聚類分析結(jié)合主成分分析評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地枳殼藥材的一致性與差異性

張智敏，聶 莼，李亞梅，彭買姣，彭江麗，林麗美*，羅 堃*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 湘產(chǎn)大宗藥材品質(zhì)評(píng)價(jià)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/湖南省中藥不良成分快速檢測(cè)及脫除工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙410208)

枳殼(FructusAurantii)始載于《雷公炮炙論》，宋代《開寶本草》首次將枳殼從枳實(shí)條目下分離出來(lái)，獨(dú)立作為一種藥物記載。2015年版的《中國(guó)藥典》記載了其來(lái)源，為蕓香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí)[1]，主要分布于我國(guó)長(zhǎng)江流域及南方各省區(qū)。傳統(tǒng)中醫(yī)中枳殼主要用于治療胸脅氣滯、脹滿疼痛、食積不化、痰飲內(nèi)停、臟器下垂[2]?！吨兴幣谥茖W(xué)》認(rèn)為枳殼生品較峻烈，長(zhǎng)于破氣化痰，麩炒可以緩和其烈性，從而達(dá)到消積化痞的目的[3]。研究表明，枳殼的化學(xué)成分主要由黃酮類化合物、揮發(fā)油、香豆素類及少量的生物堿類組成[4,5]，具有抗氧化[6]、抗腫瘤[7]、抗高血壓[8]和抗休克[9]等活性。黃酮苷類是枳殼藥理作用研究的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，主要為柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和橙皮素等[10]，被證實(shí)有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗癌、抑制毛細(xì)血管脆性等多種功效[11-14]。

目前中國(guó)藥典以柚皮苷和新橙皮苷含量作為其質(zhì)量控制指標(biāo)，2015年版中國(guó)藥典規(guī)定枳殼含柚皮苷(C27H32O14)不得少于4.0%，新橙皮苷(C28H34O15)不得少于3.0%。據(jù)文獻(xiàn)[15]報(bào)道，不同產(chǎn)地的枳殼藥材的柚皮苷和新橙皮苷含量存在差異，其中傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)如江西、四川、湖南等地的枳殼藥材質(zhì)量相對(duì)較佳。

本研究通過HPLC指紋圖譜結(jié)合聚類分析、主成分分析對(duì)不同產(chǎn)地枳殼質(zhì)量進(jìn)行較為系統(tǒng)的評(píng)價(jià)，以期為枳殼質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀(包含E2695四元梯度泵，2489UV檢測(cè)器，Empower3軟件)；中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012版(國(guó)家藥典委員會(huì))；SB25-12DT型超聲波清洗儀(新芝公司)；CP114分析天平(美國(guó)奧豪斯)。

1.2 材料

蕓香柚皮苷對(duì)照品(批號(hào)MUST-16030408)，購(gòu)于成都曼斯特生物科技有限公司；柚皮苷對(duì)照品(批號(hào)10552-201301)、橙皮苷對(duì)照品(批號(hào)10089-201203)、新橙皮苷對(duì)照品(批號(hào)10477-201203)，購(gòu)于南昌貝塔生物科技有限公司；橙皮素對(duì)照品(批號(hào)B20184)、川陳皮素對(duì)照品(批號(hào)B20199)，購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司。

水為超純水，乙腈和甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

枳殼藥材經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室劉塔斯教授鑒定，詳細(xì)信息見表1。

表1 枳殼樣本信息

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對(duì)照品溶液制備

分別精密稱取蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素、川陳皮素對(duì)照品適量，置于容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為0.022 7 mg/mL、0.005 9 mg/mL、0.016 7 mg/mL、0.008 0 mg/mL、0.000 8 mg/mL、0.000 6 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，避光保存。

2.2 供試品溶液制備

取枳殼樣本打粉過篩，精密稱定0.2 g，置于具塞離心管中，精密加入70%甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，取濾液，即得供試品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱：Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm,5μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～6 min，20%～23%乙腈；6～13 min，23%～35%乙腈；13～16 min，35%～55%乙腈；16～26 min，55%～70%乙腈；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：283 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記算蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素、川陳皮素的峰面積的RSD分別為1.23%、0.32%、0.13%、0.18%、0.48%、0.38%(n=6)，表明儀器精密度良好?；旌蠈?duì)照品的HPLC色譜見圖1。

