流3次，每次1 h，分別干燥濾液，稱定3份浸膏的質(zhì)量，綜合考慮浸膏質(zhì)量、黃酮純度及成本，選擇提取2次。結(jié)果見表3。

2.3 柿葉總黃酮純化工藝研究

2.3.1 總黃酮粗提物制備 稱取柿葉粉末40 g，加入15倍量75%乙醇，加熱回流2次，每次1 h，抽濾，合并濾液，濃縮，冷凍干燥成浸膏，備用。

2.3.2 純化工藝比較 (1)酸水解法。取浸膏1 g，精密稱定，加入50 mL的水解液，水浴水解1 h(80 ℃，磁力攪拌)，離心，沉淀用水洗滌，收集上清液，干燥。5%硫酸水解液純化的黃酮純度及得率最高。結(jié)果見表4。

表4 水解液對黃酮純化工藝的影響結(jié)果

(2)萃取法。取浸膏1 g，精密稱定，加入15 mL水成混懸液，依次用1倍量石油醚、2倍量乙酸乙酯萃取6次，合并乙酸乙酯層，干燥，得浸膏0.24 g，黃酮純度為12.6%。

(3)大孔樹脂法。大孔吸附樹脂預處理后，濕法裝柱，取1 g浸膏，精密稱定，用蒸餾水配制成濃度為3 mg/mL的溶液上柱，去離子水洗至流出液無色，依次按10、50、75%乙醇以1 BV/h流速洗脫，收集，干燥，計算浸膏質(zhì)量及黃酮純度。結(jié)果見表5。

表5 洗脫液對黃酮純化工藝的影響結(jié)果 (%)

3 討論

黃酮類化合物主要以苷類的形式存在，根據(jù)相似相溶原理，黃酮苷一般可溶于熱水、甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑中，用乙醇提取黃酮類化合物是目前使用較多的一種方法[7-8]。柿葉總黃酮的提取方法較多，如林國榮等[9]采用水提法，固液比1∶10，溫度75 ℃，提取時間2 h；吉俊生等[10]采用濃度為70%乙醇提取，料液比1∶10，提取時間為1 h，提取2次；楊露等[11]采用超聲法提取，以40倍量的40%乙醇為溶劑，在60 ℃下超聲50 min。盡管提取方法多樣，但黃酮純度及得率并不高。

本實驗在此基礎上研究了柿葉中總黃酮的提取工藝，采用單因素試驗考察了提取所用溶劑、物料比、提取時間、提取次數(shù)，確定了最優(yōu)條件為15倍量的75%乙醇加熱回流2次，每次1 h。在柿葉總黃酮純化工藝研究中，分別采用了萃取法、酸水解法、大孔樹脂純化法，發(fā)現(xiàn)依次用1倍量石油醚、2倍量乙酸乙酯分別萃取6次精制后的黃酮純度為12.6%，回收率在95%以上。萃取法與其他方法相比工藝簡單，成本低，效率較高，實用性較強。

柿葉為民間常用藥材，資源十分豐富，其藥用價值和保健作用越來越受到人們的重視，但柿葉的研究多側(cè)重于有效成分的提取，對藥理藥效、制劑制備及其臨床應用的深入挖掘甚少。今后應注重加強柿葉制劑的研發(fā)和臨床應用的開發(fā)，尤其在研究較為成熟的心腦血管疾病領域開發(fā)出療效顯著的柿葉產(chǎn)品。