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    綜合評分法優(yōu)選黃芪中6種皂苷類成分的提取工藝

    2019-05-18 06:25:20王亞麗王昌利葛人杰顏永剛
    亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥 2019年4期
    關(guān)鍵詞:皂苷類甲苷皂苷

    王亞麗,田 曼,李 江,王昌利,葛人杰,李 歡,王 媚,顏永剛,張 崗

    (陜西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,陜西 西安 712046)

    黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) B-ge. var. mongholicus ( Bge.) Hsiao 或莢膜黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) B-ge 的干燥根[1]。中藥黃芪是我國最常用的大宗中藥材之一,具有補(bǔ)氣健脾、升陽舉陷、益衛(wèi)固表、利尿消腫、托毒生肌的功效,是補(bǔ)氣要藥,在中藥中被譽(yù)為“補(bǔ)氣圣藥”?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn),黃芪中主要含有皂苷類、黃酮類、黃芪多糖、氨基酸、生物堿及微量元素等多種有效成分,具有增強(qiáng)免疫系統(tǒng)、抗氧化、延緩衰老、抗病毒等作用[2]。其中黃芪總皂苷是黃芪中主要的一類活性物質(zhì),具有降血壓、降血糖、改善胰島素抵抗活性、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、抗血栓、抗風(fēng)濕、抗腫瘤、保護(hù)心臟等生物活性[3-8]。本實驗在對黃芪中6種皂苷成分提取方法、提取溶劑進(jìn)行初篩的基礎(chǔ)上,以黃芪甲苷,黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,異黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ的含量為評定指標(biāo),采用綜合評分與正交實驗設(shè)計相結(jié)合優(yōu)選黃芪皂苷最佳提取工藝條件,為黃芪皂苷成分的客觀評價提供實驗依據(jù)。

    1 儀器與試藥

    1.1 儀器

    Waters 2695高效液相色譜儀系列:Empower pro色譜工作站,在線脫氣機(jī),四元高壓梯度泵,自動進(jìn)樣器,柱溫箱,Waters 2420 ELSD Detector檢測器;KQ-2500E數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);DK-98-II電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司);SHB-III循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);GZX-9140MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);FW177中草藥粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司);標(biāo)準(zhǔn)檢驗篩(45目,孔徑0.40mm),浙江恒幸儀器設(shè)備制造有限公司。

    1.2 試藥

    對照品黃芪甲苷(批號10212-201603)、黃芪皂苷Ⅲ(批號10215-201611)、黃芪皂苷Ⅱ(批號10214-201701)、異黃芪皂苷Ⅱ(批號20417-201701)、黃芪皂苷Ⅰ(批號10213-201610)、異黃芪皂苷Ⅰ(批號20416-201605)均購自南昌貝塔生物科技有限公司,質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%。黃芪Astragali Radix藥材采自步長集團(tuán)宕昌縣黃芪種植基地,經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)王繼濤高級實驗師鑒定為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranace-us(Fisch.)Bge. var. mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根。實驗用水為娃哈哈純凈水,杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司生產(chǎn);乙腈和甲醇均為色譜純,購自美國賽默飛世爾科技有限公司;冰醋酸(色譜純),天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。其他試劑均為分析純。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 含量測定方法

    建立同時測定黃芪中6種皂苷成分含量的HPLC方法。

    2.1.1色譜條件 色譜柱為Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫 25 ℃;流動相為 0.3% 冰醋酸(A)-乙腈(B),梯度洗脫,0~12 min,18% B;12~35 min,18% B→30% B;35~43 min,30% B;43~60 min,30% B→55% B;60~70 min,55% B→70% B;70~80 min,70% B→100%B;系統(tǒng)平衡時間 20 min;流速 1.0 mL/min;進(jìn)樣量 10 μL;蒸發(fā)光散射檢測器條件:漂移管溫度 60 ℃,噴霧器溫度 36 ℃,增益值 130,供氣壓力 80 psi。對照品及樣品的液相色譜見圖1。

