PB試驗結合BBD響應面法優(yōu)化綠絲郁金醋炙工藝研究

權 亮，陳志敏,4，趙永峰，李文兵，胡昌江,2*

(1.成都中醫(yī)藥大學，四川 成都 611137；2.國家中醫(yī)藥管理局“中藥配方顆粒質(zhì)量與療效評價”重點研究室，四川 成都 611900；3.四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司，四川 成都 611900；4.成都市中草藥研究所，四川 成都 610016)

郁金為姜科植物溫郁金(CurcumawenyujinY. H. Chen et C. Ling)、姜黃(C.longaL.)、廣西莪術(C.kwangsiensisS.G. Lee et C. F. Liang)或蓬莪術(C.PhaeocaulisVal.)的干燥塊根，依次被習稱為溫郁金、黃絲郁金、桂郁金和綠絲郁金[1]。郁金醋制品在臨床中應用廣泛，綠絲郁金作為郁金的重要來源，其現(xiàn)有炮制工藝研究幾乎沒有，因此亟需對其炮制工藝進行優(yōu)化，規(guī)范綠絲郁金醋制品的質(zhì)量控制。

本實驗在單因素考察的基礎上，采用Plackett-Burman試驗法結合BBD響應面法優(yōu)化綠絲郁金醋制工藝。本課題組在前期大量研究時發(fā)現(xiàn)，莪術呋喃二烯酮是綠絲郁金的特征成分，且含量相對吉馬酮更高，遂以吉馬酮及莪術呋喃二烯酮含量為指標，基于信息熵賦權法[2-6]，考察稀釋加水量(A)、悶潤時間(B)、炮制溫度(C)、炮制時間(D)對綜合評分值的影響，以優(yōu)化綠絲郁金的醋制工藝[7-8]，為其規(guī)范化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

SHIMADZU LC-2030C 3D高效液相色譜儀(日本島津公司)；超聲波清洗機(40 kHz，300 W，昆山市超聲儀器有限公司)；FA1204C型電子分析天平(上海越平科學儀器有限公司)；Shimadzu AUW220D型電子分析天平(日本島津公司)；吉馬酮對照品(批號：111665-201605，質(zhì)量分數(shù)99.8%)，莪術呋喃二烯酮(批號:100185-201007，質(zhì)量分數(shù)99.9%)，均購自中國食品藥品檢定研究院；市售9°米醋(總酸≥9.00 g/100 mL)；綠絲郁金購于成都荷花池中藥材市場，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學盧先明教授鑒定為蓬莪術的干燥塊根。其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 吉馬酮及莪術呋喃二烯酮定量分析方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱Shim-pack gIST C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為乙腈-水(60∶40)；PDA檢測器，檢測波長210 nm；柱溫35 ℃；體積流量為0.8 mL·min-1；進樣體積為10 μL。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取吉馬酮及莪術呋喃二烯酮適量，置于10 mL量瓶中，加色譜甲醇溶解并定容至刻度，分別制成質(zhì)量濃度為1.20 mg·mL-1、1.13 mg·mL-1的對照品溶液?；旌蠈φ掌芳熬G絲郁金樣品色譜見圖1。

圖1 混合對照品溶液及樣品HPLC

2.1.3 供試品溶液制備 精密稱定樣品粉末(過3號篩)5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理30 min，取出放冷后用甲醇補足損失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液用0.45 μm微孔濾膜濾過即得。

2.2 方法學考察

2.2.1 線性關系考察 精密吸取吉馬酮及莪術呋喃二烯酮對照品溶液，進行逐級稀釋，即吉馬酮濃度為(60.00、30.00、15.00、7.50、3.75 μg·mL-1)，莪術呋喃二烯酮濃度為(453.20、226.60、113.30、56.65、28.33 μg·mL-1)進樣10 μL，測定各色譜峰峰面積。以對照品進樣量為橫坐標(X)，色譜峰峰面積為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，其回歸方程為吉馬酮Y=18444X-13408，R2=0.9996；莪術呋喃二烯酮Y=4260.6X-12939，R2=0.9997。結果表明吉馬酮及莪術呋喃二烯酮在3.75～60 μg、28.33～453.20 μg進樣量范圍內(nèi)與其峰面積線性關系良好。

2.2.2 精密度實驗 精密吸取“2.1.2”項下對照品溶液10 μL，重復進樣6次，測定對照品的峰面積，結果吉馬酮及莪術呋喃二烯酮峰面積RSD值分別為0.31%、0.39%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、12、24 h進樣10 μL，測定并記錄峰面積。結果吉馬酮及莪術呋喃二烯酮峰面積RSD值分別為0.36%、0.52%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4 重復性實驗 取同一批樣品6份，分別按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，分別進樣10 μL，在“2.1.1”色譜條件下進行測定并記錄峰面積。計算得到吉馬酮及莪術呋喃二烯酮峰面積RSD值分別為1.44%、0.71%，表明該方法重復性良好。

