PB試驗(yàn)結(jié)合BBD響應(yīng)面法優(yōu)化綠絲郁金醋炙工藝研究

權(quán) 亮，陳志敏,4，趙永峰，李文兵，胡昌江,2*

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137；2.國(guó)家中醫(yī)藥管理局“中藥配方顆粒質(zhì)量與療效評(píng)價(jià)”重點(diǎn)研究室，四川 成都 611900；3.四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司，四川 成都 611900；4.成都市中草藥研究所，四川 成都 610016)

郁金為姜科植物溫郁金(CurcumawenyujinY. H. Chen et C. Ling)、姜黃(C.longaL.)、廣西莪術(shù)(C.kwangsiensisS.G. Lee et C. F. Liang)或蓬莪術(shù)(C.PhaeocaulisVal.)的干燥塊根，依次被習(xí)稱為溫郁金、黃絲郁金、桂郁金和綠絲郁金[1]。郁金醋制品在臨床中應(yīng)用廣泛，綠絲郁金作為郁金的重要來(lái)源，其現(xiàn)有炮制工藝研究幾乎沒(méi)有，因此亟需對(duì)其炮制工藝進(jìn)行優(yōu)化，規(guī)范綠絲郁金醋制品的質(zhì)量控制。

本實(shí)驗(yàn)在單因素考察的基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman試驗(yàn)法結(jié)合BBD響應(yīng)面法優(yōu)化綠絲郁金醋制工藝。本課題組在前期大量研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，莪術(shù)呋喃二烯酮是綠絲郁金的特征成分，且含量相對(duì)吉馬酮更高，遂以吉馬酮及莪術(shù)呋喃二烯酮含量為指標(biāo)，基于信息熵賦權(quán)法[2-6]，考察稀釋加水量(A)、悶潤(rùn)時(shí)間(B)、炮制溫度(C)、炮制時(shí)間(D)對(duì)綜合評(píng)分值的影響，以優(yōu)化綠絲郁金的醋制工藝[7-8]，為其規(guī)范化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

SHIMADZU LC-2030C 3D高效液相色譜儀(日本島津公司)；超聲波清洗機(jī)(40 kHz，300 W，昆山市超聲儀器有限公司)；FA1204C型電子分析天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)；Shimadzu AUW220D型電子分析天平(日本島津公司)；吉馬酮對(duì)照品(批號(hào)：111665-201605，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.8%)，莪術(shù)呋喃二烯酮(批號(hào):100185-201007，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；市售9°米醋(總酸≥9.00 g/100 mL)；綠絲郁金購(gòu)于成都荷花池中藥材市場(chǎng)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)盧先明教授鑒定為蓬莪術(shù)的干燥塊根。其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 吉馬酮及莪術(shù)呋喃二烯酮定量分析方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱Shim-pack gIST C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-水(60∶40)；PDA檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；柱溫35 ℃；體積流量為0.8 mL·min-1；進(jìn)樣體積為10 μL。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取吉馬酮及莪術(shù)呋喃二烯酮適量，置于10 mL量瓶中，加色譜甲醇溶解并定容至刻度，分別制成質(zhì)量濃度為1.20 mg·mL-1、1.13 mg·mL-1的對(duì)照品溶液?；旌蠈?duì)照品及綠絲郁金樣品色譜見圖1。