    t/min

    注:1.黃芪甲苷;2.黃芪皂苷Ⅲ; 3.黃芪皂苷Ⅱ;4.異黃芪皂苷Ⅱ; 5.黃芪皂苷Ⅰ; 6.異黃芪皂苷Ⅰ

    圖1 混合對照品溶液D(A)及樣品(B)的HPLC-ELSD色譜

    2.1.2 對照品溶液制備 精密稱定對照品黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ適量,用甲醇超聲溶解制成含有100 μg/mL黃芪甲苷、500 μg/mL黃芪皂苷Ⅲ、200 μg/mL黃芪苷Ⅱ、80 μg/mL異黃芪皂苷Ⅱ,1 300 μg/mL黃芪皂苷Ⅰ、520 μg/mL異黃芪皂苷Ⅰ的混合對照品溶液C;精密稱定對照品黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ適量,用甲醇超聲溶解制成含有60μg/mL黃芪甲苷、270μg/mL黃芪皂苷Ⅲ、100 μg/mL黃芪皂苷Ⅱ、50 μg/mL異黃芪皂苷Ⅱ、650 μg/mL黃芪皂苷Ⅰ、250 μg/mL異黃芪皂苷Ⅰ的混合對照品溶液D。分別將混合對照品溶液C、D放于4 ℃冰箱中保存,備用。

    2.1.3 供試品溶液制備 將黃芪藥材于50 ℃干燥24 h,打粉,過45目篩,精密稱量粉末5.0 g,置500 mL圓底燒瓶中,精密加入80%甲醇200 mL,浸泡12h后,加熱回流提取3次,每次1 h,過濾,濾液蒸干,加入100 mL水溶解殘渣,將溶液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中,石油醚萃取3次,每次200 mL,棄去石油醚層,將非石油醚層轉(zhuǎn)移到蒸發(fā)皿中,濃縮干燥,加甲醇定容到10 mL容量瓶中,0.22 μm微孔濾膜過濾,取續(xù)慮液,即得。

    2.1.4 線性關(guān)系考察 將“2.1.2”項下混合對照品溶液D按“2.1.1”色譜條件依次進(jìn)樣2 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL、16 μL,重復(fù)測定3次,以進(jìn)樣量的對數(shù)為橫坐標(biāo)(X),峰面積的對數(shù)(Y)為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,回歸方程及線性范圍見表1。

    表1 6種皂苷類成分的線性關(guān)系與線性范圍

    2.1.5 精密度試驗 取混合對照品溶液D,按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,每次進(jìn)樣量10 μL,計算黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ的峰面積RSD分別為1.62%、2.01%、1.59%、1.98%、2.29%、2.36%,表明儀器精密度良好。

    2.1.6 重復(fù)性考察 依據(jù)最優(yōu)提取工藝,按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液,按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)行測定,計算黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ的峰面積RSD分別為2.25%、2.21%、1.72%、2.10%、2.83%、2.41%,結(jié)果表明本實驗的重復(fù)性良好。

    2.1.7 穩(wěn)定性考察 取最優(yōu)提取工藝所得供試品溶液,分別在制備后的0、4、8、12、16、24 h各進(jìn)樣1次,每次進(jìn)樣量10 μL,測定黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ的峰面積RSD分別為2.09%、2.15%、2.77%、2.26%、2.53%、2.64%,表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

    2.1.8 加樣回收率 精密稱定同一批已知含量的黃芪粉末1.0 g,共6份,分別精密加入混合對照品溶液C1.0 mL。按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液,再按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定,進(jìn)樣量15 μL。結(jié)果黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ的平均回收率依次為102.75%、98.89%、96.91%、100.06%、99.34%、96.68%,RSD依次為2.48%、1.75%、2.16%、2.68%、2.76%、2.59%。

    2.2 黃芪中6種皂苷成分提取工藝研究

    2.2.1 提取方法考察 (1)超聲提取法:精密稱取黃芪粉末:5.0g,置500mL的錐形瓶中,精密加入甲醇200mL,浸泡12h后,超聲提取1次,提取1h,即得超聲提取液。

    (2)回流提取法:精密稱取黃芪粉末5.0 g,置500 mL的圓底燒瓶中,精密加入甲醇200 mL,浸泡12 h后,加熱回流提取1次,提取1 h,即得回流提取液。