2.2.5加樣回收率實驗 取6份已知含量的樣品2.5 g，精密稱定，按照樣品∶對照品=1∶1的比例分別精密加入對照品溶液，用甲醇補足25 mL。按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下分析，測定峰面積，計算回收率，結果表明吉馬酮及莪術呋喃二烯酮平均加樣回收率分別為105.9%、99.7%，RSD分別為1.20%、1.31%，表明該方法準確度良好。

2.3 單因素實驗

取炮制后的樣品按“2.1.3”項下方法制備，在“2.1.1”項色譜條件下進樣分析,測定吉馬酮及莪術呋喃二烯酮含量。以吉馬酮及莪術呋喃二烯酮含量最高為指標，選取最適宜的單因素水平。

2.3.1 稀釋加水量 本課題組在前期對黃絲郁金的工藝優(yōu)化中，確定米醋最佳用量為10%，此結果與《全國炮制規(guī)范》[9]中記載一致，因此，此次用醋量也取10%。但考慮到綠絲郁金飲片質(zhì)地的不同，將稀釋加水量作為考察因素，考察其對成分含量的影響。

稱取綠絲郁金4份，每份50 g，加入0%、5%、10%、15%的水對米醋進行稀釋，將稀釋后的米醋與藥材拌勻，悶潤10 min，將藥材置于鍋內(nèi)，在140 ℃下炒制10 min。分別按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，測定吉馬酮及莪術呋喃二烯酮峰面積，計算得到其含量。結果表明,兩者含量呈增加趨勢，在5%的加水量下達到最大值，繼續(xù)增加時含量增勢減慢，因此最佳加水量為5%，即每100 g綠絲郁金，加入10 mL米醋與5 mL水的混合液進行炮制。

2.3.2 悶潤時間 稱取綠絲郁金4份，每份50 g，加入5 mL米醋與2.5 mL水的混合液，分別悶潤5、10、15、20 min，將藥材置于鍋內(nèi)，140 ℃炒制10 min。分別按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，測定吉馬酮及莪術呋喃二烯酮峰面積，計算得到其含量。結果表明，兩者含量隨悶潤時間的增加而增加，在15 min時達到最大值，因此最佳悶潤時間為15 min。

2.3.3 炒制時間 稱取綠絲郁金4份，每份50 g，加入5 mL米醋與2.5 mL水的混合液，悶潤15 min，將藥材置于鍋內(nèi)，在140 ℃下分別炒制5、10、15、20 min。分別按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，測定吉馬酮及莪術呋喃二烯酮峰面積，計算得到其含量。結果表明，兩者含量在10 min時達到最大值，因此最佳炒制時間為10 min。

2.3.4 炒制溫度 稱取綠絲郁金4份，每份50 g，加入5 mL米醋與2.5 mL水的混合液，悶潤15 min，將藥材置于鍋內(nèi)，分別于100、120、140、160 ℃下，炒制10 min。分別按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，測定吉馬酮及莪術呋喃二烯酮峰面積，計算得到其含量。結果表明，兩者含量隨炒制溫度的增加而增加，在140 ℃時達到最大值，繼續(xù)增加時，含量反而降低，因此最佳炒制溫度為140 ℃。

2.4 PB試驗設計篩選影響綠絲郁金醋炙工藝的顯著因素

2.4.1 炮制方法 取綠絲郁金飲片，用量筒加入適量米醋拌勻，悶潤，在一定溫度下炒制一定時間，取出，晾干，即得。

2.4.2 PB實驗因素水平 綜合單因素試驗結果，運用Design-Expert軟件設計12次的PB試驗[10-14]，對稀釋加水量(A)、悶潤時間(B)、炒制溫度(C)和炒制時間(D)進行顯著性考察，每個因素設計高低兩個水平，分別用1、-1表示。因素水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗因素水平

2.4.3 試驗結果 本實驗以吉馬酮及莪術呋喃二烯酮含量為指標，結合信息熵賦值法，由Matlab程序，輸入原始評價指標矩陣(X)，再轉化為概率矩陣(P)。具體數(shù)據(jù)如下。

X=0.44300.25920.99600.82970.56820.40860.01880.19740.14460.00200.36090.99600.78970.48170.21980.60280.02520.20970.00200.19450.68450.48260.79450.1689

P=0.08780.05360.19730.17170.11260.08450.00370.04080.02870.00040.07150.20610.15650.09970.04360.12470.00500.04340.00040.04020.13560.09990.15740.0349

應用程序得出第I項指標的系數(shù)Wi[0.595 6、0.404 4]。綜合評分Mm=P1m×W1+P2m×W2+…+Pmn×Wn，即吉馬酮及莪術呋喃二烯酮質(zhì)量分數(shù)的權重系數(shù)分別為0.5956、0.4044。加權綜合評分結果見表2，方差分析見表3。