圖1 混合對(duì)照品溶液及樣品HPLC

2.1.3 供試品溶液制備 精密稱定樣品粉末(過(guò)3號(hào)篩)5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理30 min，取出放冷后用甲醇補(bǔ)足損失重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)即得。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系考察 精密吸取吉馬酮及莪術(shù)呋喃二烯酮對(duì)照品溶液，進(jìn)行逐級(jí)稀釋，即吉馬酮濃度為(60.00、30.00、15.00、7.50、3.75 μg·mL-1)，莪術(shù)呋喃二烯酮濃度為(453.20、226.60、113.30、56.65、28.33 μg·mL-1)進(jìn)樣10 μL，測(cè)定各色譜峰峰面積。以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為吉馬酮Y=18444X-13408，R2=0.9996；莪術(shù)呋喃二烯酮Y=4260.6X-12939，R2=0.9997。結(jié)果表明吉馬酮及莪術(shù)呋喃二烯酮在3.75～60 μg、28.33～453.20 μg進(jìn)樣量范圍內(nèi)與其峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定對(duì)照品的峰面積，結(jié)果吉馬酮及莪術(shù)呋喃二烯酮峰面積RSD值分別為0.31%、0.39%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、12、24 h進(jìn)樣10 μL，測(cè)定并記錄峰面積。結(jié)果吉馬酮及莪術(shù)呋喃二烯酮峰面積RSD值分別為0.36%、0.52%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品6份，分別按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，在“2.1.1”色譜條件下進(jìn)行測(cè)定并記錄峰面積。計(jì)算得到吉馬酮及莪術(shù)呋喃二烯酮峰面積RSD值分別為1.44%、0.71%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取6份已知含量的樣品2.5 g，精密稱定，按照樣品∶對(duì)照品=1∶1的比例分別精密加入對(duì)照品溶液，用甲醇補(bǔ)足25 mL。按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下分析，測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果表明吉馬酮及莪術(shù)呋喃二烯酮平均加樣回收率分別為105.9%、99.7%，RSD分別為1.20%、1.31%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

取炮制后的樣品按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析,測(cè)定吉馬酮及莪術(shù)呋喃二烯酮含量。以吉馬酮及莪術(shù)呋喃二烯酮含量最高為指標(biāo)，選取最適宜的單因素水平。

2.3.1 稀釋加水量 本課題組在前期對(duì)黃絲郁金的工藝優(yōu)化中，確定米醋最佳用量為10%，此結(jié)果與《全國(guó)炮制規(guī)范》[9]中記載一致，因此，此次用醋量也取10%。但考慮到綠絲郁金飲片質(zhì)地的不同，將稀釋加水量作為考察因素，考察其對(duì)成分含量的影響。

稱取綠絲郁金4份，每份50 g，加入0%、5%、10%、15%的水對(duì)米醋進(jìn)行稀釋，將稀釋后的米醋與藥材拌勻，悶潤(rùn)10 min，將藥材置于鍋內(nèi)，在140 ℃下炒制10 min。分別按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定吉馬酮及莪術(shù)呋喃二烯酮峰面積，計(jì)算得到其含量。結(jié)果表明,兩者含量呈增加趨勢(shì)，在5%的加水量下達(dá)到最大值，繼續(xù)增加時(shí)含量增勢(shì)減慢，因此最佳加水量為5%，即每100 g綠絲郁金，加入10 mL米醋與5 mL水的混合液進(jìn)行炮制。

2.3.2 悶潤(rùn)時(shí)間 稱取綠絲郁金4份，每份50 g，加入5 mL米醋與2.5 mL水的混合液，分別悶潤(rùn)5、10、15、20 min，將藥材置于鍋內(nèi)，140 ℃炒制10 min。分別按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定吉馬酮及莪術(shù)呋喃二烯酮峰面積，計(jì)算得到其含量。結(jié)果表明，兩者含量隨悶潤(rùn)時(shí)間的增加而增加，在15 min時(shí)達(dá)到最大值，因此最佳悶潤(rùn)時(shí)間為15 min。

2.3.3 炒制時(shí)間 稱取綠絲郁金4份，每份50 g，加入5 mL米醋與2.5 mL水的混合液，悶潤(rùn)15 min，將藥材置于鍋內(nèi)，在140 ℃下分別炒制5、10、15、20 min。分別按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定吉馬酮及莪術(shù)呋喃二烯酮峰面積，計(jì)算得到其含量。結(jié)果表明，兩者含量在10 min時(shí)達(dá)到最大值，因此最佳炒制時(shí)間為10 min。