    將上述兩種提取方法所得提取液按照“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定,從6種皂苷類成分的總提取量來看,甲醇回流法提取量較高。結(jié)果見表2。

    表2 不同提取方法對6種皂苷類成分總提取量的影響 (mg·g-1)

    2.2.2 提取溶劑考察 精密稱取黃芪粉末5.0 g,置500 mL的圓底燒瓶中,精密加入提取溶劑200 mL,浸泡12 h后,加熱回流提取時間1 h,提取1次,考察80%甲醇與不同體積分?jǐn)?shù)乙醇(80%、90%、95%)提取對黃芪中6種皂苷類成分含量的影響。結(jié)果表明甲醇比乙醇更適合用來提取黃芪中這6種皂苷類成分。結(jié)果見表3。

    表3 不同提取溶劑對6種皂苷類成分總提取量的影響 (mg·g-1)

    2.2.3 醇提工藝的因素和水平優(yōu)化 以上試驗表明選用80%甲醇加熱回流提取黃芪中6種皂苷類成分較合適,為優(yōu)化甲醇回流提取工藝,對甲醇體積分?jǐn)?shù)(因素A)、提取時間(因素B)及提取次數(shù)(因素C)進(jìn)行了3因素3水平的正交試驗。因素水平見表4。

    表4 正交試驗因素水平

    精密稱取黃芪粉末各5.0 g,按照L9(34)正交試驗設(shè)計表中確定的條件進(jìn)行實驗,按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定,分別計算這6種皂苷類成分的含量,并進(jìn)行多指標(biāo)綜合評分。評分時以各指標(biāo)的最大值為參照對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化,再給出各指標(biāo)的權(quán)重。賦予指標(biāo)權(quán)重采用專家評分法,即同行專家依據(jù)黃芪中這6種皂苷類成分在黃芪總皂苷提取工藝整體評價中的相對重要程度,獨立給出各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù);查閱近10年來黃芪藥材中黃芪皂苷類成分提取工藝以及含量測定相關(guān)文獻(xiàn)107篇,其中83篇檢測了黃芪甲苷,18篇檢測了黃芪皂苷Ⅲ,22篇檢測了黃芪皂苷Ⅱ,20篇檢測了黃芪皂苷Ⅰ,4篇檢測了異黃芪皂苷Ⅱ,2篇檢測了異黃芪皂苷Ⅰ。將專家評分法與各指標(biāo)在近10年來黃芪皂苷類成分提取工藝以及含量測定相關(guān)文獻(xiàn)中被檢測的頻率統(tǒng)計相結(jié)合對各指標(biāo)設(shè)定權(quán)重,同時,鑒于黃芪甲苷是黃芪中增強(qiáng)機(jī)體免疫的主要有效成分之一[9],并通常作為評價黃芪藥材及制劑質(zhì)量的常用指標(biāo)性成分,故本實驗取權(quán)重系數(shù)分別為:黃芪甲苷權(quán)重為0.6,黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ權(quán)重均為0.1,異黃芪皂苷Ⅰ權(quán)重為0.04、異黃芪皂苷Ⅱ權(quán)重為0.06。按照下列公式求出綜合評分值(Y),以綜合評分值進(jìn)行統(tǒng)計分析。正交試驗安排及結(jié)果見表5,方差分析見表6。

    Yi=0.6X/0.1212+0.1×(Z/0.6447+M/0.2751+N/1.6691)+0.06P/0.1134+0.04Q/0.6020,(X為黃芪甲苷含量、Z為黃芪皂苷Ⅲ含量、M為黃芪皂苷Ⅱ含量、N為黃芪皂苷Ⅰ含量、P為異黃芪皂苷Ⅱ含量、Q為異黃芪皂苷Ⅰ含量),i=1,2,3,.....9。

    表5 正交試驗結(jié)果 (mg·g-1)