圖1 混合對(duì)照品HPLC色譜

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(S33)，分別于制備后0、4、8、12、24 h后進(jìn)樣10 μL，測(cè)得蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素、川陳皮素的峰面積的RSD分別為0.72%、0.58%、1.12%、0.53%、0.70%、0.65%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品(S33)適量，平行制備6份供試品溶液并依法測(cè)定。結(jié)果蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素、川陳皮素的峰面積的RSD值分別為1.19%、1.17%、1.19%、1.39%、0.95%、1.26%(n=6)。表明本試驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.4.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已測(cè)定的樣品(S33)6份，每份0.1 g，分別加入一定量的對(duì)照品，按照供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，進(jìn)行回收率測(cè)定。結(jié)果表明，蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素、川陳皮素的加樣回收率的RSD值分別為1.32%、1.89%、1.50%、1.77%、2.41%、2.28%。表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.4.5 枳殼中6種黃酮類成分含量測(cè)定 以混合對(duì)照品中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素、川陳皮素的濃度和HPLC峰面積為標(biāo)準(zhǔn)，分別計(jì)算37批次不同產(chǎn)地枳殼藥材中該6種黃酮類成分所占的百分含量。結(jié)果見表2。

表2 枳殼中六種黃酮類成分的百分含量 (%)

從表2可以看出，不同產(chǎn)地的枳殼藥材，其化學(xué)成分存在差異，甚至同一地區(qū)的枳殼藥材質(zhì)量也并不統(tǒng)一，蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素、川陳皮素含量均不高的枳殼樣本有S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S10、S11、S12、S18、S20、S21、S26、S27。

此外，通過對(duì)比S1和S8、S2和S7、S3和S6、S30和S34、S31和S35、S32和S36可以發(fā)現(xiàn)，枳殼生品經(jīng)麩炒炮制后，黃酮類成分含量有所下降，與文獻(xiàn)[16-17]報(bào)道的枳殼麩炒前后色譜行為一致，但成分含量普遍減少的結(jié)論相符合。S30～S33反映的是同一種植地的枳殼藥材于不同采收期的樣本。從表2可以看出，4個(gè)不同采摘期的枳殼藥材中柚皮苷和新橙皮苷的含量均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，其中7月5日采摘的枳殼生品(S31)的黃酮類成分含量最高，隨著采收時(shí)間的推后，其含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。該結(jié)論與李正紅等[18]研究結(jié)果一致。據(jù)報(bào)道，枳殼從7月初至8月初均可采集，隨著枳殼成熟度的增加，總黃酮含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但柚皮苷和新橙皮苷含量則呈上升趨勢(shì)[19]。隨著枳殼成熟度的進(jìn)一步增加，果瓤迅速增大，果皮變薄，柚皮苷和新橙皮苷含量下降[20]。因此，枳殼于大暑前后采摘整體品質(zhì)最佳。

2.5 指紋圖譜的建立與分析

2.5.1 枳殼指紋圖譜的建立 按照“2.2”項(xiàng)下方法制備37批次枳殼藥材供試品，按照“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄色譜圖。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)以37批枳殼色譜圖為基礎(chǔ)建立標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜(見圖2)，確定19個(gè)共有峰，生成對(duì)照?qǐng)D譜(見圖3)，與對(duì)照品溶液比對(duì)，鑒定3號(hào)峰為蕓香柚皮苷、4號(hào)峰為柚皮苷、5號(hào)峰為橙皮苷、7號(hào)峰為新橙皮苷、15號(hào)峰為橙皮素、19號(hào)峰為川陳皮素。

圖2 37批次枳殼藥材指紋圖譜

2.5.2 枳殼藥材相似度評(píng)價(jià) 以中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件生成的枳殼對(duì)照指紋圖譜為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算相似度(結(jié)果見表3)。結(jié)果表明，37批枳殼藥材中，除了S1、S5、S8和S18，其余樣本的相似度均大于0.90。

表3 相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

2.5.3 主成分分析 主成分分析也稱主分量分析，是利用降維的思想，將多個(gè)變量(指標(biāo))化為少數(shù)幾個(gè)互不相關(guān)的綜合變量(指標(biāo))的統(tǒng)計(jì)方法。主成分分析在求出主成分后，選擇前P個(gè)主成分，構(gòu)造綜合評(píng)價(jià)函數(shù)可對(duì)樣品進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。主成分個(gè)數(shù)的選取按以下原則來(lái)確定：①以累積貢獻(xiàn)率來(lái)確定，當(dāng)前P個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到某一特定的值時(shí)(一般以>70%為宜)，則保留前P個(gè)主成分；②以特征值大小來(lái)確定，即若主成分的特征值≥1，則保留該主成分[21]。采用SPSS 17.0軟件對(duì)37個(gè)不同產(chǎn)地枳殼藥材的19個(gè)共有峰(變量)峰面積原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，以主成分的特征值及貢獻(xiàn)率為依據(jù)，進(jìn)行主成分分析，解釋的總方差結(jié)果見表4，碎石圖見圖5。