2.3.4 炒制溫度 稱取綠絲郁金4份，每份50 g，加入5 mL米醋與2.5 mL水的混合液，悶潤(rùn)15 min，將藥材置于鍋內(nèi)，分別于100、120、140、160 ℃下，炒制10 min。分別按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定吉馬酮及莪術(shù)呋喃二烯酮峰面積，計(jì)算得到其含量。結(jié)果表明，兩者含量隨炒制溫度的增加而增加，在140 ℃時(shí)達(dá)到最大值，繼續(xù)增加時(shí)，含量反而降低，因此最佳炒制溫度為140 ℃。

2.4 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選影響綠絲郁金醋炙工藝的顯著因素

2.4.1 炮制方法 取綠絲郁金飲片，用量筒加入適量米醋拌勻，悶潤(rùn)，在一定溫度下炒制一定時(shí)間，取出，晾干，即得。

2.4.2 PB實(shí)驗(yàn)因素水平 綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用Design-Expert軟件設(shè)計(jì)12次的PB試驗(yàn)[10-14]，對(duì)稀釋加水量(A)、悶潤(rùn)時(shí)間(B)、炒制溫度(C)和炒制時(shí)間(D)進(jìn)行顯著性考察，每個(gè)因素設(shè)計(jì)高低兩個(gè)水平，分別用1、-1表示。因素水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)因素水平

2.4.3 試驗(yàn)結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)以吉馬酮及莪術(shù)呋喃二烯酮含量為指標(biāo)，結(jié)合信息熵賦值法，由Matlab程序，輸入原始評(píng)價(jià)指標(biāo)矩陣(X)，再轉(zhuǎn)化為概率矩陣(P)。具體數(shù)據(jù)如下。

X=0.44300.25920.99600.82970.56820.40860.01880.19740.14460.00200.36090.99600.78970.48170.21980.60280.02520.20970.00200.19450.68450.48260.79450.1689

P=0.08780.05360.19730.17170.11260.08450.00370.04080.02870.00040.07150.20610.15650.09970.04360.12470.00500.04340.00040.04020.13560.09990.15740.0349

應(yīng)用程序得出第I項(xiàng)指標(biāo)的系數(shù)Wi[0.595 6、0.404 4]。綜合評(píng)分Mm=P1m×W1+P2m×W2+…+Pmn×Wn，即吉馬酮及莪術(shù)呋喃二烯酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的權(quán)重系數(shù)分別為0.5956、0.4044。加權(quán)綜合評(píng)分結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 方差分析

注:*P<0.05。

從表3可得悶潤(rùn)時(shí)間和炒制時(shí)間對(duì)綠絲郁金醋炙工藝影響顯著，顯著性大小排序?yàn)槌粗茣r(shí)間(D)>悶潤(rùn)時(shí)間(B)>稀釋加水量(A)>炒制溫度(C)，稀釋加水量和炒制溫度對(duì)綠絲郁金醋炙工藝影響不顯著。結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，炒制溫度選擇為140 ℃，采用BBD-RSM法進(jìn)一步考察稀釋加水量(A)、悶潤(rùn)時(shí)間(B)及炒制時(shí)間(D)對(duì)綠絲郁金醋炙的影響。

2.5 BBD響應(yīng)面法對(duì)綠絲郁金醋炙工藝的優(yōu)化

2.5.1 因素水平 根據(jù)單因素試驗(yàn)和PB試驗(yàn)結(jié)果，選取稀釋加水量(A)、悶潤(rùn)時(shí)間(B)及炒制時(shí)間(D)為因素，每個(gè)因素選取三個(gè)水平，選擇吉馬酮及莪術(shù)呋喃二烯酮的綜合評(píng)分為響應(yīng)值。具體BBD-RSM因素水平見表4。

表4 BBD-RSM試驗(yàn)因素水平

2.5.2 試驗(yàn)結(jié)果 BBD-RSM結(jié)果處理方法同上，得到第i項(xiàng)指標(biāo)的系數(shù)Wi[0.4174、0.5826]。綜合評(píng)分Mm=P1m×W1+P2m×W2+…+Pmn/Wn，即吉馬酮及莪術(shù)呋喃二烯酮含量的權(quán)重系數(shù)分別為0.4174、0.5826，概率矩陣(P)如下。加權(quán)綜合評(píng)分結(jié)果見表5。利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行分析方差分析，方差分析見表6。