    表6 正交試驗方差分析

    注:F0.05(2,2)=19.00。

    2.2.4 正交試驗結(jié)果分析 以綜合評分值為標(biāo)準(zhǔn),由表5直觀分析可知,在所選因素水平范圍內(nèi),各因素的作用主次順序為A(提取溶劑體積分?jǐn)?shù))>C(提取次數(shù))>B(提取時間),理論上以A1B2C3為最優(yōu)組合,即80%甲醇回流提取3次,每次提取2 h。由表6方差分析結(jié)果表明,因素A(甲醇體積分?jǐn)?shù))和因素C(提取次數(shù))均為主要影響因素,對各指標(biāo)成分的提取有顯著性影響(P<0.05),因素B(提取時間)對提取結(jié)果不具有顯著性影響(P>0.05),由于提取時間對試驗結(jié)果的影響經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗不具有顯著性,為了降低成本、節(jié)約時間、提高效率,故最終確定最優(yōu)組合為A1B1C3,即80%甲醇回流提取3次,每次提取1 h。

    2.2.5 正交驗證試驗 為進(jìn)一步考察優(yōu)選工藝的可靠性及穩(wěn)定性,取3份藥材按篩選得到的最佳提取工藝A1B1C3進(jìn)行正交驗證試驗,結(jié)果黃芪甲苷,黃芪皂苷Ⅲ、Ⅱ,異黃芪皂苷Ⅱ,黃芪皂苷Ⅰ,異黃芪皂苷Ⅰ的平均提取量分別為0.1098、0.4783、0.2694、0.1256、1.4356、0.5496mg·g-1,RSD值均小于2.74%,表明該工藝穩(wěn)定可行。

    3 討論

    3.1 流動相的選擇

    在實驗前,通過查閱大量文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),HPLC-ELSD法測定黃芪皂苷類成分含量時選用的流動相主要有乙腈-酸水溶液[10-12]和乙腈-水[13-17]洗脫系統(tǒng),經(jīng)實驗考察,乙腈-0.3%冰醋酸作為流動相時,基線噪音小,色譜峰的分離度、峰形均優(yōu)于乙腈-0.3%甲酸溶液和乙腈-水,由于考慮到酸性洗脫系統(tǒng)對色譜柱的損害,為保護(hù)色譜柱,所以適當(dāng)降低冰醋酸濃度,但隨著冰醋酸濃度的降低,色譜峰靈敏度亦隨著變低,故本實驗最終采用乙腈-0.3%冰醋酸溶液作為流動相。

    3.2 評價指標(biāo)的選擇

    通過查閱文獻(xiàn),黃芪中黃芪甲苷,黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,異黃芪皂苷Ⅰ、Ⅱ等皂苷類成分具有抗腫瘤、抗肝纖維化、抗衰老、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等藥理作用。采用單一指標(biāo)成分進(jìn)行工藝優(yōu)選與中藥多組分、多靶點的作用特點有一定偏離,考慮到單一成分作為中藥提取工藝評價指標(biāo)的局限性,故本實驗以黃芪中6種皂苷類成分的含量作為研究指標(biāo)。

    3.3 數(shù)據(jù)處理分析

    據(jù)文獻(xiàn)報道,黃芪皂苷提取主要以總皂苷或黃芪甲苷工藝篩選為主,涉及的成分過于籠統(tǒng)或單一,考慮其藥理作用較少。故本實驗采用多指標(biāo)綜合評分法結(jié)合正交試驗設(shè)計來篩選黃芪中6種皂苷類成分最佳提取工藝。不僅利用正交試驗方法進(jìn)行相關(guān)因素和水平的考察,同時也考慮到了黃芪甲苷和其他5種具體的皂苷成分的含量和藥理作用。采用多指標(biāo)的正交試驗設(shè)計進(jìn)行工藝優(yōu)選時,首先需要針對指標(biāo)間的重要性差異給各指標(biāo)設(shè)定權(quán)重系數(shù),進(jìn)行綜合評分后再做統(tǒng)計分析。本實驗從專家評分和近10年來相關(guān)文獻(xiàn)統(tǒng)計情況兩方面考慮,最后給出各指標(biāo)權(quán)重,這樣進(jìn)行統(tǒng)計分析優(yōu)選出的工藝更具有科學(xué)性和合理性,為后期黃芪的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了實驗參考。

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