表2 Plackett-Burman試驗設計與結果

表3 方差分析

注:*P<0.05。

從表3可得悶潤時間和炒制時間對綠絲郁金醋炙工藝影響顯著，顯著性大小排序為炒制時間(D)>悶潤時間(B)>稀釋加水量(A)>炒制溫度(C)，稀釋加水量和炒制溫度對綠絲郁金醋炙工藝影響不顯著。結合單因素實驗結果，炒制溫度選擇為140 ℃，采用BBD-RSM法進一步考察稀釋加水量(A)、悶潤時間(B)及炒制時間(D)對綠絲郁金醋炙的影響。

2.5 BBD響應面法對綠絲郁金醋炙工藝的優(yōu)化

2.5.1 因素水平 根據(jù)單因素試驗和PB試驗結果，選取稀釋加水量(A)、悶潤時間(B)及炒制時間(D)為因素，每個因素選取三個水平，選擇吉馬酮及莪術呋喃二烯酮的綜合評分為響應值。具體BBD-RSM因素水平見表4。

表4 BBD-RSM試驗因素水平

2.5.2 試驗結果 BBD-RSM結果處理方法同上，得到第i項指標的系數(shù)Wi[0.4174、0.5826]。綜合評分Mm=P1m×W1+P2m×W2+…+Pmn/Wn，即吉馬酮及莪術呋喃二烯酮含量的權重系數(shù)分別為0.4174、0.5826，概率矩陣(P)如下。加權綜合評分結果見表5。利用Design-Expert 8.0.6軟件進行分析方差分析，方差分析見表6。

X=0.8055 0.0020 0.7949 0.3146 0.5113 0.4389 0.4792 0.6645 0.7194 0.4283 0.5117 0.9960 0.3853 0.4885 0.71060.8633 0.0020 0.8372 0.3077 0.1865 0.3111 0.6091 0.6559 0.7609 0.2497 0.6210 0.9960 0.3921 0.6275 0.7678

表5 BBD-RSM實驗設計及結果

各因素經(jīng)回歸擬合后，得二次多項回歸方程為R1=-0.43789+3.45667E-003A+0.051778B+0.018406D+6.0E-006AB-1.12E-004AD-1.59E-004BD+2.07833E-004A2-1.59717E-003B2-6.33167E-004D2。由表6可知，模型具有顯著性，R2為0.9488，失擬項不顯著，表明該模型擬合度較好。利用Design-Expert 8.0.6軟件，根據(jù)擬合模型繪制三維曲線圖，了解各因素的交互作用對綜合評分的影響。見圖2。

表6 方差分析

圖2 稀釋加水量、悶潤時間和炒制時間對綜合指標的響應面

由Design-Expert分析可得，當出現(xiàn)最大響應值時，工藝條件為加水稀釋量為9.97%，悶潤時間為15.96 min，炒制時間為11.02 min?？紤]到實際操作問題，將最佳工藝條件優(yōu)化為加水稀釋量為10%，悶潤時間16 min，炒制時間11 min。

2.6 驗證試驗

為檢測上述結果，需要對最佳工藝進行驗證。設計3組驗證試驗，在加水稀釋量為10%，悶潤時間16 min，炒制溫度為140 ℃，炒制時間11 min條件下進行驗證，結果見表7。吉馬酮及莪術呋喃二烯酮的含量均較高，說明該工藝符合實際工藝要求。

表7 工藝驗證

3 討論

為優(yōu)化綠絲郁金醋炙工藝，保證炮制品質(zhì)量穩(wěn)定可控，在前期單因素實驗的基礎上，采用PB設計聯(lián)用BBD響應面法優(yōu)化綠絲郁金醋炙工藝。通過PB實驗篩選出對工藝有顯著影響的因素，再用BBD響應面法進一步優(yōu)化，使結果精確度更高、指導性更強。

同時，本課題組在前期對綠絲郁金的研究中發(fā)現(xiàn)莪術呋喃二烯酮為綠絲郁金的特征成分，且其含量高于吉馬酮，遂將吉馬酮與莪術呋喃二烯酮的含量作為指標，信息熵賦權法具有的客觀性和直觀性避免了人為賦權重帶來的主觀性問題，使結果更精確。同時，采用Matlab程序進行信息熵賦權，結果直觀易分析，且穩(wěn)定可靠。

通過客觀賦值的信息熵賦值法進行數(shù)據(jù)處理，以綜合評分值作為醋郁金炮制工藝的評價標準，使得數(shù)據(jù)能更準確反映炮制過程對其質(zhì)量的影響，可為郁金醋炙品的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和規(guī)范化質(zhì)量控制提供依據(jù)，也為后續(xù)醋郁金的質(zhì)量標準及藥效學研究奠定了基礎。