X=0.8055 0.0020 0.7949 0.3146 0.5113 0.4389 0.4792 0.6645 0.7194 0.4283 0.5117 0.9960 0.3853 0.4885 0.71060.8633 0.0020 0.8372 0.3077 0.1865 0.3111 0.6091 0.6559 0.7609 0.2497 0.6210 0.9960 0.3921 0.6275 0.7678

表5 BBD-RSM實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

各因素經(jīng)回歸擬合后，得二次多項(xiàng)回歸方程為R1=-0.43789+3.45667E-003A+0.051778B+0.018406D+6.0E-006AB-1.12E-004AD-1.59E-004BD+2.07833E-004A2-1.59717E-003B2-6.33167E-004D2。由表6可知，模型具有顯著性，R2為0.9488，失擬項(xiàng)不顯著，表明該模型擬合度較好。利用Design-Expert 8.0.6軟件，根據(jù)擬合模型繪制三維曲線圖，了解各因素的交互作用對(duì)綜合評(píng)分的影響。見圖2。

表6 方差分析

圖2 稀釋加水量、悶潤(rùn)時(shí)間和炒制時(shí)間對(duì)綜合指標(biāo)的響應(yīng)面

由Design-Expert分析可得，當(dāng)出現(xiàn)最大響應(yīng)值時(shí)，工藝條件為加水稀釋量為9.97%，悶潤(rùn)時(shí)間為15.96 min，炒制時(shí)間為11.02 min?？紤]到實(shí)際操作問(wèn)題，將最佳工藝條件優(yōu)化為加水稀釋量為10%，悶潤(rùn)時(shí)間16 min，炒制時(shí)間11 min。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

為檢測(cè)上述結(jié)果，需要對(duì)最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證。設(shè)計(jì)3組驗(yàn)證試驗(yàn)，在加水稀釋量為10%，悶潤(rùn)時(shí)間16 min，炒制溫度為140 ℃，炒制時(shí)間11 min條件下進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見表7。吉馬酮及莪術(shù)呋喃二烯酮的含量均較高，說(shuō)明該工藝符合實(shí)際工藝要求。

表7 工藝驗(yàn)證

3 討論

為優(yōu)化綠絲郁金醋炙工藝，保證炮制品質(zhì)量穩(wěn)定可控，在前期單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用PB設(shè)計(jì)聯(lián)用BBD響應(yīng)面法優(yōu)化綠絲郁金醋炙工藝。通過(guò)PB實(shí)驗(yàn)篩選出對(duì)工藝有顯著影響的因素，再用BBD響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化，使結(jié)果精確度更高、指導(dǎo)性更強(qiáng)。

同時(shí)，本課題組在前期對(duì)綠絲郁金的研究中發(fā)現(xiàn)莪術(shù)呋喃二烯酮為綠絲郁金的特征成分，且其含量高于吉馬酮，遂將吉馬酮與莪術(shù)呋喃二烯酮的含量作為指標(biāo)，信息熵賦權(quán)法具有的客觀性和直觀性避免了人為賦權(quán)重帶來(lái)的主觀性問(wèn)題，使結(jié)果更精確。同時(shí)，采用Matlab程序進(jìn)行信息熵賦權(quán)，結(jié)果直觀易分析，且穩(wěn)定可靠。

通過(guò)客觀賦值的信息熵賦值法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以綜合評(píng)分值作為醋郁金炮制工藝的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，使得數(shù)據(jù)能更準(zhǔn)確反映炮制過(guò)程對(duì)其質(zhì)量的影響，可為郁金醋炙品的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和規(guī)范化質(zhì)量控制提供依據(jù)，也為后續(xù)醋郁金的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及藥效學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。