表4 解釋的總方差

圖5 碎石圖

結(jié)合表4和圖5可知，枳殼藥材的主成分分析中前5個(gè)主成分的特征值均大于1，且碎石圖的連線較陡峭，累積方差貢獻(xiàn)率為86.435%，可以反映整體指標(biāo)86.435%的信息，因此提取前5個(gè)主成分進(jìn)行分析較為合適。

成分載荷矩陣反映各主成分與原始指標(biāo)之間相互關(guān)系的密切程度與作用的方向[21]，載荷的絕對(duì)值越大，其對(duì)于主成分的影響就越大。本研究的相關(guān)系數(shù)矩陣結(jié)果見表5所示。

表5 成分載荷矩陣

從表5可以看出，第一主成分與原始變量峰10、峰11、峰15、峰6、峰16、峰18之間的關(guān)系最為密切(載荷絕對(duì)值>0.8)。

以第1、第2、第3主成分為變量得到的三維投影載荷圖(圖6)，在投影圖中距離原點(diǎn)較遠(yuǎn)的點(diǎn)，峰1、峰2、峰3(蕓香柚皮苷)、峰5(橙皮苷)、峰7(新橙皮苷)對(duì)區(qū)分不同產(chǎn)地的枳殼藥材起到較大作用。

圖6 載荷圖

通過計(jì)算主成分得分、綜合得分[22]，可對(duì)不同產(chǎn)地的枳殼藥材品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)。以前5個(gè)主成分貢獻(xiàn)率為權(quán)重系數(shù)，對(duì)不同產(chǎn)地的枳殼藥材進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，計(jì)算主成分得分及綜合得分，結(jié)果見表6。

表6 不同產(chǎn)地枳殼主成分得分、綜合得分及排名

由主成分排名可知，湖南沅江和江西新干產(chǎn)地的枳殼藥材質(zhì)量最佳。同一種植地而不同采收期的枳殼藥材(S30-S33)中，7月5日采摘的枳殼生品(S31)質(zhì)量最佳，與黃酮類成分的含測(cè)結(jié)果一致。

2.5.4 聚類分析 聚類分析是將樣品按照品質(zhì)特性相似度逐漸聚合在一起，最終按照類別的綜合性質(zhì)將多個(gè)品種聚合，從而完成聚類分析的過程。本研究應(yīng)用SIMCA 13.0分析軟件進(jìn)行層序聚類分析，得到分類聚類樹狀圖(圖7)。

從圖中可知，在類間距為50時(shí)，S13、S14、S15、S19、S23、S25、S28、S29聚為一類，這些樣本的黃酮含量均較高，且主成分排名位于前10，該類樣本主要為湖南沅江和江西新干產(chǎn)地的枳殼藥材；六種黃酮含量均不高，且主成分排名末尾的樣本S1、S2、S3、S4、S5、S6、S8、S12、S18、S20、S26、S27聚為了一類，該類樣本主要為湖南、江西、四川不明具體產(chǎn)地信息的網(wǎng)購(gòu)及非種植地銷售枳殼藥材；剩余的樣本S7、S9、S10、S11、S16、S17、S21、S22、S24、S30、S31、S32、S33、S34、S35、S36、S37聚為一類，該類樣本主要為湖南、四川產(chǎn)地的枳殼藥材。聚類分析的結(jié)果與主成分分析以及含測(cè)結(jié)果均吻合，與相似度評(píng)價(jià)結(jié)果大體一致。

圖7 37批次枳殼樣品的HCA樹狀圖

3 討論

本研究通過聚類分析結(jié)合主成分分析，以及主要黃酮類成分含量測(cè)定分析，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的枳殼藥材的化學(xué)成分存在差異，且同一地區(qū)的枳殼藥材質(zhì)量也并不統(tǒng)一，說(shuō)明影響藥材質(zhì)量的因素不僅為產(chǎn)地，采收時(shí)間、加工等環(huán)節(jié)也影響著藥材的質(zhì)量。